CN114216986A - 异功散hplc特征图谱的构建方法及其hplc标准指纹图谱和应用 - Google Patents

异功散hplc特征图谱的构建方法及其hplc标准指纹图谱和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用，属于药物检测技术领域，特征图谱的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤S1：供试品溶液、参照物溶液的制备；步骤S2：分别对供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱检测，获得异功散HPLC特征图谱，所述高效液相色谱检测中的检测波长为201~205nm范围内，该构建方法能够同时检出异功散中全部药材成分，通过该构建方法获得异功散HPLC标准指纹图谱，具有色谱峰分布均匀、稳定性良好等特点。

Description

异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和 应用
技术领域
本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用。
背景技术
异功散是临床常用方剂，别名五味异功散，异功散配方出自宋代钱乙的《小儿药证直诀》，由人参、茯苓、白术、陈皮和甘草各等分含量组成，功效有健脾、益气、和胃，主治脾胃虚弱，不思饮食或呕吐等症状，目前临床上还用于治疗慢性贫血病，例如慢性感染性疾病、慢性炎症性疾病、肺感染性疾病及衰老引起的贫血，非感染性疾病包括肿瘤、慢性肾病、心脑血管、心衰等症状，由此可见异功散临床应用范围较广。
中药材多为植物的干燥器官，由于复杂的自然环境等原因，造成了中药材在应用方面的复杂性，同一名称的中药材可能来自不同基源的植物，而中药材由于产地不同、采收季节和生长年限不同而存在差别，市场上一些名贵药材经常见到伪品与正品相混淆，由于各种因素的存在，最终必然会影响中医的临床疗效和中药的研究数据，进而影响其应用和进一步的加工生产。现有技术中，仅对异功散的临床应用等发面进行分析，如公布号为CN108066458的发明专利，公开异功散在治疗慢性病贫血、感染或炎症性疾病引起的脾肿大及线粒体损伤药物中的应用，并未对异功散的品质检测进行研究开发，因此有必要对异功散中药材进行特征图谱分析，建立异功散中药高效液相特征图谱，并研究出较佳的特征图谱构建方法，以符合现代中医学所要求的科学性和全面性。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用。
本发明提出一种异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤S1：供试品溶液的制备：
取异功散药品，研细，以70％甲醇提取，制备供试品溶液；
参照物溶液的制备：
取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成参照物溶液；
步骤S2：分别对供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱检测，获得异功散HPLC特征图谱，所述高效液相色谱检测中的检测波长为201nm～205nm。
进一步的，高效液相色谱检测是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以磷酸水溶液为流动相B。
进一步的，磷酸水溶液浓度为0.04wt％～0.06wt％。
进一步的，高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
梯度洗脱的洗脱条件为：
0～10min，17％→30％流动相A，83％→70％流动相B；
10～26min，30％→36％流动相A，70％→64％流动相B；
26～45min，36％→39％流动相A，64％→61％流动相B；
45～46min，39％→80％流动相A，61％→20％流动相B；
46～49min，80％流动相A，20％流动相B；
49～50min，80％→17％流动相A，20％→83％流动相B；
50～60min，17％流动相A，83％流动相B。
进一步的，步骤S1中供试品溶液是取异功散药品，研细后精密称定，加入70％甲醇，然后进行超声处理15min，放冷后用70％甲醇定容制得。
进一步的，超声处理的功率为250W、频率为40kHz。
进一步的，步骤S1中，异功散药品与供试品溶液的重量体积比为1mg：10mL；参照物溶液中橙皮苷的含量为40μg·mL-1。
本发明还提出利用上述构建方法获得的异功散的HPLC标准指纹图谱，所得HPLC标准指纹图谱包括8个特征峰，以5号峰为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.560～0.619，2号峰：0.779～0.861，3号峰：0.826～0.913，4号峰：0.874～0.966，5号峰：0.950～1.050，6号峰：1.197～1.323，7号峰：1.548～1.711，8号峰：2.935～3.244；3号峰为甘草苷，5号峰为橙皮苷，8号峰为甘草酸。
本发明还提出上述HPLC标准指纹图谱在异功散的研究/开发/生产/临床应用全过程质量评价或控制中的应用。
本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用的有益效果为：
1.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法，能够同时检出异功散中全部药材成分。
2.本发明中异功散HPLC特征图谱的构建方法检测波长为201～205nm，经过对波长范围为190～400nm范围内不同波长的检测结果比对分析可知，该波长范围内获得的特征图谱各色谱峰的响应值适中，峰信息量大，基线平稳，优于其他检测波长。
3.通过本发明的洗脱体系和流动相获得的特征图谱，各色谱峰分离度较好，且色谱峰分布较均匀；另外，若以甲醇为提取溶媒时，甘草酸等色谱峰峰型较差，以50％甲醇为溶媒时，50％甲醇过滤困难，而以70％甲醇作为提取溶媒时，各色谱峰的峰型均较好。
4.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法所获得的色谱图，各同一共有峰之间相对保留时间的相对标准偏差均小于2.0％，通过选择合适的色谱柱、流速等工艺条件，有效优化了分离条件，提高了异功散颗粒高效液相特征图谱的出峰稳定性，由此可见本发明特征图谱稳定性良好。
5.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法还具有专属性，且其精密度、重复性等均符合规定，可用于异功散颗粒特征图谱的定性鉴别。
6.利用本发明所获得的异功散的HPLC标准指纹图谱中共有特征峰的有无及特征，可以全面监控异功散药品的质量，通过特征图谱相似程度的比较，评价异功散散的优劣、考察稳定性和一致性，填补了现行质量控制方法的空白，同时还帮助监控异功散生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1中在203nm波长条件下异功散供试品溶液的特征图谱。
图2是本发明实施例2中在191nm波长条件下异功散的特征图谱。
图3是本发明实施例3中在220nm波长条件下异功散的特征图谱。
图4是本发明实施例4中在240nm波长条件下异功散的特征图谱。
图5是本发明实施例5中在260nm波长条件下异功散的特征图谱。
图6是本发明实施例6中在280nm波长条件下异功散的特征图谱。
图7是本发明实施例7中在300nm波长条件下异功散的特征图谱。
图8是本发明实施例8的异功散HPLC图谱比对图。
图9是本发明实施例9异功散与陈皮阴性样品的特征图谱比对图。
图10是本发明实施例9异功散与白术阴性样品的特征图谱比对图。
图11是本发明实施例9异功散与人参阴性样品的特征图谱比对图。
图12是本发明实施例9异功散与甘草阴性样品的特征图谱比对图。
图13是本发明实施例9异功散与茯苓阴性样品的特征图谱比对图。
图14是本发明实施例10异功散颗粒的HPLC标准指纹图谱。
图15本发明实施例11异功散与混合对照品特征图谱的比对图。
图16是本发明异功散与空白溶剂的图谱比对图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1异功散HPLC特征图谱的构建方法
本实施例采用异功散颗粒进行异功散HPLC特征图谱的构建，其中，异功散颗粒的制备方法如下：
称取人参417g、茯苓417g、麸炒白术417g、陈皮417g、炙甘草417g，加入12倍量水煎煮二次，每次2.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩(60～80℃)至相对密度为1.10～1.20(60℃)的浸膏，喷雾干燥成干浸膏粉，加入适量糊精，混匀，以30g玉米淀粉配制的5％淀粉浆为粘合剂，沸腾制粒，制成1000g颗粒。
本实施例中异功散HPLC特征图谱的构建方法，包括下列步骤：
步骤S1：供试品溶液的制备：
取上述获得的异功散颗粒药品，研细后精密称取1mg，定置于10mL量瓶中，加入70％甲醇8mL，摇匀，超声处理(功率250W，频率40kHz)15min，放冷，加入溶媒70％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取出滤液，制备为供试品溶液；
需要注意的是超声处理前，加入70％甲醇的量只是足够提取异功散中有效成分即可，不限于本实施例中8mL，其它添加量也可，如9mL。本实施例为描述清楚，仅采用了其中一种用量，应理解本发明所要求保护的构建方法中并不受本实施例中70％甲醇用量所限制。
参照物溶液的制备：
取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成橙皮苷含量为40μg·mL-1参照物溶液；
步骤S2：取供试品溶液和参照物溶液分别进样于高效液相色谱仪中测定获得色谱图，其中，高效液相色谱检测的检测条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长为203nm；
柱温为30℃；
流速1.0mL·min-1；
进样量为10μL；
流动相A乙腈，流动相B为0.05wt％磷酸水溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱条件为：
0～10min，17％→30％流动相A，83％→70％流动相B；
10～26min，30％→36％流动相A，70％→64％流动相B；
26～45min，36％→39％流动相A，64％→61％流动相B；
45～46min，39％→80％流动相A，61％→20％流动相B；
46～49min，80％流动相A，20％流动相B；
49～50min，80％→17％流动相A，20％→83％流动相B；
50～60min，17％流动相A，83％流动相B。
检测供试品溶液获得的色谱图，见图1。
因此，最终利用上述实施例1构建方法获得的异功散的HPLC特征图谱如图1所示，所得HPLC特征图谱为203nm波长条件下的HPLC特征图谱。
实施例2-7异功散HPLC特征图谱的构建方法
实施例2～7分别为异功散HPLC特征图谱的构建方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表1：
表1实施例2～9中各项工艺参数一览表
Figure BDA0003423899130000071
Figure BDA0003423899130000081
实施例2-7其它部分的工艺参数，与实施例1相同。
对上述实施例1～7的构建方法获得色谱图见图1～7，进行比对后发现，检测波长在190～400nm范围内，各色谱峰响应值不同，通过等吸收图谱可知，样品在190～300nm范围内有吸收峰；通过不同波长的比较，发现波长为203nm时，特征图谱各色谱峰的响应值适中，峰信息量大，基线平稳，因此实施例1中波长为203nm则确定为本发明异功散颗粒的最佳检测波长。
实施例8异功散HPLC特征图谱的构建方法
本实施例的异功散HPLC特征图谱的构建方法，同样按照实施例1的构建方法重新获取异功散供试品溶液的色谱图，本实施例中设置不同的提取溶媒，其他工艺条件相同，分别获得异功散HPLC特征图谱进行比对分析，如图8所示，其中提取溶媒A指代70％甲醇；B指代50％甲醇；C指代甲醇；D为空白溶液，以甲醇为提取溶媒时，甘草酸等色谱峰峰型较差，以70％甲醇和50％甲醇为溶媒时，色谱峰峰型均较好，但50％甲醇过滤困难，因此，提取溶媒优选为70％甲醇。
实施例9阴性供试品溶液的制备
分别取陈皮、白术、人参、甘草、茯苓阴性样品，精密称定各1mg，分别定置于10mL量瓶中，每个量瓶中加入70％甲醇8mL，摇匀，超声处理(功率250W，频率40kHz)15min，放冷，加入溶媒70％甲醇定容至刻度，制成五种阴性供试品溶液。
按照实施例1中异功散HPLC特征图谱的构建方法，配置异功散供试品溶液测定，所得异功散的色谱图与陈皮、白术、人参、甘草、茯苓配制的五种阴性供试品的色谱图分别进行比对，见图9～13。其中，图9为供试品溶液与陈皮阴性供试品HPLC图谱比对图(a为供试品溶液，b为陈皮阴性溶液)，图10为供试品溶液与白术阴性供试品HPLC图谱比对图(a为供试品溶液，b为白术阴性溶液)，图11为供试品溶液与人参阴性供试品HPLC图谱比对图(a为供试品溶液，b为人参阴性溶液)，图12为供试品溶液与甘草阴性供试品HPLC图谱比对图(a为供试品溶液，b为甘草阴性溶液)，图13为供试品溶液与茯苓阴性供试品HPLC图谱比对图(a为供试品溶液，b为茯苓阴性溶液)。通过对上述色谱图的结果分析可知，供试品特征图谱共有8个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰6、峰7、峰8归属甘草；峰5(橙皮苷)归属陈皮；峰4归属茯苓、陈皮共煎后新生成的色谱峰。
实施例10异功散的HPLC标准指纹图谱
采用实施例1中异功散HPLC特征图谱的构建方法，测定15批异功散颗粒剂在203nm波长条件下的指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对上述15批异功散的HPLC特征图谱进行合成，生成共有8个特征峰构成的203nm波长条件下异功散的HPLC标准指纹图谱，参见图14。其中，以5号峰橙皮苷为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.560～0.619，2号峰：0.779～0.861，3号峰：0.826～0.913，4号峰：0.874～0.966，5号峰：0.950～1.050，6号峰：1.197～1.323，7号峰：1.548～1.711，8号峰：2.935～3.244。
实施例11参照峰的确定
通过查询《中国药典》2020年版一部，处方中各药味相关的主要成分，本实施例中选择甘草苷、橙皮苷、人参皂苷Rb1、甘草酸进行峰定位研究，选取上述物质制备混合对照品，按照实施例1的构建方法进行色谱图的获取(如图15，a为供试品溶液，b为混合对照品，峰3为甘草苷，峰5为橙皮苷，峰8为甘草酸)，色谱条件与异功散完全相同，其分析结果为，3号峰为甘草苷，5号峰为橙皮苷，8号峰为甘草酸，色谱图中橙皮苷色谱峰保留时间适中，响应值较高，达到基线分离，因此选择橙皮苷峰作为对照品参照峰，并将对橙皮苷色谱峰标记为峰S，故将橙皮苷对照品作为参照物。
实验例1HPLC特征图谱方法学考察
通过上述多个实施例的分析获知，确定实施例1的异功散HPLC特征图谱的构建方法为本发明的较佳构建方法，本实验例对实施例1的构建方法进行方法学考察，主要考察该构建方法的专属性与整体性、精密度、稳定性、重现性和耐用性。
1.专属性与整体性考察
通过专属性试验考察，选取空白溶剂代替异功散按照实施例1同样的构建方法重新获取特征图谱，并再次按照实施例1的构建方法获得异功散特征图谱，将两者的图谱进行比对，如图16所示(上方浅色为异功散，下方深色为空白溶剂)，发现空白溶剂无干扰，本发明构建方法专属性良好。
2.精密度考察
取异功散颗粒药品(批号：20200713)，按照实施例1中确定的异功散HPLC特征图谱的构建方法配制供试品溶液并进行测定，连续进样6次，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对标准偏差，结果见表2。
表2精密度试验相对保留时间结果(n＝6)
Figure BDA0003423899130000111
结果表明，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1.0％，由此可见，实施例1的构建方法精密度良好，符合HPLC特征图谱的要求。
3.稳定性考察
取异功散颗粒药品(批号：20200713)，按照实施例1中确定的异功散HPLC特征图谱的构建方法配制供试品溶液并进行测定，分别在制备后放置0、2、4、8、15、24、36小时进样测定，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对标准偏差(RSD)，结果见下表。
表3稳定性试验相对保留时间结果(n＝9)
Figure BDA0003423899130000112
Figure BDA0003423899130000121
结果表明，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于2.0％，表明实施例1中的构建方法在室温条件下36h内稳定性良好。
4.重复性考察
取异功散颗粒药品(批号：20200713)，按照实施例1中确定的异功散HPLC特征图谱的构建方法配制供试品溶液并进行测定，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对标准偏差(RSD)，结果见下表。
表4重复性试验相对保留时间结果(n＝6)
Figure BDA0003423899130000122
结果表明，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1.0％，表明方法重复性良好。
5.耐用性考察
对实施例1耐用性考察主要对以下几个指标进行考察：
(1)柱温变化
按照实施例1中的构建方法，分别设置柱温为28℃、30℃或32℃不等，其它条件均相同，获得相应的异功散颗粒特征图谱，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，以及其相对标准偏差(RSD)，数据如下表：
表5耐用性-不同柱温相对保留时间
Figure BDA0003423899130000131
设置柱温为28℃、30℃或32℃不等其他条件均相同的构建方法，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，相对标准偏差(RSD)在0～2.5％之间，由此可见，柱温的改变对该构建方法影响较小，本发明的异功散HPLC特征图谱构建方法耐用性较好。
(2)流速变化
按照实施例1的构建方法，分别设置不同流速，其它条件均相同，获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，以及其相对标准偏差(RSD)，数据如下表：
表6耐用性-不同流速相对保留时间
Figure BDA0003423899130000132
Figure BDA0003423899130000141
通过上述不同流速下对各特征峰与S峰的相对保留时间进行分析可知，各特征峰与S峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)在0～2.0％之间，表明该构建方法的不同流速耐用性较好。
(3)酸浓度变化
按照实施例1的构建方法，分别设置不同浓度的磷酸水溶液，其它条件均相同，获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，以及其相对标准偏差(RSD)，数据如下表：
表7耐用性-不同酸浓度相对保留时间
Figure BDA0003423899130000142
通过设置不同浓度的磷酸水溶液获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱中，各特征峰与S峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)范围为0％～1.6％，可见磷酸水溶液浓度变化的耐用性良好，本发明异功散HPLC特征图谱构建方法耐用性较佳。
(4)检测波长变化
按照实施例1的构建方法，分别设置不同的检测波长(范围±2nm)，其它条件均相同，获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，以及其相对标准偏差(RSD)，数据如下表：
表8耐用性-不同检测波长相对保留时间
Figure BDA0003423899130000151
设置检测波长为201nm、203nm和205nm，获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱各特征峰与S峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)在0～1.8％之间，由此可见本发明的异功散HPLC特征图谱构建方法耐用性良好。
(5)色谱柱的变化
按照实施例1的构建方法，分别采用不同的色谱柱，其它条件均相同，获得相应的异功散颗粒产品的特征图谱，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，以及其相对标准偏差(RSD)，数据如下表
表9耐用性-不同色谱柱相对保留时间
Figure BDA0003423899130000161
表10色谱柱信息
Figure BDA0003423899130000162
由上表实验结果分析可知，不同色谱柱各特征峰与S峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)在0～3.5％之间，整体不难看出，该构建方法不同色谱柱耐用性好，色谱柱的变动满足系统适应性要求。
通过对上述所有检测结果的分析可知，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于3.5％，表明实施例1的构建方法耐用性良好，具有应用价值。以上研究结果显示，实施例1的方法具有专属性与整体性、精密度、稳定性、重现性和耐用性良好的特点，符合特征图谱构建方法的规定，可用于异功散颗粒特征图谱的定性鉴别。
本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用的有益效果为：
1.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法，能够同时检出异功散中全部药材成分。
2.本发明中异功散HPLC特征图谱的构建方法检测波长为201～205nm，经过对波长范围为190～400nm范围内不同波长的检测结果比对分析可知，该波长范围内获得的特征图谱各色谱峰的响应值适中，峰信息量大，基线平稳，优于其他检测波长。
3.通过本发明的洗脱体系和流动相获得的特征图谱，各色谱峰分离度较好，且色谱峰分布较均匀；另外，若以甲醇为提取溶媒时，甘草酸等色谱峰峰型较差，以50％甲醇为溶媒时，50％甲醇过滤困难，而以70％甲醇作为提取溶媒时，各色谱峰的峰型均较好。
4.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法所获得的色谱图，各同一共有峰之间相对保留时间的相对标准偏差均小于2.0％，通过选择合适的色谱柱、流速等工艺条件，有效优化了分离条件，提高了异功散颗粒高效液相特征图谱的出峰稳定性，由此可见本发明特征图谱稳定性良好。
5.本发明的异功散HPLC特征图谱的构建方法还具有专属性，且其精密度、重复性等均符合规定，可用于异功散颗粒特征图谱的定性鉴别。
6.利用本发明所获得的异功散的HPLC标准指纹图谱中共有特征峰的有无及特征，可以全面监控异功散药品的质量，通过特征图谱相似程度的比较，评价异功散散的优劣、考察稳定性和一致性，填补了现行质量控制方法的空白，同时还帮助监控异功散生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤S1：供试品溶液的制备：
取异功散药品，研细，以70％甲醇提取，制备供试品溶液；
参照物溶液的制备：
取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成参照物溶液；
步骤S2：分别对供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱检测，获得异功散HPLC特征图谱，所述高效液相色谱检测中的检测波长为201nm～205nm。
2.根据权利要求1所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以磷酸水溶液为流动相B。
3.根据权利要求2所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述磷酸水溶液浓度为0.04wt％～0.06wt％。
4.根据权利要求2所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱条件为：
0～10min，17％→30％流动相A，83％→70％流动相B；
10～26min，30％→36％流动相A，70％→64％流动相B；
26～45min，36％→39％流动相A，64％→61％流动相B；
45～46min，39％→80％流动相A，61％→20％流动相B；
46～49min，80％流动相A，20％流动相B；
49～50min，80％→17％流动相A，20％→83％流动相B；
50～60min，17％流动相A，83％流动相B。
5.根据权利要求1-4任一项所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中供试品溶液是取异功散药品，研细后精密称定，加入70％甲醇，然后进行超声处理15min，放冷后用70％甲醇定容制得。
6.根据权利要求5所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超声处理的功率为250W、频率为40kHz。
7.根据权利要求1-4任一项所述的异功散HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，异功散药品与供试品溶液的重量体积比为1mg：10mL；参照物溶液中橙皮苷的含量为40μg·mL-1。
8.利用权利要求1-7中任一项所述的构建方法获得的异功散的HPLC标准指纹图谱，其特征在于，所得HPLC标准指纹图谱包括8个特征峰，以5号峰为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.560～0.619，2号峰：0.779～0.861，3号峰：0.826～0.913，4号峰：0.874～0.966，5号峰：0.950～1.050，6号峰：1.197～1.323，7号峰：1.548～1.711，8号峰：2.935～3.244；
所述3号峰为甘草苷，5号峰为橙皮苷，8号峰为甘草酸。
9.权利要求8所述的HPLC标准指纹图谱在异功散的研究/开发/生产/临床应用全过程质量评价或控制中的应用。
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