CN115184492A - 清金益气颗粒指纹图谱建立方法及其成分含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，实现清金益气颗粒指纹图谱的建立，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于清金益气颗粒的质量控制，也为进一步研究清金益气颗粒的化学成分和质量标准提供依据。本申请还提供一种清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，及其在质量控制中的用途。本申请进一步提供一种清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，采用与所述清金益气颗粒指纹图谱建立方法中相同的色谱条件，实现清金益气颗粒中至少13种化学成分含量的测定。

Description

清金益气颗粒指纹图谱建立方法及其成分含量测定方法
技术领域
本申请涉及中药分析技术领域，特别是涉及清金益气颗粒指纹图谱建立方法及其成分含量测定方法。
背景技术
新冠肺炎病毒转阴或其他肺部感染疾病治愈后，由于病人经过高热、发炎的过程，普遍具有阴阳俱损，气、阴俱虚且余热未清病症，故需对患者的机体损伤和免疫系统恢复进行干预。清金益气颗粒是针对新冠肺炎恢复期患者余热未清、气阴两虚征象显著的特点而研制，组方由人参、麦冬、五味子、茯苓、清半夏、玄参、麸炒苍术、陈皮、甘草、柴胡、升麻、薏苡仁、黄芩、马鞭草、芦根、淡竹叶16味中药组成，共奏益气养阴、健脾和中、清热祛湿之效，促进患者机体损伤恢复和免疫系统调节，从而促进完全康复。该方也适用于其他肺部感染性疾病患者康复期使用。
清金益气颗粒由多种中药配伍而成，成分复杂，单一活性成分的检测难以表现中药复方整体药效，不能全面控制其质量。中药指纹图谱能全面反映中药复方所包含的化学成分信息，是目前国内外公认的中药质量控制的重要方法，因此需要一种清金益气颗粒指纹图谱的建立方法，以用于全面、准确地对清金益气颗粒进行质量控制。
发明内容
本申请的目的在于提供一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法及其成分含量测定方法，能够得到清金益气颗粒的指纹图谱，并能够测定清金益气颗粒中至少13种化学成分的含量，可用于清金益气颗粒的质量控制。具体技术方案如下：
本申请的第一方面提供一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法，包括：
(1)取质量为M1的清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到清金益气颗粒的色谱图；
其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
(3)将所述清金益气颗粒的色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的指纹图谱。
本申请的第二方面提供一种清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，其中，所述方法包括：
取R批清金益气颗粒，根据本申请第一方面所述的建立方法，分别得到R批清金益气颗粒的指纹图谱；将所述R批清金益气颗粒的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的对照指纹图谱；其中，R≥10。
本申请的第三方面提供根据本申请第二方面的建立方法得到的清金益气颗粒的对照指纹图谱。
本申请的第四方面提供一种清金益气颗粒质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测清金益气颗粒，根据本申请第一方面所述的建立方法，得到待测清金益气颗粒的色谱图；
b.将步骤a得到的色谱图，和根据本申请第三方面所述的对照指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测清金益气颗粒的质量合格。
本申请的第五方面提供一种清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，其中，采用超高效液相色谱测定清金益气颗粒中化学成分的含量，所述化学成分包括：戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸；所述方法包括：
Z1.建立各化学成分的标准曲线：
以体积分数为80-100％的甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，戟叶马鞭草苷浓度为0.68-220μg/mL，马鞭草苷浓度为0.4-120μg/mL，异阿魏酸浓度为0.2-60μg/mL，甘草苷浓度为0.48-140μg/mL，野黄芩苷浓度为0.24-70μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为0.2-60μg/mL，橙皮苷浓度为0.37-280μg/mL，黄芩苷浓度为0.06-1800μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为0.12-220μg/mL，汉黄芩苷浓度为0.18-280μg/mL，黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，汉黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，甘草酸浓度为0.36-100μg/mL；
在相同的色谱条件下，将各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
Z2.获得待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积：
取质量为M1的待测清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
在与步骤Z1相同的色谱条件下，将所述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，得到待测清金益气颗粒的色谱图，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
Z3.确定待测清金益气颗粒中各化学成分的含量：
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V1/M1分别计算出待测清金益气颗粒中各化学成分的含量。
本申请提供的一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法，采用超高效液相色谱法(UHPLC)，通过合理选择色谱条件，实现清金益气颗粒指纹图谱的建立，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于清金益气颗粒的质量控制，也为进一步研究清金益气颗粒的化学成分和质量标准提供依据。本申请还提供一种清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，及其在质量控制中的用途。本申请进一步提供一种清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，采用与所述清金益气颗粒指纹图谱建立方法中相同的色谱条件，实现清金益气颗粒中至少13种化学成分含量的测定。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为实施例1-10中编号S1-S10的清金益气颗粒的指纹图谱和实施例12中清金益气颗粒的对照指纹图谱R的叠加谱图；其中各序号对应的化学成分中，已知的化学成分为：1.马鞭草苷，3.橙皮苷，4.黄芩苷，7.千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，8.汉黄芩苷，9.黄芩素。
图2为实施例12中清金益气颗粒的对照指纹图谱R；其中各序号对应的化学成分中，已知的化学成分为：1.马鞭草苷，3.橙皮苷，4.黄芩苷，7.千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，8.汉黄芩苷，9.黄芩素。
图3为实施例13中第4个混合对照品溶液的色谱图；其中，各序号对应的化学成分为：1.戟叶马鞭草苷，2.马鞭草苷，3.异阿魏酸，4.甘草苷，5.野黄芩苷，6.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，7.橙皮苷，8.黄芩苷，9.千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，10.汉黄芩苷，11.黄芩素，12.汉黄芩素，13.甘草酸。
图4为实施例13中编号S1的清金益气颗粒的供试品溶液的色谱图；其中，各序号对应的化学成分为：1.戟叶马鞭草苷，2.马鞭草苷，3.异阿魏酸，4.甘草苷，5.野黄芩苷，6.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，7.橙皮苷，8.黄芩苷，9.千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，10.汉黄芩苷，11.黄芩素，12.汉黄芩素，13.甘草酸。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的第一方面提供一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法，包括：
(1)取质量为M1的清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到清金益气颗粒的色谱图；
其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
(3)将所述清金益气颗粒的色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的指纹图谱。
本申请中，所述体积分数为60-80％的甲醇是指体积分数为60-80％的甲醇水溶液。
当采用本申请供试品溶液的制备方法，结合本申请的超高效液相色谱法的色谱条件，有利于在较短的分析时间内获得较多的特征色谱峰，能够全面地从化学成分的角度建立清金益气颗粒的指纹图谱，从而能够快速、准确、全面、可信地建立清金益气颗粒的指纹图谱，可用于清金益气颗粒的质量控制。
在本申请第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，所述提取为超声提取，提取时间为20-50min，提取功率为150-200W，提取频率为30-50kHz。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述清金益气颗粒的制备方法包括：
取质量为M2的清金益气方饮片，以体积为V2的水为溶剂进行提取，过滤，浓缩后干燥得到浸膏粉，加入辅料混匀，制粒，即得；其中，M2:V2＝1g:(5-10)mL；所述浸膏粉与辅料的质量比为(1-4):1；
所述清金益气方饮片以重量份计，包括：人参2-4份、麦冬5-7份、五味子2-4份、茯苓7-9份、清半夏7-9份、玄参5-7份、麸炒苍术4-6份、陈皮5-7份、甘草2-4份、柴胡5-7份、升麻2-4份、薏苡仁8-12份、黄芩8-12份、马鞭草8-12份、芦根13-17份、淡竹叶1-3份；
所述辅料包括乳糖和甘露醇，所述乳糖和甘露醇的质量比为(1-3):1。
在本申请第一方面的一些实施方式中，在所述清金益气颗粒的制备方法中，所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，提取时间为30-80min，提取温度为80-100℃。
发明人在研究中发现，采用本申请的梯度洗脱，能够使清金益气颗粒中各化学成分获得更好的分离效果，优选地，在本申请第一方面的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相。
本申请的第二方面提供一种清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，其中，所述方法包括：
取R批清金益气颗粒，根据本申请第一方面所述的建立方法，分别得到R批清金益气颗粒的指纹图谱；将所述R批清金益气颗粒的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的对照指纹图谱；其中，R≥10。
本申请对所述中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析时的参数设置不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，对于参数中的时间窗宽度，本领域通常默认为0.1min；将所述R批清金益气颗粒的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，可按照均值法或者中位数法得到清金益气颗粒的对照指纹图谱。
本申请第二方面提供的清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，通过对得到的多批次清金益气颗粒的指纹图谱进行分析，能够更准确地建立清金益气颗粒的对照指纹图谱，从而能够更准确、可信地对清金益气颗粒的质量进行评价。
本申请的第三方面提供根据本申请第二方面的建立方法得到的清金益气颗粒的对照指纹图谱。
在本申请第三方面的一些实施方式中，所述对照指纹图谱包括9个特征色谱峰，保留时间依次为：7.91±0.21min、12.6±0.46min、15.2±0.24min、18.4±0.2min、21.1±0.18min、22.8±0.15min、23.3±0.15min、24.8±0.13min、28.4±0.12min。
本申请中，所述“特征色谱峰”，是指R批清金益气颗粒的色谱图中均存在的保留时间相同、单一色谱峰的峰面积占总色谱峰面积的0.5％以上、分离度良好的色谱峰，即各清金益气颗粒的色谱图中所具有的共有峰。
本申请的第四方面提供一种清金益气颗粒质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测清金益气颗粒，根据本申请第一方面所述的建立方法，得到待测清金益气颗粒的色谱图；
b.将步骤a得到的色谱图，和根据本申请第三方面所述的对照指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测清金益气颗粒的质量合格。
具体的，本申请可以通过以下方法进行质量控制，采用本申请的方法获得清金益气颗粒的指纹图谱或对照指纹图谱，对未知质量的清金益气颗粒，按本申请的方法制备其供试品溶液，并按本申请的色谱条件检测供试品溶液，得到未知质量的清金益气颗粒的色谱图，根据如表1所示的9个特征色谱峰的保留时间，确定清金益气颗粒的9个特征色谱峰并获得其峰面积，将未知质量清金益气颗粒的色谱图，与清金益气颗粒的指纹图谱或清金益气颗粒的对照指纹图谱进行相似度评价，得到相似度≥0.90，从而判定清金益气颗粒的质量合格。
表1特征色谱峰的保留时间
Figure BDA0003730213850000071
本申请所述“相似度”，是指特征色谱峰的峰面积的相似度，即特征色谱峰的峰面积的一致程度，以特征色谱峰的峰面积比值表示。所述“相似度评价”，是指以峰面积为指标，指标的相似度≥0.90，即特征色谱峰的峰面积比值≥0.90，从而判定药材的质量合格。本申请对相似度评价的方法不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价。
本申请的第五方面提供一种清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，其中，采用超高效液相色谱测定清金益气颗粒中化学成分的含量，所述化学成分包括：戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸；所述方法包括：
Z1.建立各化学成分的标准曲线：
以体积分数为80-100％的甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，戟叶马鞭草苷浓度为0.68-220μg/mL，马鞭草苷浓度为0.4-120μg/mL，异阿魏酸浓度为0.2-60μg/mL，甘草苷浓度为0.48-140μg/mL，野黄芩苷浓度为0.24-70μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为0.2-60μg/mL，橙皮苷浓度为0.37-280μg/mL，黄芩苷浓度为0.06-1800μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为0.12-220μg/mL，汉黄芩苷浓度为0.18-280μg/mL，黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，汉黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，甘草酸浓度为0.36-100μg/mL；
在相同的色谱条件下，将各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
Z2.获得待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积：
取质量为M1的待测清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
在与步骤Z1相同的色谱条件下，将所述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，得到待测清金益气颗粒的色谱图，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
Z3.确定待测清金益气颗粒中各化学成分的含量：
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V1/M1分别计算出待测清金益气颗粒中各化学成分的含量。
本申请第五方面提供的清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，能够实现清金益气颗粒中至少13种化学成分含量的测定。
在本申请第五方面的一些实施方式中，所述混合对照品溶液中，戟叶马鞭草苷浓度为0.72-180μg/mL，马鞭草苷浓度为0.4-100μg/mL，异阿魏酸浓度为0.2-50μg/mL，甘草苷浓度为0.48-120μg/mL，野黄芩苷浓度为0.24-60μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为0.2-50μg/mL，橙皮苷浓度为1-250μg/mL，黄芩苷浓度为6-1500μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为0.8-200μg/mL，汉黄芩苷浓度为1-250μg/mL，黄芩素浓度为0.08-20μg/mL，汉黄芩素浓度为0.08-20μg/mL，甘草酸浓度为0.36-90μg/mL。
本申请对混合对照品溶液的配制方式没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以先配制混合对照品储备液，其中各成分的浓度大于等于所述混合对照品溶液中各化学成分的浓度，然后通过稀释获得所述混合对照品溶液。
本申请中，所用于建立标准曲线的混合对照品溶液可包括所述混合对照品储备液；本申请对所述混合对照品储备液的配制没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，示例性地，可通过优先单独配制各化学成分的储备液，再分别取各化学成分的储备液，配制所述混合对照品储备液。
在本申请第五方面的一些实施方式中，步骤Z2中，所述提取为超声提取，提取时间为20-50min，提取功率为150-200W，提取频率为30-50kHz。
通过采用本申请供试品溶液的制备方法，实现获得包括13种化学成分的供试品溶液，使得清金益气颗粒中化学成分含量的检测结果更加全面、准确、可信。
在本申请第五方面的一些实施方式中，所述清金益气颗粒的制备方法包括：
取质量为M2的清金益气方饮片，以体积为V2的水为溶剂进行提取，过滤，浓缩后干燥得到浸膏粉，加入辅料混匀，制粒，即得；其中，M2:V2＝1g:(5-10)mL；所述浸膏粉与辅料的质量比为(1-4):1；
所述清金益气方饮片以重量份计，包括：人参2-4份、麦冬5-7份、五味子2-4份、茯苓7-9份、清半夏7-9份、玄参5-7份、麸炒苍术4-6份、陈皮5-7份、甘草2-4份、柴胡5-7份、升麻2-4份、薏苡仁8-12份、黄芩8-12份、马鞭草8-12份、芦根13-17份、淡竹叶1-3份；
所述辅料包括乳糖和甘露醇，所述乳糖和甘露醇的质量比为(1-3):1。
在本申请第五方面的一些实施方式中，在所述清金益气颗粒的制备方法中，所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，提取时间为30-80min，提取温度为80-100℃。
在本申请第五方面的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相。
下面对本申请所用的仪器、试剂和材料进行说明。
仪器：Waters Acquity UHPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；MSA225P-0CE-DU型十万分之一天平(德国Sartorius公司)；BP121S型万分之一天平(德国Sartorius公司)；5430R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-Q academic超纯水系统(美国Millipore公司)；ZDHW型调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；ZZ-L6DT型超声波清洗机(天津知著科技有限公司)；MIX-2500型迷你混合仪(杭州佑宁仪器有限公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)：国家药典委员会。
试剂：色谱纯甲醇、乙腈购于美国Fisher公司，甲酸购于美国Anaqua ChemicalsSupply公司，试验用水为Mill-Q超纯水。
材料：对照品戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷购于成都德思特生物技术有限公司。人参、麦冬、五味子、茯苓、清半夏、玄参、麸炒苍术、陈皮、甘草、柴胡、升麻、薏苡仁、黄芩、马鞭草、芦根、淡竹叶：购于各药材的道地产地或主产区，或由河北神威药业提供，均符合《中国药典》(2020年版)一部项下规定：人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎；麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根；五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw)Wolf的干燥菌核；清半夏为天南星科植物半夏Pineilia ternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎炮制加工而成；玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根；麸炒苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎照麸炒法(通则0213)炮制而成；陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎；柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根；升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、兴安升麻Cimicifuga dahurica(Turcz.)Maxim.或升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎；薏苡仁为禾本科植物薏米Coix lacryma-jobiL.var.majyuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根；芦根为禾本科植物芦苇Phragmites communis Trin.的新鲜或干燥根茎；淡竹叶为禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶；各批次药材的产地信息如表2所示。
表2各批次药材的产地信息
Figure BDA0003730213850000101
Figure BDA0003730213850000111
清金益气颗粒的制备：
分别取11批各药材饮片，其中各批药材中人参3g、麦冬6g、五味子3g、茯苓8g、清半夏8g、玄参6g、麸炒苍术5g、陈皮6g、甘草3g、柴胡6g、升麻3g、薏苡仁10g、黄芩10g、马鞭草10g、芦根15g、淡竹叶2g，共16味药组成，将各味药的不同批次饮片随机组合得到11批清金益气方饮片。
分别称取各批次清金益气方饮片104g，混匀，加850mL水加热100℃回流提取60min，纱布过滤；再加620mL水加热100℃回流提取40min，纱布过滤；得到11批清金益气标准煎液，滤液浓缩至相对密度为1.02-1.10(60℃)，喷雾干燥得到浸膏粉，加入乳糖和甘露醇作为辅料，其中，浸膏粉与乳糖、甘露醇的质量比为7:2:1；混匀，干压制粒，得到11批清金益气颗粒，编号依次为S1-S11，于干燥器内保存。
实施例1
取编号S1的清金益气颗粒，精密称取质量M1为200mg，置于锥形瓶中，加入体积V1为10mL的70％甲醇，称定重量，摇匀，超声提取30min，提取功率为180W，提取频率为40kHz；冷却至室温，补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，即得供试品溶液，置于4℃冰箱储存备用。
采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到编号S1的清金益气颗粒的色谱图；其中，色谱条件包括：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；保护柱：Waters C18柱(2.1mm×12.5mm，5μm)；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样体积：2μL，进样器温度：8℃，检测波长：254nm。
将编号S1的清金益气颗粒的色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，建立编号S1的清金益气颗粒的指纹图谱，如图1中的S1所示。
实施例2-11
除了分别取编号S2-S11的清金益气颗粒替换实施例1中编号S1的清金益气颗粒外，其余与实施例1相同，分别得到编号S2-S11的清金益气颗粒的指纹图谱；其中，编号S2-S10的清金益气颗粒的指纹图谱分别如图1中的S2-S10所示。
实施例12
取实施例1-11得到的编号S1-S11的清金益气颗粒的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，设定编号S11的清金益气颗粒的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1min，采用平均数法，进行多点校正和对色谱峰进行自动匹配，得到清金益气颗粒的对照指纹图谱，并计算相似度；所得清金益气颗粒的对照指纹图谱如图1和图2中的R所示。
经分析，标定9个共有特征峰，即清金益气颗粒包括9个特征色谱峰，依次编号，在得到的清金益气颗粒的对照指纹图谱中9个特征色谱峰的保留时间如表3所示，其中采用对照品比对，指认出6个色谱峰，分别为1号峰马鞭草苷、3号峰橙皮苷、4号峰黄芩苷、7号峰千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、8号峰汉黄芩苷、9号峰黄芩素；相似度评价结果见表4，可见相似度均在0.995以上，表明所建立的清金益气颗粒指纹图谱物质基准的稳定性较好，可以反映其指纹特征，各批次清金益气颗粒的指纹图谱具有较高的一致性。
表3对照指纹图谱中特征色谱峰的保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
保留时间(min) 7.75 12.3 15.3 18.5 21.1 22.8 23.3 24.8 28.4
表4相似度结果
Figure BDA0003730213850000121
Figure BDA0003730213850000131
注：重复的结果以“-”表示。
清金益气颗粒指纹图谱建立方法的方法学考察
精密度实验
取编号S11的清金益气颗粒，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件连续进样6次，记录UHPLC色谱图；将得到的各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得相似度均为1.000，表明仪器精密度良好。
稳定性实验
取编号S11的清金益气颗粒，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件，分别于0、3、6、12、24h进样检测，记录UHPLC色谱图；将得到的各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得相似度均不小于0.998，表明供试品溶液在24h内稳定。
重复性实验
取编号S11的清金益气颗粒，按实施例1的方法平行制备供试品溶液6份，分别按实施例1的色谱条件进样检测，记录UHPLC色谱图；将得到的各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得相似度均为1.000，表明该方法重复性良好。
实施例13
Z1.建立各化学成分的标准曲线：
精密称取适量各对照品，分别用甲醇溶解，得到戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸的各对照品母液，浓度均为2mg/mL；得到橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的各对照品母液，浓度均为5mg/mL；置于4℃冰箱储存备用。
取各对照品母液，用甲醇配制成混合对照品储备液，其中，戟叶马鞭草苷浓度为180μg/mL，马鞭草苷浓度为100μg/mL，异阿魏酸浓度为50.0μg/mL，甘草苷浓度为120μg/mL，野黄芩苷浓度为60.0μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为50.0μg/mL，橙皮苷浓度为250μg/mL，黄芩苷浓度为1500μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为200μg/mL，汉黄芩苷浓度为250μg/mL，黄芩素浓度为20.0μg/mL，汉黄芩素浓度为20.0μg/mL，甘草酸浓度为90.0μg/mL；将混合对照品储备液用甲醇依次稀释2、2.5、2、2.5、2、2.5、2倍，得到包含混合对照品储备液在内的8个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液。
在相同的色谱条件下，将各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；保护柱：Waters C18柱(2.1mm×12.5mm，5μm)；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样体积：2μL，进样器温度：8℃，检测波长：254nm。
以各化学成分色谱峰的峰面积(Y)为纵坐标，以各化学成分的浓度(X)为横坐标，进行回归分析，分别建立各化学成分的标准曲线，得到各化学成分的线性回归方程及相关系数r2，将第8个混合对照品溶液逐步稀释，以信噪比S/N为10:1作为其定量限(LOQ)，以S/N为3:1作为其检测限(LOD)，得到13种化学成分的标准曲线、LOQ与LOD结果见表5，结果显示13种化学成分在各自线性范围内的相关系数r2≥0.999，表明13种化学成分在其线性范围内的线性关系良好。
表5 13种化学成分的标准曲线及LOQ、LOD结果
Figure BDA0003730213850000141
Figure BDA0003730213850000151
Z2.获得待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积：
取编号S1的清金益气颗粒，精密称取质量M1为200mg，置于锥形瓶中，加入体积V1为10mL的70％甲醇，称定重量，摇匀，超声提取30min，提取功率为180W，提取频率为40kHz；冷却至室温，补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，即得供试品溶液，置于4℃冰箱储存备用。重复制备3份编号S1的清金益气颗粒的供试品溶液。
在与步骤Z1相同的色谱条件下，将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，得到清金益气颗粒的色谱图，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得编号S1的清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积；
Z3.确定待测清金益气颗粒中各化学成分的含量：
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由编号S1的清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V1/M1＝C1×10mL/200mg分别计算出编号S1的清金益气颗粒中各化学成分的含量C，结果如表6所示，其中，黄芩苷含量最高；基于1μg/mg＝1mg/g，将清金益气颗粒中各化学成分含量的单位以mg/g表示。
实施例14-23
除了分别取编号S2-S11的清金益气颗粒替换实施例13中编号S1的清金益气颗粒外，其余与实施例13相同，分别得到编号S2-S11的清金益气颗粒中各化学成分的含量，结果见表6。
表6编号S1-S11的清金益气颗粒中各化学成分的含量(平均值±标准偏差，mg/g，n＝3)
Figure BDA0003730213850000152
Figure BDA0003730213850000161
清金益气颗粒中化学成分含量测定方法的方法学考察
质控储备液的制备：
分别精密移取实施例13中的各对照品母液适量，用甲醇梯度稀释，配制成含高、中、低3个不同浓度的戟叶马鞭草苷(3.6、36、180μg/mL)、马鞭草苷(2、20、100μg/mL)异阿魏酸(1、10、50μg/mL)、甘草苷(2.4、24、120μg/mL)、野黄芩苷(1.2、12、60μg/mL)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(1、10、50μg/mL)、橙皮苷(5、50、250μg/mL)、黄芩苷(30、300、1500μg/mL)、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(4、40、200μg/mL)、汉黄芩苷(1、10、50μg/mL)、黄芩素(0.4、4、20μg/mL)、汉黄芩素(0.4、4、20μg/mL)、甘草酸(1.8、18、90μg/mL)的质控溶液，置于4℃冰箱储存备用。
专属性考察
取实施例13中的第4个混合对照品溶液，经检测得到其色谱图如图3所示；取实施例13中编号S1的清金益气颗粒的供试品溶液，经检测得到其色谱图如图4所示；根据图3和图4可以看出，在戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸的对照品的相应位置上，供试品溶液中具有相同保留时间的色谱峰出现，同时，各化学成分的分离度良好，表明该方法具有良好的专属性。
精密度试验
取配制的不同浓度的质控溶液，分别按实施例13中的色谱条件连续进样测定6次，连续测定3天，分别为日内精密度和日间精密度，分别测定得到各化学成分的浓度结果，日内精密度和日间精密度的结果均以浓度的RSD(相对标准偏差)表示，结果如表7所示；可见表7中戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸日间精密度的RSD值为1.05％-4.00％，日内精密度的RSD值为0.21％-4.99％，结果表明仪器精密度良好。
稳定性试验
取配制的不同浓度的质控溶液，分别按实施例13中的色谱条件分别于0、3、6、12、24h进样测定，得到各化学成分的实际测得浓度结果，计算各化学成分实际测得浓度与理论浓度的比值，并计算比值的RSD值，结果如表7所示；可见表7中戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸稳定性的RSD值为0.26％-4.38％，结果表明质控溶液在进样器放置24h稳定性良好。
表7 13种化学成分的日内精密度、日间精密度、稳定性(n＝6)
Figure BDA0003730213850000171
Figure BDA0003730213850000181
重复性试验
取编号S11的清金益气颗粒，按实施例13的方法平行制备供试品溶液6份，分别按实施例13的色谱条件进样测定，测得戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸的含量，并计算各化学成分含量的RSD值分别为2.18％、0.73％、1.27％、2.47％、2.50％、3.11％、1.89％、1.40％、0.77％、1.23％、2.39％、3.04％、1.96％，结果表明该方法重复性良好。
加样回收率
精密称取已知13种化学成分含量的编号S11的清金益气颗粒6份，分别精密加入含有13个化学成分含量50％水平的混合对照品溶液，将各加标样品室温下静置，待溶剂挥干，按实施例13中的方法平行制备加标供试品溶液，按实施例13中的色谱条件进样测定；同时，将同等质量的编号S11的清金益气颗粒及加入的50％水平的混合对照品溶液分别平行操作6份并进样测定；计算各化学成分的含量；其中，各化学成分的原有量、加入量及测得量结果分别如表8所示。按公式：加样回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量×100％，计算得到各化学成分的加样回收率，并计算平均回收率及RSD值，结果如表8所示，测得戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸的平均回收率为92.3％-106％，RSD值为0.56％-2.64％，结果表明该方法准确度良好。
表8 13种化学成分的加样回收率
化学成分 原有量(μg) 加入量(μg) 测得量(μg) 平均回收率(％) RSD(％)
戟叶马鞭草苷 12.2 13.2 25.1 97.7 1.60
马鞭草苷 10.1 9.69 19.5 97.3 1.13
异阿魏酸 3.00 2.80 5.78 100 1.61
甘草苷 11.3 11.7 22.7 97.5 1.81
野黄芩苷 4.77 4.84 9.43 96.2 0.56
芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷 1.95 1.95 3.75 92.3 2.26
橙皮苷 57.3 60.3 119 102 1.74
黄芩苷 341 341 671 96.7 2.64
千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 34.9 35.1 69.4 98.4 0.99
汉黄芩苷 73.5 72.5 150 106 0.81
黄芩素 8.21 8.08 16.0 96.4 1.00
汉黄芩素 2.99 2.98 6.04 102 1.97
甘草酸 7.00 7.12 14.3 102 1.04
综上，本申请提供的清金益气颗粒指纹图谱建立方法及其成分含量测定方法，采用相同的色谱条件，实现清金益气颗粒指纹图谱的建立，并能够测定清金益气颗粒中至少13种化学成分的含量，方法准确，重复性及专属性良好，具有简便高效、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，能够全面、准确、可信地对清金益气颗粒的质量进行评价，为清金益气颗粒药效物质基础及全面质量控制提供了较好的参考依据。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (15)

1.一种清金益气颗粒指纹图谱建立方法，包括：
(1)取质量为M1的清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到清金益气颗粒的色谱图；
其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
(3)将所述清金益气颗粒的色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其中，步骤(1)中，所述提取为超声提取，提取时间为20-50min，提取功率为150-200W，提取频率为30-50kHz。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其中，所述清金益气颗粒的制备方法包括：
取质量为M2的清金益气方饮片，以体积为V2的水为溶剂进行提取，过滤，浓缩后干燥得到浸膏粉，加入辅料混匀，制粒，即得；其中，M2:V2＝1g:(5-10)mL；所述浸膏粉与辅料的质量比为(1-4):1；
所述清金益气方饮片以重量份计，包括：人参2-4份、麦冬5-7份、五味子2-4份、茯苓7-9份、清半夏7-9份、玄参5-7份、麸炒苍术4-6份、陈皮5-7份、甘草2-4份、柴胡5-7份、升麻2-4份、薏苡仁8-12份、黄芩8-12份、马鞭草8-12份、芦根13-17份、淡竹叶1-3份；
所述辅料包括乳糖和甘露醇，所述乳糖和甘露醇的质量比为(1-3):1。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其中，在所述清金益气颗粒的制备方法中，所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，提取时间为30-80min，提取温度为80-100℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的建立方法，其中，所述梯度洗脱具体为：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相。
6.一种清金益气颗粒对照指纹图谱建立方法，其中，所述方法包括：
取R批清金益气颗粒，根据权利要求1-5中任一项所述的建立方法，分别得到R批清金益气颗粒的指纹图谱；将所述R批清金益气颗粒的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到清金益气颗粒的对照指纹图谱；其中，R≥10。
7.根据权利要求6所述的建立方法得到的清金益气颗粒的对照指纹图谱。
8.根据权利要求7所述的对照指纹图谱，其中，所述对照指纹图谱包括9个特征色谱峰，保留时间依次为：7.91±0.21min、12.6±0.46min、15.2±0.24min、18.4±0.2min、21.1±0.18min、22.8±0.15min、23.3±0.15min、24.8±0.13min、28.4±0.12min。
9.一种清金益气颗粒质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测清金益气颗粒，根据权利要求1-5中任一项所述的建立方法，得到待测清金益气颗粒的色谱图；
b.将步骤a得到的色谱图，和根据权利要求7-8中任一项所述的对照指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测清金益气颗粒的质量合格。
10.一种清金益气颗粒中化学成分含量测定方法，其中，采用超高效液相色谱测定清金益气颗粒中化学成分的含量，所述化学成分包括：戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、异阿魏酸、甘草苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸；所述方法包括：
Z1.建立各化学成分的标准曲线：
以体积分数为80-100％的甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，戟叶马鞭草苷浓度为0.68-220μg/mL，马鞭草苷浓度为0.4-120μg/mL，异阿魏酸浓度为0.2-60μg/mL，甘草苷浓度为0.48-140μg/mL，野黄芩苷浓度为0.24-70μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为0.2-60μg/mL，橙皮苷浓度为0.37-280μg/mL，黄芩苷浓度为0.06-1800μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为0.12-220μg/mL，汉黄芩苷浓度为0.18-280μg/mL，黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，汉黄芩素浓度为0.08-25μg/mL，甘草酸浓度为0.36-100μg/mL；
在相同的色谱条件下，将各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；保护柱：十八烷基硅烷键合硅胶保护柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数60-95％A相，5-40％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：38-42℃；进样体积：1-5μL；进样器温度：4-10℃；检测波长：250-260nm；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
Z2.获得待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积：
取质量为M1的待测清金益气颗粒，以体积为V1的体积分数为60-80％的甲醇为溶剂进行提取，得到供试品溶液；其中，M1:V1＝1g:(40-60)mL；
在与步骤Z1相同的色谱条件下，将所述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，得到待测清金益气颗粒的色谱图，根据各化学成分的保留时间确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
Z3.确定待测清金益气颗粒中各化学成分的含量：
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测清金益气颗粒中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V1/M1分别计算出待测清金益气颗粒中各化学成分的含量。
11.根据权利要求10所述的测定方法，其中，所述混合对照品溶液中，戟叶马鞭草苷浓度为0.72-180μg/mL，马鞭草苷浓度为0.4-100μg/mL，异阿魏酸浓度为0.2-50μg/mL，甘草苷浓度为0.48-120μg/mL，野黄芩苷浓度为0.24-60μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为0.2-50μg/mL，橙皮苷浓度为1-250μg/mL，黄芩苷浓度为6-1500μg/mL，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度为0.8-200μg/mL，汉黄芩苷浓度为1-250μg/mL，黄芩素浓度为0.08-20μg/mL，汉黄芩素浓度为0.08-20μg/mL，甘草酸浓度为0.36-90μg/mL。
12.根据权利要求10所述的测定方法，其中，步骤Z2中，所述提取为超声提取，提取时间为20-50min，提取功率为150-200W，提取频率为30-50kHz。
13.根据权利要求10所述的测定方法，其中，所述清金益气颗粒的制备方法包括：
取质量为M2的清金益气方饮片，以体积为V2的水为溶剂进行提取，过滤，浓缩后干燥得到浸膏粉，加入辅料混匀，制粒，即得；其中，M2:V2＝1g:(5-10)mL；所述浸膏粉与辅料的质量比为(1-4):1；
所述清金益气方饮片以重量份计，包括：人参2-4份、麦冬5-7份、五味子2-4份、茯苓7-9份、清半夏7-9份、玄参5-7份、麸炒苍术4-6份、陈皮5-7份、甘草2-4份、柴胡5-7份、升麻2-4份、薏苡仁8-12份、黄芩8-12份、马鞭草8-12份、芦根13-17份、淡竹叶1-3份；
所述辅料包括乳糖和甘露醇，所述乳糖和甘露醇的质量比为(1-3):1。
14.根据权利要求13所述的测定方法，其中，在所述清金益气颗粒的制备方法中，所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，提取时间为30-80min，提取温度为80-100℃。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的测定方法，其中，所述梯度洗脱具体为：0-5min，5-10％B相；5-8min，10-15％B相；8-10min，15-16％B相；10-13min，16-17％B相；13-15min，17-18％B相；15-19min，18-20％B相；19-23min，20-24％B相；23-26min，24-25％B相；26-29min，25-28％B相；29-31min，28-38％B相；31-34min，38-39％B相；34-36min，39-40％B相；36-40min，40-40％B相；40-41min，40-5％B相；41-45min，5-5％B相。
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