CN109633037A - 安宫牛黄丸的uplc指纹图谱构建方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法和检测方法。所述UPLC指纹图谱构建方法包括如下步骤：对照品溶液制备：取栀子苷对照品，加溶剂溶解，得所述对照品溶液；供试品溶液制备：取安宫牛黄丸样品，加入体积浓度为70～80％的甲醇水溶液提取，滤过，取续滤液，得所述供试品溶液；指纹图谱构建：将所述对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱。该构建方法在30min内共标定了25个共有峰，并指认了其中的17个色谱峰，方法简便、快速、准确性高、重现型好，可为安宫牛黄丸的质量评价和控制提供科学依据。

Description

安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制，特别是涉及安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法和检测方法。

背景技术

安宫牛黄丸出自清代医家吴瑭的《温病条辨》，是中医治疗高热症的“温病三宝”之一，素有“救急症于即时，挽垂危于顷刻”之美誉，具有清热解毒、豁痰开窍之功效，广泛用于治疗中风、昏迷、缺血缺氧性脑病、高血压脑出血等，疗效确切可靠。现代药理研究表明安宫牛黄丸具有良好的抗惊厥、保护脑损伤和抗炎消肿作用，对动物实验性高血压有降低作用，同时也能增强机体的免疫反应，可以改善全血粘度、血浆粘度，起到保护缺血性大鼠脑损伤的作用。

安宫牛黄丸为《中国药典》收录品种，由外培育牛黄、水牛角浓缩粉、人工麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片配制而成。安宫牛黄丸质量标准主要采用薄层色谱法对牛黄、黄连、黄芩、冰片、麝香进行了定性，采用高效液相色谱法对胆红素、黄芩苷及盐酸小檗碱进行定量。已有文献报道主要是对安宫牛黄丸中的胆红素、栀子苷、牛磺胆酸、麝香酮和右旋龙脑等的含量进行控制。这些研究只关注了安宫牛黄丸中的某几个成分，鉴于中药成分的多样性，仅靠个别指标无法充分反映制剂的整体质量。

中药指纹图谱可以对中药中的已知成分和未知成分进行全面的表征，具有整体性和系统性的特点，可以实现对中药化学成分和整体质量的综合评价和全面控制，是中药质量控制的有效手段之一。已有学者分别采用高效液相色谱法、气相色谱法建立了安宫牛黄丸的指纹图谱，但是用时较长，特征峰数量较少，难以高效、全面的对安宫牛黄丸进行质量评价。

发明内容

基于此，有必要提供一种安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法。该构建方法在30min内共标定了25个共有峰，并指认了其中的17个色谱峰，方法简便、快速、准确性高、重现型好，可为安宫牛黄丸的质量评价和控制提供科学依据。

一种安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，包括如下步骤：

对照品溶液制备：取栀子苷对照品，加溶剂溶解，得所述对照品溶液；

供试品溶液制备：取安宫牛黄丸样品，加入体积浓度70～80％甲醇水溶液提取，滤过，取续滤液，得所述供试品溶液；

指纹图谱构建：将所述对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱；其中所述超高效液相色谱仪采用的洗脱方式为：以体积浓度0.08～0.12％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法为：

0-6min，流动相B的体积分数由10％上升至25％；

6-22min，流动相B的体积分数由25％上升至46％；

22-24min，流动相B的体积分数由46％上升至60％；

24-30min，流动相B的体积分数由60％上升至95％。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱仪的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28～32℃；所述流动相的流速为0.38～0.42mL/min；检测波长为254nm。

在其中一个实施例中，所述供试品溶液制备中，所述提取的方法为超声提取，时间为50～70min。

在其中一个实施例中，所述超声提取的功率为350～450W，频率为35～45kHZ。

在其中一个实施例中，所述供试品溶液制备中，所述体积浓度70～80％甲醇水溶液的用量为每g安宫牛黄丸样品加入40～60mL。

本发明还提供一种安宫牛黄丸的检测方法，包括如下步骤：

待测样品溶液制备：取待测安宫牛黄丸，加入体积浓度70～80％甲醇水溶液提取，滤过，取续滤液，得所述待测样品溶液；

检测：将所述待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，测定，即可；其中所述超高效液相色谱仪采用的洗脱方式为：以体积浓度0.08～0.12％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法为：

0-6min，流动相B的体积分数由10％上升至25％；

6-22min，流动相B的体积分数由25％上升至46％；

22-24min，流动相B的体积分数由46％上升至60％；

24-30min，流动相B的体积分数由60％上升至95％。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱仪的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28～32℃；所述流动相的流速为0.38～0.42mL/min；检测波长为254nm。

在其中一个实施例中，所述待测样品溶液制备中，所述提取的方法为超声提取，时间为50～70min。

在其中一个实施例中，所述超声提取的功率为350～450W，频率为35～45kHZ。

在其中一个实施例中，所述待测样品溶液中，所述体积浓度70～80％甲醇水溶液的用量为每g待测安宫牛黄丸加入40～60mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过采用超高效液相色谱(UPLC)法，并对色谱条件进行合理控制，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B进行梯度洗脱，在30min内共标定了25个共有峰，并指认了其中的17个色谱峰，分别为对羟基苯甲酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、格兰地新、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、对羟基苯甲酸乙酯、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A，构建获得的指纹图谱能够对安宫牛黄丸进行更全面的质量评价，且用时短，能够提高质量检测效率，同时方法简便、准确性高、重现型好，可为安宫牛黄丸的质量评价和控制提供科学依据。

附图说明

图1为24个批次的安宫牛黄丸样品的UPLC色谱图；

图2为安宫牛黄丸的对照UPLC指纹图谱；

图3为待测安宫牛黄丸(批号：X02018)的UPLC图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法和检测方法作进一步详细的说明。

实施例1：

本实施例为安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法。

1、材料

1.1仪器

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(沃特世上海科技有限公司)；AgilentG6500UPLC串联四级杆飞行时间质谱仪(安捷伦科技有限公司)；Waters Xevo G2-Q-TOF(沃特世上海科技有限公司)；BX8200HP型超声仪(上海新苗医疗器械制造有限公司)；Sartorius BP211D十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；超纯水系统(美国Millpore公司)。

2、方法与结果

2.1指纹图谱建立

2.1.1色谱条件

色谱柱：Poroshell 120EC-C18(2.1*100mm,2.7μm)；流动相：甲醇(B)-体积浓度0.1％甲酸水(A)；洗脱梯度(体积分数)：0-6min 10％-25％B，6-22min25％-46％B，22-24min 46％-60％B，24-30min 60％-95％B；柱温：30℃；检测波长：254nm；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；采集时间：30min。

2.1.2对照品溶液的制备

取对羟基苯甲酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、格兰地新、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、对羟基苯甲酸乙酯、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A对照品各10mg，精密称定，置10mL容量瓶，加入纯甲醇，定容至10mL，配制成浓度约为1.0mg/mL的高浓度储备液。分别取0.1mL高浓度储备液至分析小瓶，加纯甲醇稀释配制成100μg/mL的单标工作液。

分别取17个单标溶液的高浓度储备液50μL，至同一分析小瓶，配制成各单标浓度约为55.56μg/mL的混标溶液，即为对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

取安宫牛黄丸样品，剪碎，取约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度75％甲醇25mL，密塞，称定重量，混匀，超声(400W，40kHZ)处理60min，放冷，再称定重量，用体积浓度75％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液经微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得。同法制得处方中各味药材的供试品溶液。

2.1.4方法学考察

2.1.4.1精密度试验

取批号为X02005的安宫牛黄丸，按2.1.3项下方法制备安宫牛黄丸供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进行测定，连续进样6次，计算所得色谱图的相似度值，并以4号峰(栀子苷)为参照峰(S)，考察各共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果显示，所得色谱图的相似度值为1，25个色谱峰的相对保留时间RSD％小于1.0％，相对峰面积的RSD％小于3.0％，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2重复性试验

取批号为X02005的安宫牛黄丸，按2.1.3项下方法平行制备安宫牛黄丸供试品溶液6份，按2.1.1项下色谱条件进行测定，计算所得色谱图的相似度值，并以4号峰(栀子苷)为参照峰(S)，考察各共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果显示，所得色谱图的相似度值为1，25个色谱峰的相对保留时间RSD％小于1.0％，相对峰面积的RSD％小于3.0％。结果表明，该方法的重现性良好。

2.1.4.3样品稳定性试验

取批号为X02005的安宫牛黄丸，按2.1.3项下方法制备安宫牛黄丸供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进行测定，计算所得色谱图的相似度值，并以4号峰(栀子苷)为参照峰(S)，考察各共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果显示，所得色谱图的相似度值为1，25个色谱峰的相对保留时间RSD％小于1.0％，相对峰面积的RSD％小于3.0％。结果表明，供试品溶液在室温下24h内稳定。

2.1.5安宫牛黄丸UPLC指纹图谱共有模式的建立与相似度评价

2.1.5.1参照峰的选择

观察采集到的UPLC色谱图，选择其中保留时间和峰面积较为稳定且分离度较好的色谱峰作为参照峰。结果显示，4号峰(栀子苷)在6.75min处出峰，且出峰时间、峰面积均稳定，分离度良好，因此选择4号峰为参照峰(S峰)，计算24批安宫牛黄丸指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.1.5.2共有峰的标定

取24个批次的安宫牛黄丸并按照按2.1.3项下方法制备安宫牛黄丸供试品溶液，按2.1.1项下建立的色谱条件进样分析并记录色谱图，并将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行分析，中位数法，以4号峰(栀子苷)为参照峰，经多点校正自动匹配后生成安宫牛黄丸的对照UPLC指纹图谱(图1)。选择图谱中含量较大且分离度较好的色谱峰作为共有特征峰，结果共标定出25个共有峰(图2)。

2.1.5.3相对保留时间和相对峰面积

记录24批安宫牛黄丸指纹图谱中各共有峰的保留时间和峰面积，并计算同一批次图谱中各共有峰与S峰保留时间和峰面积的比值，即得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，24个批次中，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0％，各批次安宫牛黄丸的相对峰面积RSD相差较大，说明不同批次安宫牛黄丸中各成分含量存在一定的差异。

2.1.5.4相似度计算

将24批安宫牛黄丸样品UPLC指纹图谱的CDF数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行分析，以生成的对照图谱为参照，计算每批安宫牛黄丸制剂UPLC指纹图谱的相似度。结果显示，24批安宫牛黄丸样品UPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.980，结果表明这24批安宫牛黄丸质量较为均一稳定。

2.1.6主要色谱峰的药材来源

比较安宫牛黄丸供试品溶液和十一味药材供试品溶液主要色谱峰的色谱保留行为，对主要色谱峰的药材来源进行归属。结果显示，安宫牛黄丸供试品溶液中共有25个主要色谱峰，其中有8个色谱峰(峰5,6,7,8,10,11,13和14)来源于黄连药材，有11个色谱峰(峰9,12,17,18,19,20,21,22,23,24和25)来源于黄芩药材，有3个色谱峰(峰3,4和16)来源于栀子，有2个色谱峰(峰2和15)来源于麝香，共有24个色谱峰找到药材来源，1个色谱峰(峰1)未找到药材归属(结果见表1)。

2.1.7主要色谱峰化学指认

通过与对照品保留时间、紫外吸收光谱比对，共鉴定了17个主要特征峰，按保留时间先后顺序，依次为对羟基苯甲酸(2)、京尼平龙胆双糖苷(3)、栀子苷(4)、格兰地新(7)、黄连碱(8)、表小檗碱(10)、药根碱(11)、小檗碱(13)、巴马汀(14)、对羟基苯甲酸乙酯(15)、黄芩苷(17)、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(19)、千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(20)、汉黄芩苷(21)、黄芩素(22)、汉黄芩素(24)、千层纸素A(25)。所指认的色谱峰峰面积占总峰面积84.7％，占共有峰面积的94.0％。结果如表1所示。

表1安宫牛黄丸供试品溶液主要色谱峰与对照品保留时间对比及药材来源归属

2.1.8主要色谱峰的质谱鉴定

2.1.8.1液相条件

色谱柱：Poroshell 120EC-C18(2.1*100mm,2.7μm)；流动相：甲醇(B)-体积浓度0.1％甲酸水(A)；洗脱梯度(体积分数)：0-6min 10％-25％B，6-22min25％-46％B，22-24min 46％-60％B，24-36min 60％-95％B，36-40min 95％B；柱温：30℃；检测波长：254nm；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；采集时间：40min。

2.1.8.2质谱条件

采集模式：正离子；毛细管电压：4000V；毛细管出口电压：175V，锥孔电压：65V，八级杆电压：750V；干燥气温度：350℃，干燥气流速：8L/min；喷雾器压力：35psig。

采集模式：负离子；毛细管电压：3500V；毛细管出口电压：175V，锥孔电压：65V，八级杆电压：750V；干燥气温度：350℃，干燥气流速：8L/min；喷雾器压力：35psig。

2.1.8.3实验结果

分别于负离子和正离子模式下比较安宫牛黄丸供试品溶液与混合对照品溶液的色谱保留时间及质谱信息，结果如表2所示。结果表明，安宫牛黄丸指纹图谱中指认的17个主要色谱峰，与其相应的对照品的保留时间和不同采集模式下的分子量一致，对指纹图谱中17个主要色谱峰进行了进一步的质谱确认。

表2混合对照品与安宫牛黄丸对应色谱峰保留时间和分子量

3、讨论

3.1样品提取条件的优化

本实验对提取方法(冷浸、超声和加热回流)、提取溶剂比较(30％甲醇、75％甲醇、100％甲醇、30％乙醇、75％乙醇和100％乙醇，均为体积浓度)、提取时间(30min、60min和90min)均进行了考察，最终确定最佳提取条件为75％甲醇超声(400W，40kHZ)提取60min，由此获得的色谱峰较多，基线平稳。

3.2色谱条件的优化

本实验分别对4种不同体系的流动相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水、乙腈-酸水)、不同的柱温(30℃，35℃，40℃)、不同流速(0.30mL/min，0.35mL/min，0.40mL/min，0.45mL/min)，进行了考察。结果显示，在温度为30℃，流动相为甲醇-0.1％甲酸水，流速为0.40mL/min时，色谱峰较多，各峰的峰形和分离效果较好，基线平稳。故选择甲醇-酸水体系为本实验流动相，30℃为检测柱温，流速确定为0.40mL/min。

本实验比较了在不同检测波长(210nm、254nm、280nm和330nm)下供试品溶液的色谱图，结果显示以254nm为检测波长时，色谱图基线平稳，检测的色谱峰较多，且各色谱峰峰形和分离度良好，能够较为全面的反映出安宫牛黄丸中多种成分的整体面貌，故选择254nm作为安宫牛黄丸UPLC指纹图谱研究的检测波长。

本实验比较了分别采用Poroshell 120EC-C18(2.1*100mm,2.7μm,Agilent)柱、ACQUITY UPLC BEH Shied RP-C18(2.1*100mm,1.7μm,Waters)柱、ACQUITY UPLC HSS T3-C18(2.1*100mm,1.8μm,Water)柱及Agilent Eclipse XDB RP-C18(3.0*100mm,1.8μm,Agilent)柱4种不同型号色谱柱上的色谱峰分离情况，结果显示，Poroshell 120EC-C18柱所得色谱图基线平稳，色谱峰较多，分离效果良好，故本实验选取Poroshell 120EC-C18(2.1*100mm,2.7μm,Agilent)柱作为安宫牛黄丸UPLC指纹图谱研究的色谱柱。

实施例2

本实施例为一种安宫牛黄丸的检测方法，步骤如下：

1、色谱条件

参见实施例1中的“2.1.1色谱条件”项。

2、待测样品溶液的制备：取待测安宫牛黄丸(批号：X02018)，剪碎，取约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度75％甲醇25mL，密塞，称定重量，混匀，超声(400W，40kHZ)处理60min，放冷，再称定重量，用体积浓度75％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液经微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得。

3、测定：精密吸取待测样品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪，按照1的色谱条件进行测定，即得。

结果如图3所示，与实施例1建立的安宫牛黄丸的对照UPLC指纹图谱(图2)进行对比可知：该批次安宫牛黄丸与对照指纹图谱相似度高，质量合格。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

对照品溶液制备：取栀子苷对照品，加溶剂溶解，得所述对照品溶液；

供试品溶液制备：取安宫牛黄丸样品，加入体积浓度为70～80％的甲醇水溶液提取，滤过，取续滤液，得所述供试品溶液；

指纹图谱构建：将所述对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱；其中所述超高效液相色谱仪采用的洗脱方式为：以体积浓度为0.08～0.12％的甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的方法为：

0-6min，流动相B的体积分数由10％上升至25％；

6-22min，流动相B的体积分数由25％上升至46％；

22-24min，流动相B的体积分数由46％上升至60％；

24-30min，流动相B的体积分数由60％上升至95％。

3.根据权利要求1所述的安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱仪的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28～32℃；所述流动相的流速为0.38～0.42mL/min；检测波长为254nm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，所述供试品溶液制备中，所述提取的方法为超声提取，时间为50～70min。

5.根据权利要求1-3任一项所述的安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，所述供试品溶液制备中，所述体积浓度为70～80％的甲醇水溶液的用量为每g安宫牛黄丸样品加入40～60mL。

6.一种安宫牛黄丸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

待测样品溶液制备：取待测安宫牛黄丸，加入体积浓度为70～80％的甲醇水溶液提取，滤过，取续滤液，得所述待测样品溶液；

检测：将所述待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，测定，即可；其中所述超高效液相色谱仪采用的洗脱方式为：以体积浓度为0.08～0.12％的甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的安宫牛黄丸的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的方法为：

0-6min，流动相B的体积分数由10％上升至25％；

6-22min，流动相B的体积分数由25％上升至46％；

22-24min，流动相B的体积分数由46％上升至60％；

24-30min，流动相B的体积分数由60％上升至95％。

8.根据权利要求6所述的安宫牛黄丸的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱仪的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28～32℃；所述流动相的流速为0.38～0.42mL/min；检测波长为254nm。

9.根据权利要求6-8任一项所述的安宫牛黄丸的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液制备中，所述提取的方法为超声提取，时间为50～70min。

10.根据权利要求6-8任一项所述的安宫牛黄丸的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液中，所述体积浓度为70～80％的甲醇水溶液的用量为每g待测安宫牛黄丸加入40～60mL。