CN115774074A

CN115774074A - 一种芩芎合剂的hplc检测方法

Info

Publication number: CN115774074A
Application number: CN202211685579.0A
Authority: CN
Inventors: 石韵臻; 占生龙; 杨金辉; 朱玉磊; 张恒瑞
Original assignee: Chengdu Changzhe Health Technology Co ltd; Sichuan Dudao Intelligent Medical Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Changzhe Health Technology Co ltd; Sichuan Dudao Intelligent Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明公开了一种芩芎合剂的HPLC检测方法，它包括如下步骤：a、对照品溶液的制备：取栀子苷对照品、黄芩苷对照品，加0～100％甲醇水溶液溶解，即得；b、供试品溶液的制备：取芩芎合剂，加0～50％甲醇水溶液提取，滤过，取滤液，即得；c、分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪检测。本发明通过特定的样品处理方法和色谱条件，首次建立了芩芎合剂的指纹图谱，为芩芎合剂的检测和鉴定提供了简单准确的方法，保证了芩芎合剂的质量，也为其临床应用提供了科学的依据，具有良好的应用前景。

Description

一种芩芎合剂的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种芩芎合剂的HPLC检测方法。

背景技术

芩芎合剂为临床医生治疗肝阴虚而克犯脾胃，脾胃虚而生湿热引起的口腔扁平苔藓、口腔溃疡、灼口综合征及地图舌等多种口腔粘膜病变疾病的经验方，主要成份包括黄芩、川芎、当归、栀子、生地黄、车前子、龙胆草、郁金、薤白、柴胡、党参，其具有温中补虚、和里缓急、开胃消食的作用。为方便临床使用、提高患者依从性，目前将其制成了纯中药口服液体制剂。

芩芎合剂是新开发的现代中药复方制剂。复方制剂是基于其多种化学成分发挥综合的治疗作用，具有整体性和模糊性的特点，仅以单一或几种化学成分作为指标的传统中药质量评价方法，难以达到中药方剂质量控制评价的目的，用更全面的化学成分对中药方剂进行质量控制，才能更准确可靠。但目前还没有关于芩芎合剂质量控制方法的研究，更没有关于其中活性成分的含量测定和特征图谱检测方法的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种芩芎合剂的HPLC检测方法，它包括如下步骤：

a、对照品溶液的制备：取环烯醚萜苷类和/或黄酮类对照品，加0～100％甲醇水溶液溶解，即得；

b、供试品溶液的制备：取待测样品，加0～50％甲醇水溶液溶解，即得；

c、分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪；色谱条件如下：

色谱柱：以亲水性十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02％～0.2％酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速0.5～1.5ml/min、柱温10～40℃、检测波长190～600nm，梯度洗脱程序为：

进一步地，步骤a所述对照品溶液每1ml含10～320μg环烯醚萜苷类对照品、20～700μg黄酮类对照品。

更进一步地，所述环烯醚萜苷类为栀子苷，黄酮类为黄芩苷。

进一步地，步骤b所述待测样品是黄芩、川芎、当归、栀子、生地黄、车前子、龙胆草、郁金、薤白、柴胡和党参组成的芩芎合剂的配方原料药或配方制剂。

更进一步地，所述配方制剂与0～50％甲醇水溶液的体积比为1：50；所述配方原料药与0～50％甲醇水溶液的质量体积比为1g：100ml。

进一步地，所述甲醇水溶液的浓度为25％。

进一步地，步骤c所述色谱条件中色谱柱为

GS-120-5-C18-AP，250*4.6mm,5μm，流动相A为0.1％磷酸，流速0.9～1.1ml/min，进样量2～20μL，柱温20～40℃，波长249nm～259nm。

更进一步地，所述色谱条件中流速1.0mL/min，柱温30℃，波长254nm。

进一步地，所述方法得到的待测样品指纹图谱中呈现8个特征峰，与黄芩苷对照品相对应的峰为S峰，计算其余特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间分别为：峰1：0.306～0.392、峰2：0.405～0.483、峰3：0.722～0.751、峰4：0.968～0.986、峰5，S：1.000、峰6：1.106～1.113、峰7：1.135～1.175、峰8：1.214～1.246，确定待测样品为芩芎合剂。

进一步地，所述芩芎合剂中黄芩苷和栀子苷的含量按外标法以峰面积计算。

本发明一种芩芎合剂的HPLC检测方法，通过特定的样品处理方法和色谱条件，首次建立了芩芎合剂的指纹图谱，为芩芎合剂的检测和鉴定提供了简单准确的方法，保证了芩芎合剂的质量，也为其临床应用提供了科学的依据，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1芩芎合剂的特征图谱

图2对照品图谱

图3流动相A酸为冰乙酸的供试品图谱

图4流动相A酸为甲酸的供试品图谱

图5检测波长为249nm、254nm、259nm的供试品图谱

图6溶媒水的供试品溶液图谱

图7溶媒25％甲醇的供试品溶液图谱

图8溶媒50％甲醇的供试品溶液图谱

图9稀释25倍的供试品溶液图谱

图10稀释50倍的供试品溶液图谱

图11稀释100倍的供试品溶液图谱

图12流速为0.9ml/mi的供试品溶液图谱

图13流速为1.1ml/mi的供试品溶液图谱

图14柱温为25℃的供试品溶液图谱

图15柱温为35℃的供试品溶液图谱

图16 0.05％磷酸溶液为流动相A的供试品溶液图谱

图17 0.2％磷酸溶液为流动相A的供试品溶液图谱

图18进样体积5μl的供试品溶液图谱

图19 0.1％磷酸溶液为流动相A，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样体积10μl的供试品溶液图谱

图20进样体积20μl的供试品溶液图谱

图21芩芎合剂供试品溶液图谱

具体实施方式

本发明具体实施方式中的原料、试剂和设备均为已知产品，可通过市售购买获得，其中芩芎合剂处方由黄芩9份、川芎9份、当归9份、栀子9份、龙胆草6份、郁金10份、薤白10份、柴胡9份、生地黄12份、党参12份、车前子10份组成，制备工艺为：按重量比称取饮片，混合后加入重量为药材6～10倍的水浸泡30min，煎煮30～50min，煎煮两次，趁热过滤，合并滤液，不超过80℃减压浓缩至1.12-1.14(50℃)的清膏，加入10％～20％柠檬酸溶液调节药液pH值为4.0-5.0，加入0.01％～0.02％三氯蔗糖矫味，加入0.1％～0.3％苯甲酸钠防腐，置高速离心机中离心5～10min(3000～4000r/min)，加纯化水稀释至配制量，煮沸10～20min，冷却，分装灌封，即得。

实施例1、芩芎合剂HPLC检测

(1)供试品溶液制备

精密量取芩芎合剂1～10ml，加25％甲醇水溶液稀50倍；

(2)对照品溶液的制备

称取栀子苷对照品和黄芩苷对照品，加25％甲醇水溶液溶解，制成每1ml含有10～320μg栀子苷、20～700μg黄芩苷的混合溶液；

(3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL注入液相色谱仪；色谱条件如下：

色谱柱：GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：254nm；流动相：乙腈(B)-0.1％磷酸溶液(A)，梯度洗脱程序为：

(4)芩芎合剂的指纹图谱中应呈现8个特征峰，与黄芩苷对照品相对应的峰为S峰，计算其余特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间分别为：峰1：0.306～0.392、峰2：0.405～0.483、峰3：0.722～0.751、峰4：0.968～0.986、峰5，S：1.000、峰6：1.106～1.113、峰7：1.135～1.175、峰8：1.214～1.246；

芩芎合剂中黄芩苷和栀子苷的含量按外标法以峰面积计算。实施例2芩芎合剂的配方原料药HPLC检测

(1)供试品溶液制备

精密称取芩芎合剂的配方原料药，加100倍量25％甲醇水溶液提取，提取液过滤，即得；

(2)对照品溶液的制备

(4)配方原料药的指纹图谱中应呈现8个特征峰，与黄芩苷对照品相对应的峰为S峰，计算其余特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间分别为：峰1：0.306～0.392、峰2：0.405～0.483、峰3：0.722～0.751、峰4：0.968～0.986、峰5，S：1.000、峰6：1.106～1.113、峰7：1.135～1.175、峰8：1.214～1.246；

配方原料药中黄芩苷和栀子苷的含量按外标法以峰面积计算。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1芩芎合剂HPLC方法研究

一、酸种类的选择

采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；分别以①0.1％磷酸溶液；②0.1％冰乙酸溶液；③0.1％甲酸溶液溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为254nm。

供试品溶液制备：精密量取芩芎合剂1ml，加水稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见图1、图3、图4。

从色谱图可知，采用甲酸、磷酸，基线、色谱峰形和分离度都优于冰乙酸；而从检出色谱峰个数和分离度比较，磷酸比甲酸好，故优选磷酸。

二、检测波长的选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为249nm、254nm、259nm。

测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

试验结果见图5(特征图谱249nm、254nm、259nm)。

试验结果显示，在波长249nm、254nm、259nm下，供试品特征图谱都呈现有8个特征峰。综合比较各色谱峰的峰高、分离度和检出色谱峰个数，优选波长254nm。

三、溶媒选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为254nm。

供试品溶液制备：

①精密量取芩芎合剂1ml，加水稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

②精密量取芩芎合剂1ml，加25％甲醇稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

③精密量取芩芎合剂1ml，加50％甲醇稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：精密吸取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

试验结果见图6(特征图谱-溶媒水)、图7(特征图谱-溶媒25％甲醇)、图8(特征图谱-溶媒50％甲醇)。

试验结果显示，供试品特征图谱都呈现有8个特征峰。综合考虑供试品溶液稳定性、有无沉淀和制备容易程度，优选25％甲醇溶液作为溶剂。

四、稀释倍数选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。

供试品溶液制备：

①精密量取芩芎合剂1ml，加25％甲醇稀释至25ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

③精密量取芩芎合剂1ml，加25％甲醇稀释至100ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

试验结果见图9(特征图谱-稀释25倍)、图10(特征图谱-稀释50倍)、图11(特征图谱-稀释100倍)。

试验结果显示，供试品特征图谱都呈现有8个特征峰。综合比较各色谱峰高和分离情况，优选稀释倍数为50。

五、流速的选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速分别为0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min；检测波长为254nm。

供试品溶液制备：精密量取芩芎合剂1ml，加25％甲醇稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：精密吸取上述供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

试验结果见图12、图13、图19。

试验结果显示，供试品特征图谱呈现有8个特征峰。综合比较各色谱峰分离度、保留时间、峰面积等，优化选择流速为1.0ml/min。

六、柱温选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温分别为25℃、30℃、35℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。

试验结果见图14、图15、图19。

试验结果显示，供试品特征图谱呈现有8个特征峰。综合比较各色谱峰与相邻峰的分离度，优选柱温30℃。

七、酸度选择

色谱条件与系统适应性试验：采用十八烷基键合硅胶为填充剂GS-120-5-C18-AP(250*4.6mm,5μm)色谱柱；分别以0.05％、0.1％、0.2％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。

试验结果见图16、图17、图19。

试验结果显示，供试品特征图谱呈现有8个特征峰。综合比较检出色谱峰个数和分离度，优化选择酸度为0.1％。

八、进样体积选择。

测定法：精密吸取上述供试品溶液5μl、10μl、20μl，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

试验结果见图18、图19、图20。

试验结果显示，供试品特征图谱都呈现有8个特征峰。综合比较各色谱峰峰面积大小及分离度等，优化选择进样体积为10μl。

试验例2芩芎合剂HPLC方法验证

一、方法步骤

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-酸水体系洗脱；以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，按下表进行梯度洗脱。

(2)对照品溶液的制备称取栀子苷对照品、黄芩苷对照品加25％甲醇水配制每1ml含有10～320μg栀子苷、20～700μg黄芩苷的混合溶液。

(3)供试品溶液的制备精密量取芩芎合剂1～10ml，采用25％甲醇水稀释50倍。

(4)测定法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

试验结果见图2、图21。

二、特征峰指认

通过专属性实验、耐用性考察及多批次样品统计，确认特征图谱呈现8个特征峰，以黄芩苷参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余特征峰与S峰的相对保留时间，其中1个峰与相应的参照物峰保留时间相同，黄芩苷为参照物峰(S峰)，计算特征峰1～8的相对保留时间为：0.306～0.392(峰1)、0.405～0.483(峰2)、0.722～0.751(峰3)、0.968～0.986(峰4)、1.000(峰S5)、1.106～1.113(峰6)、1.135～1.175(峰7)、1.214～1.246(峰8)；其中2号峰归属于栀子药材，4号峰归属于当归和川芎药材，5号峰为黄芩苷(S峰)，3、5、6、7、8号峰归属于黄芩药材。

三、线性与范围

通过线性与范围实验，确认栀子苷可测定的溶液浓度范围为1.7～311μg/ml，线性方程为：y＝8.5375x-15.204，R²＝0.9998；黄芩苷可测定的溶液浓度为3.3～700μg/ml，线性方程为：y＝14.56x-3.5711，R²＝0.9999。

四、方法验证

经方法学验证，该方法专属性、稳定性性、重复性等都良好。

1)、10批产品含量测定结果

采用芩芎合剂中药制剂的HPLC检测方法，对10批样品的检测。含量结果如下表1。

表1含量测定结果

2)10批产品特征图谱结果(相对保留时间)

Claims

1.一种芩芎合剂的HPLC检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：

色谱柱：以亲水性十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02％～0.2％酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流速0.5～1.5ml/min,柱温10～40℃,检测波长190～600nm,梯度洗脱程序为：

2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤a所述对照品溶液每1ml含10～320μg环烯醚萜苷类对照品、20～700μg黄酮类对照品。

3.根据权利要求1或2所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述环烯醚萜苷类为栀子苷，黄酮类为黄芩苷。

4.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤b所述待测样品是黄芩、川芎、当归、栀子、生地黄、车前子、龙胆草、郁金、薤白、柴胡和党参组成的芩芎合剂的配方原料药或配方制剂。

5.根据权利要求4所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述配方制剂与0～50％甲醇水溶液的体积比为1：50；所述配方原料药与0～50％甲醇水溶液的质量体积比为1g：100ml。

6.根据权利要求1或5所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述甲醇水溶液的浓度为25％。

7.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤c所述色谱条件中色谱柱为GS-120-5-C18-AP，250*4.6mm，5μm，流动相A为0.1％磷酸，流速0.9～1.1ml/min，进样量2～20μL，柱温20～40℃，波长249nm～259nm。

8.根据权利要求7所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱条件中流速1.0mL/min，柱温30℃，波长254nm。

9.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述方法得到的待测样品指纹图谱中呈现8个特征峰，与黄芩苷对照品相对应的峰为S峰，计算其余特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间分别为：峰1：0.306～0.392、峰2：0.405～0.483、峰3：0.722～0.751、峰4：0.968～0.986、峰5，S：1.000、峰6：1.106～1.113、峰7：1.135～1.175、峰8：1.214～1.246，确定待测样品为芩芎合剂。

10.根据权利要求9所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述芩芎合剂中黄芩苷和栀子苷的含量按外标法以峰面积计算。