CN112114075A - 羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法和质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法和质量评价方法。羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,包括:分别取所述供试品溶液和所述参照物溶液经高效液相色谱法测定得到供试品图谱和参照物图谱,以所述参照物图谱为参照将所述供试品图谱处理得到所述羌活胜湿汤指纹图谱。羌活胜湿汤质量评价方法,包括:按照构建方法得到羌活胜湿汤指纹图谱;按照构建羌活胜湿汤指纹图谱使用的色谱条件,使用高效液相色谱法获得待测样品图谱;将待测样品图谱与羌活胜湿汤指纹图谱进行相似性评价,按照相似度大小判定所述待测样品是否合格。本申请获得的羌活胜湿汤指纹图谱,可以全面有效的对羌活胜湿汤进行质量评价。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,尤其涉及一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法和质量评价方法。
背景技术
羌活胜湿汤,中医方剂名。主要包括羌活、独活、藁本、防风、甘草、蔓荆子、川芎等药材。为祛湿剂,具有祛风,胜湿,止痛之功效;主治风湿在表之痹证。临床常用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨质增生症、强直性脊柱炎等属风湿在表者。
现行的羌活胜湿汤的质量控制方法主要以含量测定、理化鉴定、薄层鉴定等为主,但是这些方法的评价结果都不能够代表羌活胜湿汤的整体质量。
有鉴于此,特提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法和质量评价方法,以解决上述问题。
为实现以上目的,本发明特采用以下技术方案:
一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,包括:
将包括第一溶剂和所述羌活胜湿汤的样品在内的物料混合,制备得到供试品溶液;
将包括第二溶剂和参照物在内的物料混合,制备得到参照物溶液;
分别取所述供试品溶液和所述参照物溶液经高效液相色谱法测定得到供试品图谱和参照物图谱,以所述参照物图谱为参照将所述供试品图谱处理得到所述羌活胜湿汤指纹图谱。
参照物溶液经高效液相色谱法测定得到的谱图,主要用于确定相关物质的峰的位置。
优选地,所述参照物包括异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、甘草苷、阿魏酸、蛇床子素和洋川芎内酯I。
优选地,所述高效液相色谱法中,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A、体积分数为0.2%的磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱;
优选地,所述高效液相色谱法中,流速为0.7-0.9mL/min,柱温为35-40℃,检测波长为270-280nm;
优选地,所述高效液相色谱法中,色谱柱的柱长为250mm。
可选地,所述高效液相色谱法中,流速可以为0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min以及0.7-0.9mL/min之间的任一值,柱温可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃以及35-40℃之间的任一值,检测波长可以为270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm以及270-280nm之间的任一值。
优选地,所述梯度洗脱的程序包括:
0-10min,所述流动相A的体积分数从5%变化为10%,所述流动相B的体积分数从95%变化为90%;
10-33min,所述流动相A的体积分数从10%变化为14%,所述流动相B的体积分数从90%变化为86%;
33-44min,所述流动相A的体积分数维持14%不变,所述流动相B的体积分数维持86%不变;
44-58min,所述流动相A的体积分数从14%变化为16%,所述流动相B的体积分数从86%变化为84%;
58-63min,所述流动相A的体积分数从16%变化为20%,所述流动相B的体积分数从84%变化为80%;
63-80min,所述流动相A的体积分数从20%变化为22%,所述流动相B的体积分数从84%变化为78%;
80-90min,所述流动相A的体积分数维持22%不变,所述流动相B的体积分数维持78%不变;
90-115min,所述流动相A的体积分数从22%变化为35%,所述流动相B的体积分数从78%变化为65%;
115-130min,所述流动相A的体积分数从35%变化为56%,所述流动相B的体积分数从65%变化为44%;
130-138min,所述流动相A的体积分数从56%变化为68%,所述流动相B的体积分数从44%变化为32%;
138-155min,所述流动相A的体积分数维持68%不变,所述流动相B的体积分数维持32%不变;
155-158min,所述流动相A的体积分数从68%变化为95%,所述流动相B的体积分数从32%变化为5%;
优选地,以流动相总体积为100%计算,所述流动相A和所述流动相B占流动相整体的比例均可在±2%范围内相应变化。
优选地,所述样品的剂型包括颗粒;
优选地,所述样品包括多个,所述供试品图谱包括使用多个所述样品分别制得的所述供试品溶液经所述高效液相色谱法测定得到的多个图谱;
优选地,所述处理包括:以所述参照物图谱为参照,将多个所述供试品图谱拟合得到所述羌活胜湿汤指纹图谱。
由于药材产地和批次的不同,其成分含量会存在差异,因此,取不同产地不同批次的药材制得的羌活胜湿汤作为样品制得供试品溶液,然后经过高效液相色谱法测定得到的多个图谱,再将多个图谱在中药色谱指纹图谱相似度评价系统中拟合得到最终的羌活胜湿汤指纹图谱,可以有效的避免后续质量评价的过程中出现偏差。
优选地,所述第一溶剂包括甲醇水溶液;
优选地,所述甲醇水溶液为体积分数为50-70%的甲醇水溶液;
优选地,所述第二溶剂包括甲醇。
可选地,所述甲醇水溶液的体积分数可以为50%、55%、60%、65%、70%以及50-70%之间的任一值。其中,最优选使用体积分数为60%的甲醇水溶液。
优选地,制备所述供试品溶液的方法具体包括:
称取所述羌活胜湿汤的样品0.2g,置具塞锥形瓶中,加入体积分数为60%的甲醇水溶液10mL,密塞,称定重量;
超声处理45分钟,每隔10分钟摇匀,取出后冷却再称定重量,用体积分数为60%的甲醇水溶液补足减失的重量;
摇匀,静置30分钟,取上清液过滤,取滤液。
优选地,制备所述参照物溶液的方法具体包括:
取参照物加甲醇溶解并稀释制成混合溶液,摇匀即可;
优选地,每毫升所述参照物溶液中含异欧前胡素3.5-4.5μg、二氢欧山芹醇当归酸酯3.0-4.0μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷3.5-4.5μg、甘草酸铵3.5-4.5μg、甘草苷3.0-4.0μg、阿魏酸3.5-4.5μg、蛇床子素3.5-4.5μg和洋川芎内酯I 0.025-0.035μg。
可选地,每毫升所述参照物溶液中,异欧前胡素的含量可以是3.5μg、4.0μg、4.5μg以及3.5-4.5μg之间的任一值,二氢欧山芹醇当归酸酯的含量可以是3.0μg、3.5μg、4.0μg以及3.0-4.0μg之间的任一值,5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量可以是3.5μg、4.0μg、4.5μg以及3.5-4.5μg之间的任一值,甘草酸铵的含量可以是3.5μg、4.0μg、4.5μg以及3.5-4.5μg之间的任一值,甘草苷的含量可以是3.0μg、3.5μg、4.0μg以及3.0-4.0μg之间的任一值,阿魏酸的含量可以是3.5μg、4.0μg、4.5μg以及3.5-4.5μg之间的任一值,蛇床子素的含量可以是3.5μg、4.0μg、4.5μg以及3.5-4.5μg之间的任一值,洋川芎内酯I的含量可以是0.025μg、0.030μg、0.035μg以及0.025-0.035μg之间的任一值。
一种羌活胜湿汤质量评价方法,包括:
按照所述的构建方法得到羌活胜湿汤指纹图谱;
按照构建所述羌活胜湿汤指纹图谱使用的色谱条件,使用所述高效液相色谱法获得待测样品的图谱;
将所述待测样品的图谱与所述羌活胜湿汤指纹图谱进行相似性评价,按照相似度大小判定所述待测样品是否合格。
优选地,所述相似度大于等于0.88时,判定所述待测样品合格。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:
本申请提供的羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,在同一色谱条件下检测供试品溶液和参照物溶液,得到供试品图谱和参照物图谱,以参照物图谱作为参照获得羌活胜湿汤指纹图谱,方便快捷,稳定性、精密性和重现性好;
本申请提供的羌活胜湿汤质量评价方法,通过判断指纹图谱的相似度判断产品质量的一致性,避免现有质量控制方法存在的单一和片面的问题,同时可由此追溯生产工艺中存在的问题,有利于产品质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为实施例1得到的羌活胜湿汤指纹图谱;
图2为羌活阴性与全方样品色谱图的比较图;
图3为独活阴性与全方样品色谱图的比较图;
图4为防风阴性与全方样品色谱图的比较图;
图5为藁本阴性与全方样品色谱图30-60min的比较图;
图6为藁本阴性与全方样品色谱图65-90min的比较图;
图7为甘草阴性与全方样品色谱图的比较图;
图8为蔓荆子阴性与全方样品色谱图的比较图;
图9为川芎阴性与全方样品色谱图的比较图;
图10为实施例1和实施例2得到的指纹图谱的对比图;
图11为实施例1和实施例3得到的指纹图谱的对比图;
图12为实施例1和实施例4得到的指纹图谱的对比图;
图13为实施例1和实施例5得到的指纹图谱的对比图;
图14为实施例1和对比例1中1号色谱柱和2号色谱柱得到的图谱的对比图;
图15为实施例1和对比例1中3号色谱柱和4号色谱柱得到的图谱的对比图。
具体实施方式
如本文所用之术语:
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1~5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1~4”、“1~3”、“1~2”、“1~2和4~5”、“1~3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中,除非另有指明,所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位,1份可表示任意的单位质量,如可以表示为1g,也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份,B组分的质量份为b份,则表示A组分的质量和B组分的质量之比a:b。或者,表示A组分的质量为aK,B组分的质量为bK(K为任意数,表示倍数因子)。不可误解的是,与质量份数不同的是,所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生,例如,A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先对实施例使用的仪器和试剂进行简述如下:
真空脱气机(Agilent 1200,G1322A),输液系统(四元泵,Agilent 1200,G1311A),自动进样模块(Agilent 1200,G1329A),柱温箱(Agilent 1260,G1316A),DAD检测器(Agilent 1260,G1315D)。
甲醇(Fisher,HPLC grade,规格:4L,A452-4);甲醇(天津市康科德科技有限公司,分析纯,规格:500ml);乙腈(Fisher,HPLC grade,规格:4L,A998-4);磷酸O-Phosphoric(Fisher,HPLC grade,规格:500mL,A260-500,Acid,85%)。
参照物异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、甘草苷、阿魏酸、蛇床子素、洋川芎内酯I均由中国食品药品检定研究院生产,规格为20mg。
中药色谱指纹图谱相似度评价系统为2004年A版。
实施例1
本实施例提供一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,包括:
参照物溶液的制备:取异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、甘草苷、阿魏酸、蛇床子素、洋川芎内酯I等对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释制成每1mL含异欧前胡素4.0μg、二氢欧山芹醇当归酸酯3.5μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷3.8μg、甘草酸铵3.7μg、甘草苷3.5μg、阿魏酸4.0μg、蛇床子素4.0μg、洋川芎内酯I0.03μg的混合溶液,摇匀,即得。
供试品溶液的制备:取羌活胜湿汤颗粒(自制)约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为60%甲醇10mL,密塞,称定重量,超声处理(功率320W,频率40kHz)45分钟,每隔10分钟摇匀,取出,放冷,再称定重量,用体积分数为60%甲醇补足减失的重量,摇匀,室温静置30分钟,取上清液过滤取滤液,即得。
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱型号:Agilent ZORBAX SB-C18,4.6×250mm,3.5μm),以乙腈为流动相A,以体积分数为0.2%的磷酸水溶液为流动相B;按下表的梯度进行洗脱;流速每分钟为0.8mL;检测波长为275nm;柱温:30℃。分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,按照下表1的洗脱程序进行洗脱测定,记录0~158分钟的色谱图,结果如图1所示。
表1洗脱梯度
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 5 | 95 |
10 | 10 | 90 |
33 | 14 | 86 |
44 | 14 | 86 |
58 | 16 | 84 |
63 | 20 | 80 |
80 | 22 | 78 |
90 | 22 | 78 |
115 | 35 | 65 |
130 | 56 | 44 |
138 | 68 | 32 |
155 | 68 | 32 |
158 | 95 | 5 |
通过参照物色谱峰比对的方式,将共有峰及参照物色谱峰进行对照,共指认出8个特征峰,峰保留时间及名称如下表2:
表2羌活胜湿汤指纹图谱特征峰的指认
以图1中13号峰为S峰,给出其余色谱峰参照时间,具体如下表3所示:
表3羌活胜湿汤物质基准指纹图谱18个峰保留时间对比
共有峰的归属
阴性干膏的制备:按照处方量分别精密称取各单味药材(n=2),加去离子水400mL,浸泡30min,先用武火(220V)煎煮至沸腾后,再用文火(175V)煎煮,煎煮至失重140g时,两层纱布趁热过滤,置于室温冷却后,记录汤剂的冷体积。精密移取50ml置于干燥至恒重的蒸发皿中,并将药液水浴挥发完全后,置于鼓风干燥箱中105℃干燥恒重,分别在4h、5h、6h、7h取出置于干燥器中冷却后称量,三次称量误差不超过0.3mg时,记录最后的蒸发皿及干膏的重量。计算单味药材的出膏率及阴性对照供试品的取样量,结果如下表4所示:
表4羌活胜湿汤专属性考察干膏取样量测定
阴性供试品的制备
取干膏适量,研磨成粉,分别按照以上阴性样品量精密称取对应取样量于三角瓶中,精密移取60%甲醇(按照体积比配制)10mL,摇匀并称重,320W、40kHz分别超声45min,每隔10min摇匀,取出室温冷却后,用体积分数为60%甲醇补足失重,摇匀,室温静置30min,取上清液,过0.22μm有机微孔滤膜,即得。分别吸取10μL进液相色谱仪。
经过阴性干膏色谱图与重复性-1样品色谱图进行对照分析,将指纹图谱得到的18个共有峰进行峰归属,归属结果如下表5:
表5指纹图谱共有峰的归属
将各组分的色谱图(各图中下方谱线)与全方色谱图进行比较,结果如图2(羌活阴性)、图3(独活阴性)、图4(防风阴性)、图5(藁本阴性30-60min)、图6(藁本阴性65-90min)、图7(甘草阴性)、图8(蔓荆子阴性)、图9(川芎阴性)所示。
实施例2
采用与实施例1相同的方法制备供试品溶液,然后使用同样的色谱柱,其他测试条件不变,仅改变流速为0.7mL/min、0.9mL/min。
如图10所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与实施例2的谱图(图10右侧由上到下依次为流速0.9mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min对应的谱图)进行比对可知:流速上下调整0.1对结果无明显影响。表明调整流速对该方法无明显影响。
实施例3
采用与实施例1相同的方法制备供试品溶液,然后使用同样的色谱柱,其他测试条件不变,仅改变柱温为35℃、40℃。
如图11所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与实施例3的谱图(图11右侧由上到下依次为柱温为40℃、30℃、35℃对应的谱图)进行比对可知:柱温的调整对结果无明显影响。表明调整柱温对该方法无明显影响。
实施例4
采用与实施例1相同的方法制备供试品溶液,然后使用同样的色谱柱,其他测试条件不变,仅改变洗脱程序。洗脱程序调整如下表6所示:
表6洗脱程序对比
如图12所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与实施例4的谱图(图12右侧由上到下依次为乙腈比例上调2%、下调2%和实施例1对应的谱图)进行比对可知:流动相比例的调整对全方指纹图谱无明显影响,50min峰分离度降低,未达到完全分离。表明微调流动相比例对该方法无明显影响。
实施例5
采用与实施例1相同的方法制备供试品溶液,然后使用同样的色谱柱,其他测试条件不变,仅改变检测波长为270nm和280nm。
如图13所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与实施例5的谱图(图13右侧由上到下依次为波长280nm、275nm、270nm对应的谱图)进行比对可知:调整波长对全方指纹图谱的整体色谱图无明显影响,但是对124min的甘草酸铵色谱峰相应值影响较大。
需要说明的是,在一个优选的实施例中,取不同产地不同批次的药材制得的羌活胜湿汤作为样品制得供试品溶液,然后经过高效液相色谱法测定得到的多个图谱,再将多个图谱在中药色谱指纹图谱相似度评价系统中拟合得到最终的羌活胜湿汤指纹图谱,可以有效的避免后续质量评价的过程中出现偏差。
对比例1
采用与实施例1相同的方法制备供试品溶液,然后使用不同的色谱柱(1号色谱柱.Waters XBridge Shield RP18 5μm 4.6×250mm Part No.186003010 LotNo.0127351191 Serial No.01273511913823;2号色谱柱.Venusil XBP C18 5μm 4.6×250mm Cat:VX952505-0 S/N:V9510525BXP028 4X;3号色谱柱.Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 Analytical 4.6×250mm 5μm S.N.USUXA15585 L.N.B15211;4号色谱柱.Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×150mm 5μmS.N.USKH106306L.N.B15222),其他测试条件不变。
如图14所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与使用1号色谱柱、2号色谱柱得到的谱图(图14右侧由上到下依次为1号色谱柱、2号色谱柱和实施例1对应的谱图)进行比对可知:
活胜湿汤指纹图谱构建方法在相同填料及柱长的不同品牌色谱柱能够基本重复出来,由于不同品牌的色谱柱柱效不同,部分色谱峰分离度也有所不同,但从整体色谱图看,色谱条件耐用性较好。
如图15所示,将实施例1中供试品溶液的谱图与使用3号色谱柱、4号色谱柱得到的谱图(图15右侧由上到下依次为4号色谱柱、3号色谱柱和实施例1对应的谱图)进行比对可知:
羌活胜湿汤指纹图谱色谱条件在相同品牌相同填料、不同柱长的色谱柱进行分析,Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×150mm 5μmS.N.USKH106306L.N.B15222色谱柱能够基本将色谱峰完整的分析,但是峰型及分离度较差;而Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5μm S.N.USUXA15585L.N.B15211色谱柱不能将色谱图完整的重复,峰的数量明显减少,故该指纹图谱色谱条件对不同柱长的色谱柱耐用性较差。
本申请提供的羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,优选使用实施例1使用的AgilentZORBAX SB-C18 4.6×250mm 3.5μm L.N.B17196 S.N.USAWX 03029色谱柱。
对本申请提供的羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法进行方法学考察,具体如下:
1.精密度
取同一试样,按照实施例1的色谱条件连续测试6次(以精密度-1至精密度-6表示),结果18个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.6%,相对峰面积的RSD均小于5%,仪器精密度良好。
测试结果见下表7:
表7羌活胜湿汤指纹图谱精密度保留时间
表8羌活胜湿汤指纹图谱精密度相对保留时间
由表8可知:结果中18个共有峰的相对保留时间的RSD(相对标准偏差)均小于0.6%,表明精密度良好。
表9羌活胜湿汤指纹图谱精密度峰面积
表10羌活胜湿汤指纹图谱精密度相对峰面积
由表10可知:结果中18个共有峰的相对峰面积的RSD均小于5%,表明精密度良好。
2.重复性
取同一批样品,按照实施例1的方法制备得到6个供试品溶液(分别以重复性-1至重复性-6表示),按照实施例1的方法得到相应的谱图,数据如下所示:
表11羌活胜湿汤指纹图谱重复性保留时间
表12羌活胜湿汤指纹图谱重复性相对保留时间
表13羌活胜湿汤指纹图谱重复性峰面积
表14羌活胜湿汤指纹图谱重复性相对峰面积
由上表12和表14分析可知,18个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.3%,相对峰面积的RSD均小于4%,重复性良好。
3.稳定性
取同一供试品溶液(重复性-1供试品),在放置0,3h,6h,9h,12h,24h,36h,48h,72h后精密吸取10μL进样分析,测定共有峰的保留时间及相对峰面积,计算得到共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值。结果如下所示:
表15羌活胜湿汤指纹图谱稳定性保留时间
峰号 | 0h | 3h | 6h | 9h | 12h | 24h | 48h | 72h |
1 | 17.785 | 17.704 | 17.773 | 17.708 | 17.795 | 17.923 | 17.96 | 17.781 |
2 | 18.569 | 18.506 | 18.542 | 18.526 | 18.608 | 18.659 | 18.748 | 18.61 |
3 | 36.142 | 36.002 | 36.026 | 36.049 | 36.247 | 36.241 | 36.417 | 36.171 |
4 | 42.772 | 42.473 | 42.553 | 42.536 | 42.849 | 42.829 | 43.035 | 42.657 |
5 | 43.616 | 43.393 | 43.444 | 43.459 | 43.706 | 43.681 | 43.911 | 43.594 |
6 | 50.065 | 49.77 | 49.819 | 49.808 | 50.223 | 50.106 | 50.459 | 50.007 |
7 | 68.15 | 68.076 | 68.091 | 68.055 | 68.225 | 68.192 | 68.206 | 68.096 |
8 | 69.274 | 69.171 | 69.196 | 69.165 | 69.383 | 69.333 | 69.405 | 69.246 |
9 | 79.009 | 78.932 | 78.876 | 78.777 | 79.189 | 79.093 | 79.179 | 79.017 |
10 | 86.423 | 86.315 | 86.267 | 86.297 | 86.678 | 86.544 | 86.698 | 86.498 |
11 | 115.932 | 115.932 | 115.909 | 115.891 | 116.01 | 116.006 | 115.968 | 115.911 |
12 | 119.514 | 119.52 | 119.504 | 119.488 | 119.588 | 119.571 | 119.554 | 119.499 |
13 | 124.233 | 124.246 | 124.227 | 124.223 | 124.247 | 124.244 | 124.233 | 124.203 |
14 | 132.514 | 132.509 | 132.502 | 132.509 | 132.544 | 132.519 | 132.543 | 132.512 |
15 | 134.341 | 134.333 | 134.325 | 134.333 | 134.369 | 134.343 | 134.366 | 134.336 |
16 | 138.738 | 138.731 | 138.718 | 138.723 | 138.771 | 138.738 | 138.756 | 138.74 |
17 | 140.753 | 140.743 | 140.726 | 140.734 | 140.773 | 140.751 | 140.769 | 140.758 |
18 | 141.335 | 141.325 | 141.308 | 141.313 | 141.353 | 141.337 | 141.347 | 141.334 |
表16羌活胜湿汤指纹图谱稳定性相对保留时间
由上表16可知,结果中18个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.6%,表明该方法稳定性良好。
表17羌活胜湿汤指纹图谱稳定性峰面积
表18羌活胜湿汤指纹图谱稳定性相对峰面积
由表18可知:结果中18个共有峰的相对峰面积的RSD均小于5%,表明该方法稳定性良好。
本申请提供的羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,对羌活胜湿汤全方7味药的指纹图谱进行分析,同时经过方法学验证,精密度试验、重复性试验、溶液稳定性试验、耐用性试验结果均符合规定,说明该色谱条件能较好的反应产品质量属性,获得羌活胜湿汤的指纹图谱。
本申请还提供一种羌活胜湿汤质量评价方法,按照所述的构建方法得到羌活胜湿汤指纹图谱;按照构建所述羌活胜湿汤指纹图谱使用的色谱条件,使用所述高效液相色谱法获得待测样品的图谱;将所述待测样品的图谱与所述羌活胜湿汤指纹图谱使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似性评价,按照相似度大小判定所述待测样品是否合格。
当相似度大于等于0.88时,可以认为产品质量合格。
该方法可以解决羌活胜湿汤这种复方制剂检测任何一种指标成分均不能反映其整体质量的问题,是中药质量控制研究的有效手段,对于全过程质量控制发挥很好的作用。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外,本领域的技术人员能够理解,尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征,但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如,在上面的权利要求书中,所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (10)
1.一种羌活胜湿汤指纹图谱的构建方法,其特征在于,包括:
将包括第一溶剂和所述羌活胜湿汤的样品在内的物料混合,制备得到供试品溶液;
将包括第二溶剂和参照物在内的物料混合,制备得到参照物溶液;
分别取所述供试品溶液和所述参照物溶液经高效液相色谱法测定得到供试品图谱和参照物图谱,以所述参照物图谱为参照将所述供试品图谱处理得到所述羌活胜湿汤指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述参照物包括异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、甘草苷、阿魏酸、蛇床子素和洋川芎内酯I。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述高效液相色谱法中,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A、体积分数为0.2%的磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱;
优选地,所述高效液相色谱法中,流速为0.7-0.9mL/min,柱温为35-40℃,检测波长为270-280nm;
优选地,所述高效液相色谱法中,色谱柱的柱长为250mm。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述梯度洗脱的程序包括:
0-10min,所述流动相A的体积分数从5%变化为10%,所述流动相B的体积分数从95%变化为90%;
10-33min,所述流动相A的体积分数从10%变化为14%,所述流动相B的体积分数从90%变化为86%;
33-44min,所述流动相A的体积分数维持14%不变,所述流动相B的体积分数维持86%不变;
44-58min,所述流动相A的体积分数从14%变化为16%,所述流动相B的体积分数从86%变化为84%;
58-63min,所述流动相A的体积分数从16%变化为20%,所述流动相B的体积分数从84%变化为80%;
63-80min,所述流动相A的体积分数从20%变化为22%,所述流动相B的体积分数从84%变化为78%;
80-90min,所述流动相A的体积分数维持22%不变,所述流动相B的体积分数维持78%不变;
90-115min,所述流动相A的体积分数从22%变化为35%,所述流动相B的体积分数从78%变化为65%;
115-130min,所述流动相A的体积分数从35%变化为56%,所述流动相B的体积分数从65%变化为44%;
130-138min,所述流动相A的体积分数从56%变化为68%,所述流动相B的体积分数从44%变化为32%;
138-155min,所述流动相A的体积分数维持68%不变,所述流动相B的体积分数维持32%不变;
155-158min,所述流动相A的体积分数从68%变化为95%,所述流动相B的体积分数从32%变化为5%;
优选地,以流动相总体积为100%计算,所述流动相A和所述流动相B占流动相整体的比例均可在±2%范围内相应变化。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述样品的剂型包括颗粒;
优选地,所述样品包括多个,所述供试品图谱包括使用多个所述样品分别制得的所述供试品溶液经所述高效液相色谱法测定得到的多个图谱;
优选地,所述处理包括:以所述参照物图谱为参照,将多个所述供试品图谱拟合得到所述羌活胜湿汤指纹图谱。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述第一溶剂包括甲醇水溶液;
优选地,所述甲醇水溶液为体积分数为50-70%的甲醇水溶液;
优选地,所述第二溶剂包括甲醇。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,制备所述供试品溶液的方法具体包括:
称取所述羌活胜湿汤的样品0.2g,置具塞锥形瓶中,加入体积分数为60%的甲醇水溶液10mL,密塞,称定重量;
超声处理45分钟,每隔10分钟摇匀,取出后冷却再称定重量,用体积分数为60%的甲醇水溶液补足减失的重量;
摇匀,静置30分钟,取上清液过滤,取滤液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法,其特征在于,制备所述参照物溶液的方法具体包括:
取参照物加甲醇溶解并稀释制成混合溶液,摇匀即可;
优选地,每毫升所述参照物溶液中含异欧前胡素3.5-4.5μg、二氢欧山芹醇当归酸酯3.0-4.0μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷3.5-4.5μg、甘草酸铵3.5-4.5μg、甘草苷3.0-4.0μg、阿魏酸3.5-4.5μg、蛇床子素3.5-4.5μg和洋川芎内酯I 0.025-0.035μg。
9.一种羌活胜湿汤质量评价方法,其特征在于,包括:
按照权利要求1-8任一项所述的构建方法得到羌活胜湿汤指纹图谱;
按照构建所述羌活胜湿汤指纹图谱使用的色谱条件,使用所述高效液相色谱法获得待测样品的图谱;
将所述待测样品的图谱与所述羌活胜湿汤指纹图谱进行相似性评价,按照相似度大小判定所述待测样品是否合格。
10.根据权利要求9所述的羌活胜湿汤质量评价方法,其特征在于,所述相似度大于等于0.88时,判定所述待测样品合格。
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