CN114609269A - 一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法，其清金益气组合物的检测方法为：S1异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵：a混合对照品溶液制备；b供试品溶液制备；c阴性组合物溶液制备；d确定色谱条件；e分别将上述各溶液注入液相色谱仪，测定，即得；S2戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷：a混合对照品溶液的制备；b供试品溶液制备；c阴性组合物溶液制备；d确定色谱条件；e分别将上述各溶液注入液相色谱仪，测定，即得。本发明的一种清金益气组合物的检测方法对清金益气组合物进行质量控制，保证患者用药安全、可靠、有效。

Description

一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法

技术领域

本发明中药组合物检测技术领域，尤其涉及一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法。

背景技术

清金益气组合物由人参，麦冬和五味子等16味中药组成，主要功效为益气养阴，健脾和中，清热祛湿，适用于新型冠状病毒引起的肺炎康复期，见心烦意懈，干咳少痰，咽喉不利，动后气短，倦怠乏力，胸腹满闷，纳呆便软，四肢沉重，舌淡少津等症状。

清金益气组合物组成药味众多，其成分复杂，单一活性成分的定量分析难以表征复方整体质量水平，不能全面控制其质量。目前，中药指纹图谱是权威的中药复方质量控制的重要方法，可以全面反映中药复方所包含化学成分的信息。但目前，尚未有用多成分含量测定和指纹图谱对清金益气组合物进行质量控制方法的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种清金益气组合物的检测方法。

本发明的第二个目的是提供一种清金益气组合物的指纹图谱构建方法。

本发明技术方案概述如下：

一种清金益气组合物的检测方法，包括以下步骤：

S1异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵：

a混合对照品溶液制备：精密称取对照品异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵，加甲醇配制成每1mL含有异阿魏酸10.28μg、橙皮苷75.04μg、甘草酸铵41.92μg的溶液；

b清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

c清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺升麻的阴性组合物、清金益气缺陈皮的阴性组合物、清金益气缺甘草的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

d测定清金益气组合物中异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量的色谱条件：色谱柱为Agilent 5TC-C18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm-甘草酸铵、280nm-异阿魏酸、橙皮苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；

e分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d所述色谱条件，测定，即得。

S2戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷：

a′混合对照品溶液的制备：精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷，加甲醇配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷10.00μg、马鞭草苷10.14μg、黄芩苷65.7μg、汉黄芩苷20.04μg的溶液；

b′清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

c′清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺马鞭草的阴性组合物、清金益气缺黄芩的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

d′色谱条件：色谱柱为Agilent 5TC-C-18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％-12％B；10-15min，12％B；15-55min，12％-40％B；55-60min，40％-90％B；检测波长为237nm-戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、280nm-黄芩苷、汉黄芩苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温:30℃；

e′分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c′获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d′所述色谱条件，测定，即得。

一种清金益气组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

a″混合对照品溶液的制备：分别精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵，加甲醇，配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷13μg、马鞭草苷13.5μg、黄芩苷150.5μg、汉黄芩苷30μg、异阿魏酸7.4μg、橙皮苷73μg和甘草酸铵15.6μg的溶液；

b″供试品溶液的制备：取至少7批次的清金益气组合物，各0.50g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25mL体积浓度为70％的甲醇水溶液，超声，取上清液，得到至少7个供试品溶液；

c″测定：分别精密量取混合对照品溶液和至少7批次供试品溶液各10μL，分别使用高效液相色谱进行检测，色谱柱为Agilent 5TC-C18，250×4.6mm，5μm；采用梯度洗脱，流动相为A和B组成，A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，所述梯度洗脱程序如下：0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；得到混合对照品图谱和相应的至少7批次清金益气组合物指纹图谱；

d″将至少7批次清金益气组合物指纹图谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据分析，以第1批次的清金益气组合物指纹图谱为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和Mark峰匹配，生成清金益气组合物对照指纹图谱，共标定13个共有峰，与混合对照品图谱比对，指认其中7个色谱峰，分别是1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵；以对照指纹图谱为基准，计算至少7批次的清金益气组合物指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。

本发明的优点：

本发明的一种清金益气组合物的检测方法及其指纹图谱构建方法对清金益气组合物进行质量控制，保证患者用药安全、可靠、有效。

附图说明

图1甘草酸铵含量测定色谱图。

图2异阿魏酸、橙皮苷含量测定色谱图。

图3戟叶马鞭草苷、马鞭草苷含量测定色谱图。

图4黄芩苷、汉黄芩苷含量测定色谱图。

图5为清金益气组合物指纹图谱的波长考察图。

图6清金益气组合物指纹图谱的流动相考察图。

图7清金益气组合物指纹图谱用的供试品溶液的浓度考察图。

图8清金益气组合物指纹图谱用的供试品溶液的溶剂考察图。

图9清金益气组合物对照指纹图谱。

图10清金益气组合物指纹图谱(9批)。

图11清金益气组合物中7个成分的混合对照品图谱(其中，1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵)

图12为第1批次清金益气组合物指纹图谱(其中，1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵)

具体实施方案

清金益气组合物的制备：

称取如下饮片：人参3g，麦冬3g，五味子(捣)3g，茯苓8g，清半夏8g，玄参6g，麸炒苍术5g，陈皮6g，甘草3g，柴胡6g，升麻3g，薏苡仁10g，黄芩10g，马鞭草10g，芦根15g，淡竹叶2g，置于2L的圆底烧瓶中，第一次加8倍量水，浸泡30min后，回流提取60min，过滤，滤渣第二次加6倍量水，回流提取40min，将两次提取液合并，用三层纱布过滤，滤液减压浓缩后，冷冻干燥，即得清金益气组合物。

将不同批次饮片利用SPSS 26.0随机组合9批清金益气组合物的原料，按上述方法制备清金益气组合物，依次命名为1-9批次清金益气组合物。

清金益气的阴性组合物的制备：依据上述清金益气组合物的制备方法，扣除相应的药材，分别制作清金益气缺升麻的阴性组合物、清金益气缺陈皮的阴性组合物、清金益气缺甘草的阴性组合物、清金益气缺马鞭草的阴性组合物、清金益气缺黄芩的阴性组合物。

在本发明中采用的仪器设备为Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；XP205型十万分之一电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；FA124型万分之一天平，天津亿诺科学仪器有限公司；KQ-400B型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器有限公司；N-12108旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；FDU-2100冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；Milli-Q academic超纯水系统，美国Miliipore公司。

本发明选用的对照品和试剂：

戟叶马鞭草苷(批号：20101701)、

马鞭草苷(批号：AF21052409)均购自成都埃法生物科技有限公司；

黄芩苷(批号：110715-201318)、

汉黄芩苷(批号：112002-201702)、

异阿魏酸(批号：111698-201103)、

橙皮苷(批号：110721-202019)、

甘草酸铵(批号：110731-202021)均购自中国食品药品检定研究院；

甲醇、乙腈，色谱纯，美国Fisher公司；水为超纯水。

人参，麦冬，五味子(捣)，茯苓，清半夏，玄参，麸炒苍术，陈皮，甘草，柴胡，升麻，薏苡仁，黄芩，马鞭草，芦根，淡竹叶均购于其道地产地或主产区，经天津中医药大学中医药研究院刘志东研究员对多个批次药材进行鉴定，均符合《中国药典》2020版项下规定：实施例1

S1异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵的检测：

a混合对照品溶液制备：精密称取对照品异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵，加甲醇配制成每1mL含有异阿魏酸10.28μg、橙皮苷75.04μg和甘草酸铵41.92μg的溶液；

b清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

c清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺升麻的阴性组合物、清金益气缺陈皮的阴性组合物、清金益气缺甘草的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

d测定清金益气组合物中异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量的色谱条件：色谱柱为Agilent 5TC-C18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm-甘草酸铵、280nm-异阿魏酸、橙皮苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；

e分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d所述色谱条件，测定，即得；见图1和图2。

方法学验证

①专属性：在异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵出峰位置，缺升麻、陈皮、甘草的阴性组合物溶液色谱无相应的色谱峰，表明此方法专属性良好。

②线性方程：取异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含异阿魏酸14μg、橙皮苷163μg、甘草酸铵128μg的溶液为母液备用。吸取异阿魏酸母液，加甲醇稀释成浓度分别为0.66、0.88、1.31、1.75、3.50、7.00、14.00μg/mL的异阿魏酸标准溶液；吸取橙皮苷母液，加甲醇稀释成浓度分别为5.09、7.64、10.19、15.28、20.38、40.75、81.50、163.00μg/mL的橙皮苷标准溶液；吸取甘草酸铵母液，加甲醇稀释成浓度分别为24.00、32.00、48.00、64.00、96.00、128.00μg/mL的甘草酸铵标准溶液。按照实施例1d项中色谱条件进样，试验结果以峰面积为横坐标为X，浓度为纵坐标Y，拟合标准曲线，线性结果如表1：

表1线性试验

③精密度：取混合对照品溶液，采用实施例1d项中色谱条件进样，连续进样6次，计算峰面积RSD值，结果见表2。异阿魏酸6针进样峰面积RSD值为0.56％；橙皮苷6针进样峰面积RSD值为0.33％；甘草酸铵6针进样峰面积RSD值为0.49％。表明仪器精密度良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表2精密度试验

④稳定性：取清金益气组合物供试品溶液，采用本实施例d项中色谱条件，分别于0、3、6、9、12、24、36、48h进样，结果见表3。异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的稳定性RSD值分别为2.54％、0.99％、1.96％，稳定性良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表3稳定性试验

⑤重复性：取第1批清金益气组合物(对哪一批次不进行限定)，6份，每份0.50g，分别置于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，采用本实施例d项中色谱条件进样，结果见表4。分析供试品中异阿魏酸含量的RSD值为1.13％、橙皮苷含量的RSD值为0.49％、甘草酸铵含量RSD值为0.81％。重复性良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表4重复性试验

⑥加样回收率：精密称取已知成分含量的清金益气组合物(样品)，精密加入等量的对照品于50mL的锥形瓶中(各加入量见表5-7)，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，采用本实施例d项中色谱条件进样，结果见表5，表6和表7。异阿魏酸平均回收率为93.75％；橙皮苷平均回收率为102.23％；甘草酸铵平均回收率为103.90％。符合2020版中国药典相关规定。

表5异阿魏酸加样回收率试验数据

表6橙皮苷加样回收率试验数据

表7甘草酸铵加样回收率试验数据

方法学验证结果显示，阴性组合物对测定结果无干扰。样品在48h的稳定性良好，异阿魏酸RSD值2.54％，橙皮苷RSD值0.99％，甘草酸铵RSD值1.96％；重复性测定结果：异阿魏酸RSD值1.13％，橙皮苷RSD值0.49％，甘草酸铵RSD值0.81％；平均加样回收率测定结果为异阿魏酸RSD值93.75％，橙皮苷RSD值102.23％，甘草酸铵RSD值103.90％，均符合中国药典标准，表明该方法准确度高，重复性好。

实施例2

S2戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷和汉黄芩苷的检测：

a′混合对照品溶液的制备：精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷，加甲醇配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷10.00μg、马鞭草苷10.14μg、黄芩苷65.7μg、汉黄芩苷20.04μg的溶液；

b′清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

c′清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺马鞭草的阴性组合物、清金益气缺黄芩的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

d′色谱条件：色谱柱为Agilent 5TC-C-18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％-12％B；10-15min，12％B；15-55min，12％-40％B；55-60min，40％-90％B；检测波长为237nm-戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、280nm-黄芩苷、汉黄芩苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温:30℃；

e′分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c′获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d′所述色谱条件，测定，即得。见图3和图4。

方法学验证

①专属性：在戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷出峰位置，缺马鞭草、黄芩的阴性组合物溶液色谱无相应的色谱峰，表明此方法专属性良好。

②线性方程:取戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含戟叶马鞭草苷33μg、马鞭草苷32μg、黄芩苷604μg、汉黄芩苷120μg的溶液为母液备用；吸取戟叶马鞭草苷母液，加甲醇稀释成浓度分别为1.03、1.55、2.06、3.09、4.13、8.25、16.50、33.00μg/mL的戟叶马鞭草苷标准溶液；吸取马鞭草苷母液，加甲醇稀释成浓度分别为1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、8.00、16.00、32.00μg/mL的马鞭草苷标准溶液；吸取黄芩苷母液，加甲醇稀释成浓度分别为18.88、28.31、37.75、56.63、75.50、151.00、302.00、604.00μg/mL的黄芩苷标准溶液；吸取汉黄芩苷母液，加甲醇稀释成浓度分别为3.75、5.63、7.50、11.25、15.00、30.00、60.00、120.00μg/mL的汉黄芩苷标准溶液。按照本实施例d′项中色谱条件进样，试验结果以峰面积为横坐标为X，浓度为纵坐标Y，拟合标准曲线，线性结果如表8：

表8线性试验

③精密度：取混合对照品溶液，采用本实施例d′项中色谱条件进样，连续进样6次，计算峰面积RSD值。戟叶马鞭草苷6针进样峰面积RSD值为1.12％；马鞭草苷6针进样峰面积RSD值为0.75％；黄芩苷6针进样峰面积RSD值为0.24％；汉黄芩苷6针进样峰面积RSD值为0.26％。结果见表9。表明仪器精密度良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表9精密度试验

④稳定性：取清金益气组合物供试品溶液，采用本实施例d′项中色谱条件分别于0、3、6、9、12、24、36、48h进样。戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷的稳定性RSD值分别为0.53％、0.59％、0.38％、0.41％，试验结果见表10。稳定性良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表10稳定性试验

⑤重复性：取第1批清金益气组合物(对哪一批次不进行限定)，6份，每份0.50g，分别置于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm微孔滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，采用本实施例d′项中色谱条件进样，结果见表11。分析供试品中戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷的重复性RSD值分别为1.67％、1.07％、0.39％、0.43％重复性良好，符合2020版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表11重复性试验

⑥加样回收率：精密称取已知成分含量的清金益气组合物(样品)，精密加入等量的对照品于50mL的锥形瓶中(各加入量见表12-15)，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，采用本实施例d′项中色谱条件进样，结果见表12-15。戟叶马鞭草苷平均加样回收率为97.00％，马鞭草苷平均加样回收率为99.51％，黄芩苷平均加样回收率为100.76％，汉黄芩苷平均加样回收率为103.08％。符合2020版中国药典相关规定。

表12戟叶马鞭草苷加样回收率试验数据

表13马鞭草苷加样回收率试验数据

表14黄芩苷加样回收率试验数据

表15汉黄芩苷加样回收率试验数据

方法学验证结果显示，阴性组合物对测定结果无干扰。样品在48h的稳定性良好，四个指标RSD值分别为：0.53％、0.59％、0.38％、0.41％；重复性测定结果四个指标RSD值分别为1.67％、1.07％、0.39％、0.43％；平均加样回收率测定结果为戟叶马鞭草苷97.00％，马鞭草苷99.51％，黄芩苷100.76％，汉黄芩苷103.08％；均符合中国药典标准，表明该方法准确度高，重复性好。

实施例3

一种清金益气组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

a″混合对照品溶液的制备：分别精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵，加甲醇，配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷13μg、马鞭草苷13.5μg、黄芩苷150.5μg、汉黄芩苷30μg、异阿魏酸7.4μg、橙皮苷73μg和甘草酸铵15.6μg的溶液；

b″供试品溶液的制备：取9批次的清金益气组合物，各0.50g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25mL体积浓度为70％的甲醇水溶液，于400W超声20min，取上清液，得到9批次供试品溶液；(也可以使用7、8、10及以上的批次)

c″测定：分别精密量取混合对照品溶液和9批次供试品溶液各10μL，分别使用高效液相色谱进行检测，色谱柱为Agilent 5TC-C18，250×4.6mm，5μm；采用梯度洗脱，流动相为A和B组成，A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，所述梯度洗脱程序如下：0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；得到混合对照品图谱和相应的9批次清金益气组合物指纹图谱；

d″将9批次清金益气组合物指纹图谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行数据分析，以第1批次的清金益气组合物指纹图谱为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和Mark峰匹配，生成清金益气组合物对照指纹图谱(见图9)，9批次清金益气组合物指纹图谱(见图10)，共标定13个共有峰，与混合对照品图谱比对，指认其中7个色谱峰，分别是1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵，混合对照品图谱(见图11)，供试品溶液中其中第1批次(见图12)；以对照指纹图谱为基准，计算9批次的清金益气组合物指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。

9批次的清金益气组合物指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.999、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999、1.000、0.999，均在0.99以上，相似度良好，表明所建立的清金益气组合物指纹图谱可以反映其指纹特征。详见表16。

表16 9批清金益气组合物相似度结果

本实验首次建立了清金益气组合物HPLC指纹图谱。本方法高效简便，具有良好的重复性，为清金益气组合物药效物质基础及全面质量控制提供了较好的参考依据。

清金益气组合物指纹图谱方法学

①精密度试验

取第1批清金益气组合物供试品溶液(对哪一批次不进行限定)，按实施例3步骤c″，连续进样6次，记录HPLC图，以汉黄芩苷(12号峰)为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及其RSD，所得结果见表17。

表17精密度考察结果

试验结果表明：各共有峰的相对保留时间的RSD≤1.0％，仪器精密度良好。

②重复性试验

取第1批次的清金益气组合物6份(对哪一批次不进行限定)，各0.50g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25mL体积浓度为70％的甲醇水溶液，于400W超声20min，取上清液，得到6份供试品溶液；

按实施例3步骤c″，记录HPLC图，以汉黄芩苷(12号峰)为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及其RSD，所得结果见表18。

表18重复性考察结果

试验结果表明：指纹图谱检测方法重复性良好。

③稳定性试验

按照指纹图谱稳定性试验规定方法操作，取第1批清金益气组合物供试品溶液(对哪一批次不进行限定)，按实施例3步骤c″项下色谱条件，分别于0、3、6、9、12、15、24、36、48h时间点进样，记录HPLC图，以汉黄芩苷(12号峰)为参照峰，计算各色谱峰的计算相对保留时间、相对峰面积及其RSD，所得结果见表19。

表19稳定性考察结果

试验结果表明：供试品溶液在48h稳定性良好。

清金益气组合物指纹图谱实验条件的优化：

(1)检测波长的选择

根据药典药材含量指标测定波长主要有237nm(戟叶马鞭草苷)、237nm(马鞭草苷)、280nm(黄芩苷)、280nm(汉黄芩苷)、316nm(异阿魏酸)、283nm(橙皮苷)、237nm(甘草酸按)，因此对同一份样品，采用多波长检测手段对三个波长进行考察，以色谱峰数、分离度等指标来评价不同波长的指纹图谱，所得结果见图5。

由色谱图可以看出，清金益气组合物中所含大部分成分均在237nm下有较强吸收，戟叶马鞭草苷和马鞭草两个成分于280nm和316nm下均无吸收或吸收较弱，综合考虑选择237nm作为指纹图谱研究的波长。

(2)流动相的选择

由于清金益气组合物采用水提取，浸出成分往往极性较大，且成分多为生物碱类、苷类，极性亦较大。结合HPLC采用的常用流动相组成，分别采用乙腈-纯水系统、乙腈-0.1％甲酸水系统、乙腈-0.1％磷酸水系统为流动相进行考察。流动相考察结果见图6。

乙腈-纯水系统、乙腈-0.1％甲酸水系统、乙腈-0.1％磷酸水系统三种不同水相色谱图比对图表明：水相为纯水的色谱图均存在基线不平的现象，水相为0.1％甲酸水系统，存在严重拖尾现象，因此选择乙腈-0.1％磷酸水系统为流动相。

(3)供试品溶液的制备方法

取清金益气组合物，分别按照以下方式制备供试品溶液：

①不同浓度的考察：分别精密量取0.25g、0.50g、0.75g、2.5g清金益气组合物于50mL锥形瓶中，加入25mL体积浓度70％甲醇水溶液，400W下超声20min，取上清液进样。浓度考察结果见图7。

②不同溶剂的考察：精密称取0.50g方干膏粉于50mL锥形瓶中，分别加入25mL纯水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇、50％乙醇、100％乙醇、50％乙腈、100％乙腈，400W下超声20min，取上清液进样。溶剂结果见图8。

试验结果表明：在0.01g/mL的清金益气组合物复溶浓度时，峰较少，部分指标成分未被检测；在0.02g/mL的清金益气组合物复溶浓度时，峰数目适中，指标成分峰分离度较好，基线平稳；浓度为0.03g/mL和0.1g/mL时，色谱峰较多，影响到指标成分的分离。因此，浓度采用0.02g/mL。

考察不同溶剂时发现，溶剂为纯水、甲醇、体积浓度50％甲醇水溶液、乙醇、体积浓度50％乙醇水溶液、乙腈，部分指标成分未被检测；体积浓度70％甲醇水溶液复溶清金益气组合物时，色谱峰较多，指标成分峰分离度较好，基线平稳。

确定供试品溶液制备方法如下：取清金益气组合物0.50g，于50mL锥形瓶中，加入25mL体积浓度70％的甲醇水溶液，于400W超声20min，取上清液，即得。

本申请是以9批次的清金益气组合物为例，实验证明，还可以选用7、8、10批次，甚至是10以上的批次的清金益气组合物，

用本发明的方法还可以对含有清金益气组合物的制剂，如片剂、胶囊剂、口服液、丸剂、颗粒剂，等等，利用指纹图谱对清金益气组合物及其制剂进行质量控制。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种清金益气组合物的检测方法，其特征是包括以下步骤：

S1异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵：

a混合对照品溶液制备：精密称取对照品异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵，加甲醇配制成每1mL含有异阿魏酸10.28μg、橙皮苷75.04μg、甘草酸铵41.92μg的溶液；

b清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

c清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺升麻的阴性组合物、清金益气缺陈皮的阴性组合物、清金益气缺甘草的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，即得；

d测定清金益气组合物中异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵的含量的色谱条件：色谱柱为Agilent 5 TC-C18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm-甘草酸铵、280nm-异阿魏酸、橙皮苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；

e分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d所述色谱条件，测定，即得；

S2戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷：

a′混合对照品溶液的制备：精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷，加甲醇配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷10.00μg、马鞭草苷10.14μg、黄芩苷65.7μg、汉黄芩苷20.04μg的溶液；

b′清金益气组合物供试品溶液制备：取清金益气组合物0.50g，于50mL的锥形瓶中，精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

c′清金益气的阴性组合物溶液制备：取清金益气缺马鞭草的阴性组合物、清金益气缺黄芩的阴性组合物，各0.50g，于50mL的锥形瓶中，分别精密加入25mL体积浓度为70％甲醇水溶液，超声20min溶解，放冷后补足失重，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，精密吸取滤液5mL置25mL容量瓶中，加体积浓度为70％甲醇水溶液，定容，即得；

d′色谱条件：色谱柱为Agilent 5 TC-C-18，250×4.6mm，5μm；流动相A相：体积浓度0.1％磷酸水溶液，流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序为0-10min，5％-12％B；10-15min，12％B；15-55min，12％-40％B；55-60min，40％-90％B；检测波长为237nm-戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、280nm-黄芩苷、汉黄芩苷；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温:30℃；

e′分别精密吸取混合对照品溶液、清金益气组合物供试品溶液、步骤c′获得的清金益气的阴性组合物溶液，注入液相色谱仪，按步骤d′所述色谱条件，测定，即得。

2.一种清金益气组合物的指纹图谱构建方法，其特征是包括以下步骤：

a″混合对照品溶液的制备：分别精密称取对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、异阿魏酸、橙皮苷和甘草酸铵，加甲醇，配制成每1mL含有戟叶马鞭草苷13μg、马鞭草苷13.5μg、黄芩苷150.5μg、汉黄芩苷30μg、异阿魏酸7.4μg、橙皮苷73μg和甘草酸铵15.6μg的溶液；

b″供试品溶液的制备：取至少7批次的清金益气组合物，各0.50g，分别置于具塞锥形瓶中，加入25mL体积浓度为70％的甲醇水溶液，超声，取上清液，得到至少7个供试品溶液；

c″测定：分别精密量取混合对照品溶液和至少7批次供试品溶液各10μL，分别使用高效液相色谱进行检测，色谱柱为Agilent 5 TC-C18，250×4.6mm，5μm；采用梯度洗脱，流动相为A和B组成，A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，所述梯度洗脱程序如下：0-10min，5％B；10-25min，5％-10％B；25-35min，10％-12％B；35-50min，12％-14％B；50-70min，14％-15％B；70-75min，15％-16％B；75-80min，16％-21％B；80-100min，21％-23％B；100-125min，23％-24％B；125-130min，24％-35％B；130-140min，35％-39％B；140-148min，39％B；148-155min，39％-50％B；155-165min，50％-90％B；检测波长为237nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；得到混合对照品图谱和相应的至少7批次清金益气组合物指纹图谱；

d″将至少7批次清金益气组合物指纹图谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据分析，以第1批次的清金益气组合物指纹图谱为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和Mark峰匹配，生成清金益气组合物对照指纹图谱，共标定13个共有峰，与混合对照品图谱比对，指认其中7个色谱峰，分别是1号峰戟叶马鞭草苷、2号峰马鞭草苷、3号峰异阿魏酸、7号峰橙皮苷、8号峰黄芩苷、12号峰汉黄芩苷、13号峰甘草酸铵；以对照指纹图谱为基准，计算至少7批次的清金益气组合物指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。

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