CN109324138A - 一种如意金黄散指纹图谱建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药分析领域，具体涉及一种如意金黄散指纹图谱建立方法，本发明通过增加了如意金黄散中姜黄、厚朴、苍术、天花粉五味药材和如意金黄散的HPLC指纹图谱研究，建立HPLC指纹图谱；该方法能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，具体涉及一种如意金黄散指纹图谱建立方法。
背景技术
如意金黄散收录于2015版《中国药典》，由姜黄、大黄、黄柏、苍术、厚朴、陈皮、甘草、生天南星、白术、天花粉十味药材经过制剂而成。用于治疗热毒瘀滞肌肤所致疮疡肿痛、丹毒流注。
如意金黄散依照2015版《中国药典》，共有五个薄层鉴别鉴别和一个含量测定项目；分别对大黄、黄柏、厚朴、甘草、白芷进行薄层鉴别和姜黄的含量测定。但是该方法单一，不能全面的提供如意金黄散的质量。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种如意金黄散指纹图谱建立方法，该方法能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种如意金黄散指纹图谱建立方法，包括姜黄、厚朴、苍术、天花粉和如意金黄散的HPLC指纹图谱的建立：所述如意金黄散的HPLC指纹图谱的建立方法具体包括以下步骤：
第1步，如意金黄散对照品溶液的制备：称取绿原酸1.000mg，橙皮苷2.213mg，盐酸小檗碱4.521mg，苍术素1.262mg，芦荟大黄素1.018mg，甘草酸铵0.994mg，甘草苷1.047mg，欧前胡素1.218mg，姜黄素2.474mg，去甲氧基姜黄素1.016mg，双去甲氧基姜黄素1.017mg，和厚朴酚2.532mg，厚朴酚2.504mg，大黄酚1.052mg，甲醇溶解，得混合对照品溶液；
第2步，如意金黄散供试品溶液的制备：取本品粉末0.25g，精密称定，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放置至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立如意金黄散指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1％磷酸水溶液D；检测波长：240nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为10μL；梯度洗脱程序如下：0～15min，14％～20％C；15～27min，20％～35％C；27～32min，35％～50％C；32～55min，50％～70％C；55～60min，70％～80％C；60～62min，80％～100％C；62～75min，100％～100％C。
优选地，所述姜黄的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，姜黄对照品溶液的制备：取姜黄素对照品2.00mg，精密称定，置于20mL的容量瓶中，加甲醇使其溶解，定容至刻度，得姜黄素对照品储备液；精密量取姜黄素对照品储备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1mL含10μg的姜黄素对照品溶液，备用；
第2步，姜黄供试品溶液的制备：取姜黄粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，13000r/min离心10min，取上清液，即得；
第3步，采用高效液相色谱仪建立姜黄指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1％磷酸水溶液D；检测波长：240nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为5μL；梯度洗脱程序如下：0～5min，30％～48％C；5～18min，48％～55％C；18～23min，55％～65％C；23～35min，65％～72％C；35～40min，72％～100％C；40～50min，100％～100％C。
优选地，所述厚朴的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，厚朴对照品溶液的制备：取厚朴酚对照品2.0mg，和厚朴酚2.4mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，称量，离心，取上清液，稀释，制成含厚朴酚40.0μg/mL，和厚朴酚24.0μg/mL的单一对照品溶液；
第2步，厚朴供试品溶液的制备：取本品粉末0.2g，精密称定，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立厚朴指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1％磷酸水溶液D；流速1mL/min；检测波长：274nm；柱温40℃；进样量10μL；梯度洗脱程序如下：0～7min，15％～25％C；7～15min，25％～35％C；15～25min，35％～44％C；25～28min，44％～60％C；28～35min，60％～80％C；35～40min，80％～95％C；40～50min，95％～100％C。
优选地，所述苍术的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，苍术对照品溶液的制备：避光操作条件下，精密称取苍术素对照品2.0mg至10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度线，精密量取1mL溶液，稀释至10mL，即得苍术素20μg/mL对照品溶液；
第2步，苍术供试品溶液的制备：：避光操作条件下，取本品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立苍术指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：甲醇B-0.1％磷酸水溶液A；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长：240nm；进样量10μL；梯度洗脱程序如下：0～15min，35％～62％B；15～30min，62％～65％B；30～55min，65％～80％B；55～60min，80％～95％B；60～70min，95％～100％B；70～80min，100％B。
优选地，所述天花粉的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，天花粉供试品溶液的制备：取天花粉粉末2.0g，精密称定，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得对照品溶液；
第2步，采用高效液相色谱仪建立天花粉指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈B-0.1％磷酸水溶液A；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长：240nm；进样量10μL；梯度洗脱程序如下：0～7min，25％～70％B；7～20min，70％B；20～25min，70％～100％B；25～35min，100％B。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：本研究增加了姜黄、厚朴、苍术、天花粉和如意金黄散的HPLC指纹图谱研究，建立HPLC指纹图谱，该方法能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为姜黄对照品与样品HPLC色谱图，其中，A为姜黄素对照品溶液，B；姜黄供试品溶液；
图2为13批姜黄样品HPLC色谱图；
图3为姜黄HPLC对照指纹图谱；
图4为厚朴对照品和样品色谱图，其中，A为和厚朴酚对照品溶液，B为厚朴酚对照品溶液，C为厚朴供试品溶液；
图5为3批次厚朴指纹图谱；
图6为厚朴HPLC对照指纹图谱，其中，S为和厚朴酚；
图7为苍术对照品和样品色谱图，其中，A为苍术素对照品溶液；B为苍术供试品溶液；
图8为4批苍术样品HPLC指纹图谱；
图9为苍术HPLC对照指纹图谱，其中，S为苍术素；
图10为3批天花粉样品HPLC指纹图谱；
图11为天花粉HPLC对照指纹图谱，其中，S为参照峰；
图12为如意金黄散对照品和样品色谱图，其中，A为姜黄素对照品溶液B为如意金黄散对照品溶液；
图13为不同流动相系统考察下如意金黄散HPLC色谱图，其中，A为甲醇-0.1％磷酸水，B为乙腈-0.1％磷酸水，C为乙腈-甲醇-0.1％磷酸水；
图14为不同流动相pH下如意金黄散HPLC色谱图，其中，A为乙腈-水溶液，B为乙腈-0.1％磷酸水溶液；
图15为不同波长下如意金黄散HPLC色谱图；
图16为如意金黄散提取方法考察HPLC色谱图，其中，A为加热回流提取，B为冷浸提取，C为超声提取；
图17为超声提取60min如意金黄散HPLC色谱图，其中，A为50％甲醇提取，B为甲醇提取，C为乙醇提取；
图18为超声提取不同时间如意金黄散HPLC色谱图，其中，A为超声提取30min，B为超声提取1h；
图19为不同提取液料比如意金黄散HPLC色谱图，其中，A为甲醇10mL提取，B为甲醇20mL提取，C为甲醇50mL提取；
图20为如意金黄散精密度实验HPLC色谱图；
图21为如意金黄散稳定性实验HPLC色谱图；
图22为如意金黄散重复性实验HPLC色谱图；
图23为10批如意金黄散样品HPLC指纹图谱；
图24为10批如意金黄散对照指纹图谱比较HPLC图，其中，R为如意金黄散对照指纹图谱；
图25为20批如意金黄散样品HPLC指纹图谱；
图26为如意金黄散HPLC对照指纹图谱，其中，S为姜黄素。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明所用仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器)(美国安捷伦公司)；KQ-5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH数显恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；AT201型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；精密天平(XP6型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；FA2104分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；TG16W高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；DW调温电热器(上海平环燃烧设备工程技术有限公司)。
本发明所用试剂：乙腈(HPLC，Tedia)；甲醇(HPLC，Tedia)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸、醋酸为分析纯(南京化学试剂股份有限公司)；水为Millipore超纯水。
实施例1：姜黄指纹图谱研究
1.材料：对照品：姜黄素(中国食品药品检定研究院，批号110823-201405，含量以98.9％计)。
2对照品溶液的制备
取姜黄素对照品2.00mg，精密称定，置于20mL的容量瓶中，加适量色谱甲醇使其溶解，定容至刻度，得姜黄素对照品储备液，精密量取姜黄素对照品储备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1mL含10μg的姜黄素对照品溶液，备用；
2.2.2供试品溶液的制备
取姜黄粉末0.2g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液1mL，置20mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得姜黄供试品溶液；
2.2.3色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，保护柱：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；乙腈-4％冰醋酸水溶液(48∶52)为流动相，等度洗脱15min，柱温为35℃，检测波长为430nm。
检测结果如图1所示：A为姜黄素对照品溶液；B为姜黄供试品溶液。
2.3.1溶液的制备
对照品溶液的制备：取姜黄素对照品2.00mg，精密称定，置于20mL的容量瓶中，加色谱甲醇使其溶解，定容至刻度，得姜黄素对照品储备液；精密量取姜黄素对照品储备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1mL含10μg的姜黄素对照品溶液，备用；
供试品溶液的制备：取姜黄粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，13000r/min离心10min，取上清液，即得姜黄素供试品溶液；
2.3.2指纹图谱测定方法
色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，保护柱AgilentC18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：乙腈(C)-0.1％磷酸水溶液(D)；检测波长：240nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为5μL。梯度洗脱程序如下：0～5min，30％～48％C；5～18min，48％～55％C；18～23min，55％～65％C；23～35min，65％～72％C；35～40min，72％～100％C；40～50min，100％～100％C。
测定方法：精密吸取姜黄素对照品溶液和姜黄素供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，测定，得到各批次样品色谱图和各色谱峰峰面积。
2.3.3指纹图谱方法学考察
2.3.3.1精密度
取样品，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5μL，连续进样6次，测定HPLC色谱图，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，全谱相似度为1.000，说明仪器精密度良好。
2.3.3.2重复性
取样品，按“2.4.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，精密吸取各供试品溶液5μL，进样，测定HPLC色谱图。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，全谱相似度为1.000。说明该方法重复性良好。
2.3.3.3稳定性
取样品，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液5μL，于0、2、4、8、12、24h进样分析，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，全谱相似度为1.000。说明姜黄供试品溶液于室温下贮存24h内稳定。
2.3.4指纹图谱的建立
2.3.4.1参照峰的选择
如图2和图3所示：观察HPLC色谱图，选择峰面积相对较大，出峰时间相对较稳定的色谱峰作为参照峰；实验表明6号峰(姜黄素)在15.40min左右处出峰，时间稳定，且分离度较好，因此选择其为参照峰(S)。
由以上结果可知，无论以13批样品建立指纹图谱共有模式，各批样品与对照指纹图谱相似度均大于0.95，辐照前样品与辐照后样品间相似度也均大于0.95，因此根据13批次结果说明不同批次姜黄样品整体一致性较好。
实施例2：厚朴指纹图谱研究
厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号110729-201513，含量98.8％)、和厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号110730-201614，含量99.3％)。3批厚朴粉末，批号分别为y-1603-1、y-1702-1、y-1702-2，标记为S1、S2、S3。
2方法与结果
2.1厚朴
2.2厚朴酚与和厚朴酚含量分析
2.2.1对照品溶液的制备
取厚朴酚对照品2.0mg，和厚朴酚2.4mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，称量，离心(13000r/min，10min)，取上清液，稀释一定倍数，制成含厚朴酚40.0μg/mL，和厚朴酚24.0μg/mL的单一对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
取厚朴粉末0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称量，室温浸渍24h，滤过，精密量取续滤液5mL置25mL量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，即得。
2.2.3色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)，保护住：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(78∶22)；检测波长：294nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量4μL；等度洗脱。
2.2.4样品分析
将各样品及对照药材按“2.2”项下方法进样，每个样进样2次，测得相应峰面积并计算含量，所得色谱图见图4。
2.2.5结果分析
3批次厚朴样品厚朴酚和和厚朴酚含量总和均高于2015版《中国药典》规定(厚朴酚与和厚朴酚总量不少于1.6％)，均为合格厚朴药材。
2.3厚朴指纹图谱分析
2.3.1溶液的制备
对照品溶液的制备：同“2.2.1”项下对照品溶液的制备方法制备。
供试品溶液的制备：取本品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心(13000r/min)10min，取上清液，即得。
2.3.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；保护柱：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：乙腈(C)-0.1％磷酸水溶液(D)；流速1mL/min；柱温40℃；进样量10μL；梯度洗脱(0～7min，15％～25％C；7～15min，25％～35％C；15～25min，35％～44％C；25～28min，44％～60％C；28～35min，60％～80％C；35～40min，80％～95％C；40～50min，95％～100％C)；检测波长：274nm.
2.3.3方法学考察
2.3.3.1精密度试验
取样品S1份(批号y-1603-1)，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取同一供试品溶液，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.98，说明该仪器精密度良好。
2.3.3.2稳定性试验
取样品1份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.97，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.3.3.3重复性试验
取样品6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.99，表明该方法重复性良好。
2.3.4指纹图谱的建立
2.3.4.1参照峰选择及共有峰标定
将3批次厚朴药材按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液后按照“2.3.2”项下色谱条件进行分析，建立厚朴HPLC指纹图谱。将色谱图导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，进行共有峰的标定。如图6所示：13号峰(和厚朴酚)在33.69min处出峰，为厚朴的主要成分，峰面积相对较大，较稳定，色谱峰分离度较好，因此选择其为参照峰。
以S1作为参照谱，时间宽度为0.10，选择中位数法生成对照图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，见图5，共有18个峰为共有峰，共有峰的总面积占总峰面积90％以上，以和厚朴酚为参照峰(S)，取3批次厚朴药材辐照前后样品指纹图谱计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于3％，说明共有峰出峰时间较稳定，相对峰面积结果见表1，各共有峰相对峰面积RSD在8.66％～66.17％之间，说明不同批次厚朴样品各成分含量存在一定的差异。
表1 3批次厚朴18个共有峰的相对峰面积
2.3.4.2相似度计算
将测定获得的6份厚朴指纹图谱导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，进行色谱峰匹配，以样品S1分析得到的图谱作为参照图谱，采用中位数法(时间窗为0.1)进行多点校正，生成6份厚朴的对照指纹图谱，并计算不同样品的相似度。结果显示6份样品S1～S6与对照图谱之间的相似度分别为0.998、0.999、0.996、0.999、0.998、0.996。结果表明厚朴指纹图谱一致性基本无影响。
实施例3：苍术指纹图谱研究
1材料
3批苍术药材(批号y-1602-5、y-1701-1、y-1702-1、y-1702-2，标记为S1、S2、S3、S4)。
2方法与结果
2.1苍术
2.2苍术素含量测定
2.2.1对照品溶液的制备
精密称取苍术素对照品2.0mg至10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度线，精密量取1mL溶液，稀释至10mL，即得苍术素20μg/mL对照品溶液。(避光操作)
2.2.2供试品溶液制备
取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液(避光操作)。
2.2.3色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，保护住：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)柱，以甲醇-水(79∶21)为流动相；检测波长为340nm，柱温35℃，进样量5μL。色谱图见图7。
2.3苍术指纹图谱研究
2.3.1溶液的制备
对照品溶液的制备：同“2.2.1”项下对照品溶液的制备方法制备。
供试品溶液制备：取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，13000r/min离心15min，取上清液，即得(避光操作)。
2.3.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保护柱：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：甲醇(B)-0.1％磷酸水溶液(A)；流速1mL/min；柱温40℃；进样量10μL；梯度洗脱程序如下：0～15min，35％～62％B；15～30min，62％～65％B；30～55min，65％～80％B；55～60min，80％～95％B；60～70min，95％～100％B；70～80min，100％B)；检测波长：240nm。
2.3.3方法学考察
2.3.3.1精密度试验
取样品1份(批号y-1602-5)，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，连续进样6次，按照“2.3.2”项下色谱条件分析，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.998，说明仪器精密度良好。
2.3.3.2稳定性试验
取样品1份(批号y-1602-5)，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24h，按照“2.3.2”项下色谱条件进行分析，记录HPLC色谱图，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.998，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.3.3.3重复性试验
取样品(批号y-0721-1602-5)按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.3.2”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对六次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.95，表明方法重复性良好。
2.3.4指纹图谱建立
2.3.4.1参照峰选择与共有峰标定
将4批次苍术药材按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.2”项下色谱条件进样分析，建立苍术HPLC指纹图谱。将色谱图导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，进行共有峰的标定。11号峰(苍术素)在53.90min处出峰，为苍术的主要成分，峰面积相对较大，较稳定，色谱峰分离度较好，因此选择其为参照峰。
以S1作为参照谱，选择中位数法生成对照图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，共得到17个共有峰。取4批次苍术药材样品指纹图谱计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间RSD均小于3％，说明共有峰出峰时间较稳定，相对峰面积结果见表11，各共有峰相对峰面积RSD在17.12％～109.16％之间，说明不同批次苍术样品各成分含量存在一定的差异。共有峰占总峰面积的51％～62％，不同批次间苍术差别较大，有些色谱峰在不同批次出现缺失，因此共有峰面积占总峰面积比例也较低；建立的共有指纹图谱见图8和图9。
实施例4：天花粉指纹图谱研究
1材料
3批天花粉药材(批号y-1604-1、y-1701-6、y-1701-7，标记为S1、S2、S3)。
2方法与结果
2.1天花粉
2.2天花粉指纹图谱变化研究
2.2.1供试品溶液制备
取本品粉末约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，即得。
2.2.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保护柱：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：乙腈(B)-0.1％磷酸水溶液(A)；流速1mL/min；柱温40℃；进样量10μL；梯度洗脱(0～7min，25％～70％B；7～20min，70％B；20～25min，70％～100％B；25～35min，100％B；)；检测波长：240nm。
2.2.3方法学考察
2.2.3.1精密度试验
取样品1份(批号y-1701-6)，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，连续进样6次，按照“2.2.2”项下色谱条件分析，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均为1.000，说明仪器精密度良好。
2.2.3.2稳定性试验
取样品1份(批号y-1701-6)，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24h，按照“2.2.2”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.999，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.2.3.3重复性试验
取样品(批号y-1701-6)按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.2.2”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.99，表明方法重复性良好。
2.2.4指纹图谱建立
2.2.4.1参照峰选择与共有峰标定
将3批次天花粉药材按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液后按照“2.2.2”项下色谱条件进样分析，建立天花粉HPLC指纹图谱。将色谱图导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，进行共有峰的标定。8号峰在14.20min处出峰，为天花粉的主要成分，峰面积相对较大，较稳定，色谱峰分离度较好，因此选择其为参照峰(S)。以S1作为参照谱，选择中位数法生成对照图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，共得到16个共有峰，取3批次天花粉药材辐照前后样品指纹图谱计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间RSD均小于3％，说明共有峰出峰时间较稳定，相对峰面积结果见表2，各共有峰相对峰面积RSD在5.15％～55.19％之间，说明不同批次天花粉样品各成分含量存在一定的差异。共有峰面积占总峰面积的83％～95％。结果表明不同批次间天花粉具有一定的差异，建立的共有指纹图谱见图10和图11。
表2 3批次天花粉16个共有峰的相对峰面积
2.2.4.2相似度计算
将测定获得的6份天花粉指纹图谱导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，进行色谱峰匹配，以样品S1分析得到的图谱作为参照图谱，采用中位数法(时间窗为0.1)进行多点校正，生成6份天花粉的对照指纹图谱，并计算不同样品的相似度。结果显示6份样品S1～S6与对照图谱之间的相似度分别为0.897、0.945、0.989、0.982、0.994、0.995。
实施例5：如意金黄散指纹图谱研究
1材料
对照品：姜黄素(中国食品药品检定研究院，批号110823-201405，含量以98.9％计)。
2方法与结果
2.1如意金黄散样品
2.2姜黄素含量测定
2.2.1对照品溶液的制备
取姜黄素对照品2.0mg，精密称定，于25mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度线，稀释，得含姜黄素40μg/mL对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
取本品粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，冷浸1h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液即得供试品溶液。
2.2.3色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，保护住：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)，以异丙醇-甲醇-0.5％醋酸溶液(25∶19∶56)为流动相；检测波长为430nm，柱温35℃，进样量5μL。色谱图见图12。
2.2.4样品分析
按“2.2.1”、“2.2.2”项下方法制备如意金黄散供试品溶液和对照品溶液，每份样品平行制备2份，将各样品按“2.2.3”项下方法进样，每个样品进样2次，测得含量结果见表3。
2.2.5姜黄素变化差异分析
根据中国药典2015版规定，如意金黄散每1g样品含姜黄以姜黄素计，不得少于1.0mg，即1.0mg/g，结果表明10批次如意金黄散辐照前后姜黄素含量均符合药典规定；根据公式1计算辐照后姜黄素相对含量变化，结果见表3。
表3如意金黄散姜黄素含量测定结果
注:+表示含量升高，-表示含量降低
2.3如意金黄散指纹图谱研究
2.3.1色谱条件考察
(1)不同流动相系统考察
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，保护住：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；检测波长：240nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为10μL。
比较甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-乙腈-0.1％磷酸水，三种流动相组成系统分析下如意金黄散指纹色谱图，分析结果见图21。
①流动相：甲醇(B)-0.1％磷酸水溶液(D)，梯度洗脱程序如下：0～10min，5％～20％B；10～25min，20％-45％B；25～35min，45％～50％B；35～40min，50％～60％B；40～60min，60％～75％B；60～70min，75％～80％B；70～80min，80％～90％B；80～90min，90％～100％B；90～100min 100％B；
②流动相：乙腈(C)-0.1％磷酸水(D)，梯度洗脱程序如下：0～5min，2％C；5～10min，2％～15％C；10～25min，15％～30％C；25～35min，30％～35％C；35～40min，35％～52％B；40～60min，52％～65％B；60～70min，65％C；70～80min，65％～100％C；80～90min，100％C；
③流动相：乙腈-甲醇(1∶1，B)-0.1％磷酸水(D)，梯度洗脱程序如下：0～15min，14％～20B；15～27min，20％～35％B；27～32min，35～50％B；32～55min，50％～70％B；55～60min，70％～80％B；60～63min，100％B；63～75min 100％B；
所述结果如图13所示：结果表明乙腈-0.1％磷酸水系统下分离效果较为理想，色谱峰较多，峰对称性好，样品分析时间较为合适。而甲醇-0.1％磷酸水与乙腈-甲醇-0.1％磷酸水为流动相色谱峰较少且分离效果较差因此最终选择乙腈-0.1％磷酸水为流动相进行分析。
(2)流动相pH考察
比较流动相分别为乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水下如意金黄散指纹色谱图，流动相梯度如下，分析结果见图22。
①流动相：乙腈(C相)-水(A相)，梯度洗脱程序如下：0～5min，2％C；5～10min，2％～15％C；10～25min，15％～30％C；25～35min，30％～35％C；35～40min，35％～52％B；40～60min，52％～65％B；60～70min，65％C，70～80min，65％～100％C；80～90min，100％C；
②流动相：乙腈(C相)-0.1％磷酸水(D相)，梯度洗脱程序如下：0～5min，2％C；5～10min，2％～15％C；10～25min，15％～30％C；25～35min，30％～35％C；35～40min，35％～52％B；40～60min，52％～65％B；60～70min，65％C，70～80min，65％～100％C；80～90min，100％C；
所述结果如图14所示：由图可见乙腈-0.1％磷酸水溶液洗脱下色谱峰响应强于乙腈-水，且色谱峰数目较多，因此选择乙腈-0.1％磷酸水作为流动相。
(3)检测波长选择
采用DAD检测器在200～600nm进行全波长扫描，对图谱整体信息进行比较分析，对相对色谱峰较多的210nm、240nm、270nm、330nm、430nm几个检测波长进一步分析，获取几个波长下的HPLC图，进行比较，见图15，结果表明，在240nm波长下，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，从图谱中可以尽可能地获取组分信息以反映体系组分的全貌，因此选择240nm为指纹图谱测定波长。
(4)确定色谱条件
在上述色谱考察下，对洗脱梯度进行考察，最后得到最佳色谱条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，保护柱：Agilent C18ODS(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：乙腈(C)-0.1％磷酸水溶液(D)；检测波长：240nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为10μL。梯度洗脱程序如下：0～15min，14％～20％C；15～27min，20％～35％C；27～32min，35％～50％C；32～55min，50％～70％C；55～60min，70％～80％C；60～62min，80％～100％C；62～75min，100％～100％C。
2.3.2对照品溶液的制备
称取绿原酸1.000mg，橙皮苷2.213mg，盐酸小檗碱4.521mg，苍术素1.262mg，芦荟大黄素1.018mg，甘草酸铵0.994mg，甘草苷1.047mg，欧前胡素1.218mg，姜黄素2.474mg，去甲氧基姜黄素1.016mg，双去甲氧基姜黄素1.017mg，和厚朴酚2.532mg，厚朴酚2.504mg，大黄酚1.052mg，甲醇溶解，得混合对照品溶液。
2.3.3供试品溶液的制备
(1)提取方法考察
取如意金黄散粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，分别采用加热回流1h、冷浸24h和超声30min的方法进行提取，提取液放置至室温，甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，得供试品溶液，以建立的色谱条件进行分析，结果见图16。
各提取方式得到的色谱峰信息见表4，结果表明，超声提取的如意金黄散色谱峰较多，总峰面积显著高于冷浸提取和加热回流，因此选择超声提取，提取方法简便，且色谱图反映的信息最丰富。
表4不同溶剂提取如意金黄散考察数据
(2)提取溶剂考察
取如意金黄散粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、50％甲醇、乙醇20mL，超声提取30min提取液放冷，甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，得供试品溶液，以建立的色谱条件进行分析，结果见图17。
不同溶剂得到的色谱峰信息见表5，结果表明50％甲醇与甲醇提取效果基本相当，乙醇提取得到的样品信息相对较少，而甲醇提取色谱峰分离效果较好，因此选择甲醇提取。
表5不同溶剂提取如意金黄散考察数据
(3)提取时间考察
取如意金黄散粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20mL，分别超声提取30min和1h，提取液放置至室温，甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，得供试品溶液，以建立的色谱条件进行分析，结果见图18。
不同提取时间下得到的色谱峰信息见表6，结果表明超声提取30min与1h样品色谱峰个数基本一致，提取30min峰面积略高于提取1h，因此选择超声提取30min，提取时间短且提取效果好。
表6不同溶剂提取如意金黄散考察数据
(4)液料比考察
取如意金黄散粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10、20、50mL，超声提取30min，提取液放置至室温，甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，得供试品溶液，以建立的色谱条件进行分析，结果见图19。
结果表明在所考察的三个液料比下(40∶1、80∶1、200∶1)，甲醇20mL提取得到的色谱峰面积略高于10mL提取，甲醇50mL提取得到的样品浓度较低，色谱信息相对较少，因此从保证提取完全和节约溶剂的角度，选择加入甲醇20mL，即液料比为80∶1。
(5)供试品制备方法的确定
根据上述实验结果，确定供试品溶液制备方法为：取本品粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放置至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，13000r/min离心10min，取上清液，即得。奇数编号为辐照前样品，偶数编号为辐照后样品。
2.3.4指纹图谱方法学考察
2.3.4.1精密度试验
取样品1份(批号5617032-BI)，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，连续进样6次，按照“2.3.1”项下色谱条件分析，结果见图20，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为高于0.99，说明仪器精密度良好。
2.3.4.2稳定性试验
取样品1份(批号5617032-BI)，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24h，按照“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图，结果见图21，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.99，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.3.4.3重复性试验
取样品(批号5617032-BI)按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录HPLC色谱图，结果见图22。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.99，表明方法重复性良好。
2.3.5指纹图谱建立
2.3.5.1参照峰选择与共有峰标定
以20批次如意金黄散样品共计20份样品建立指纹图谱，将S1设为参照谱，时间宽度为0.10，采用中位数法，生成对照图谱，其中确定43个色谱峰为如意金黄散所共有，且共有峰的总面积占总峰面积85％以上，因此确定这43个色谱峰为如意金黄散的指纹图谱共有峰，建立指纹图谱，图谱见图23～26。以姜黄素为参照峰(S)，取10批次如意金黄散样品计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于5％，说明共有峰出峰时间较稳定，该方法准确可靠，可用于如意金黄散的质量评价，相对峰面积RSD在10.07％～46.87％之间，说明不同生产批次如意金黄散样品各成分含量存在一定的差异。
2.3.5.2相似度计算
以10批次样品建立指纹图谱，每批样品与对照指纹图谱相似度分别为0.982、0.998、0.988、0.989、0.99、0.998、0.999、0.998、0.999、0.999；均大于0.98，相似度较高。不同批次如意金黄散样品整体一致性较好。
以上所述，仅是本发明较佳的实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化和修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种如意金黄散指纹图谱建立方法，其特征在于，包括姜黄、厚朴、苍术、天花粉和如意金黄散的HPLC指纹图谱研究：所述如意金黄散的HPLC指纹图谱的建立方法具体包括以下步骤：
第1步，如意金黄散对照品溶液的制备：称取绿原酸1.000 mg，橙皮苷2.213 mg，盐酸小檗碱4.521 mg，苍术素1.262 mg，芦荟大黄素1.018 mg，甘草酸铵0.994 mg，甘草苷 1.047mg，欧前胡素1.218 mg，姜黄素2.474 mg，去甲氧基姜黄素1.016 mg，双去甲氧基姜黄素1.017 mg，和厚朴酚2.532 mg，厚朴酚2.504 mg，大黄酚1.052 mg，甲醇溶解，得混合对照品溶液；
第2步，如意金黄散供试品溶液的制备：取本品粉末0.25 g，精密称定，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放置至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立如意金黄散指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1%磷酸水溶液D；检测波长：240 nm；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量为10 μL；梯度洗脱程序如下：0~15 min，14%~20% C；15~27 min，20%~35% C；27~32 min，35%~50% C；32~55 min，50%~70% C；55~60 min，70%~80% C；60~62 min，80%~100% C；62~75 min，100%~100%C。
2.根据权利要求1所述的一种如意金黄散指纹图谱建立方法，其特征在于，所述姜黄的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，姜黄对照品溶液的制备：取姜黄素对照品2.00 mg，精密称定，置于20 mL的容量瓶中，加甲醇使其溶解，定容至刻度，得姜黄素对照品储备液；精密量取姜黄素对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1 mL含10 μg的姜黄素对照品溶液，备用；
第2步，姜黄供试品溶液的制备：取姜黄粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，13000 r/min离心10 min，取上清液，即得；
第3步，采用高效液相色谱仪建立姜黄指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1%磷酸水溶液D；检测波长：240 nm；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量为5 μL；梯度洗脱程序如下：0~5 min，30%~48% C；5~18 min，48%~55% C；18~23 min，55%~65% C；23~35 min，65%~72% C；35~40 min，72%~100% C；40~50 min，100%~100% C。
3.根据权利要求1所述的一种如意金黄散指纹图谱建立方法，其特征在于，所述厚朴的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，厚朴对照品溶液的制备：取厚朴酚对照品2.0 mg，和厚朴酚2.4 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，称量，离心，取上清液，稀释，制成含厚朴酚40.0 μg/mL，和厚朴酚24.0 μg/mL的单一对照品溶液；
第2步，厚朴供试品溶液的制备：取本品粉末0.2 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立厚朴指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈C-0.1%磷酸水溶液D；流速1 mL/min；检测波长：274 nm；柱温40℃；进样量10 μL；梯度洗脱程序如下：0~7 min，15%~25% C；7~15 min，25%~35% C；15~25 min，35%~44% C；25~28 min，44%~60% C；28~35 min，60%~80% C；35~40 min，80%~95% C；40~50 min，95%~100% C。
4.根据权利要求1所述的一种如意金黄散指纹图谱建立方法，其特征在于，所述苍术的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，苍术对照品溶液的制备：避光操作条件下，精密称取苍术素对照品2.0 mg至10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度线，精密量取1 mL溶液，稀释至10 mL，即得苍术素20 μg/mL对照品溶液；
第2步，苍术供试品溶液的制备：：避光操作条件下，取本品粉末0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得供试品溶液；
第3步，采用高效液相色谱仪建立苍术指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：甲醇B-0.1%磷酸水溶液A；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长：240 nm；进样量10 μL；梯度洗脱程序如下：0~15 min，35%~62% B；15~30 min，62%~65% B；30~55 min，65%~80% B；55~60 min，80%~95% B；60~70 min，95%~100% B；70~80 min，100% B。
5.根据权利要求1所述的一种如意金黄散指纹图谱建立方法，其特征在于，所述天花粉的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
第1步，天花粉供试品溶液的制备：取天花粉粉末2.0 g，精密称定，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得对照品溶液；
第2步，采用高效液相色谱仪建立天花粉指纹图谱；其中，色谱条件为：流动相：乙腈B-0.1%磷酸水溶液A；流速1 mL/min；柱温40℃；检测波长：240 nm；进样量10 μL；梯度洗脱程序如下：0~7 min，25%~70% B；7~20 min，70% B；20~25 min，70%~100% B；25~35 min，100%B。
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