CN106370751B - 中药组合物的指纹图谱构建方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药组合物的指纹图谱构建方法及检测方法。所述中药组合物的原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮，所述指纹图谱构建方法包括如下步骤：精密称定所述中药组合物，加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取，过滤，即得供试品溶液；精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的所述中药组合物的指纹图谱，其中，所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以甲醇为流动相A，体积浓度0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱。本发明提供的指纹图谱构建方法为该中药组合物的质量评价提供了更高和更深层次的依据，可以更好地保障患者用药安全和治疗效果。

Description

中药组合物的指纹图谱构建方法及检测方法

技术领域

本发明涉及中药检测领域，特别是涉及中药组合物的指纹图谱构建方法及检测方法。

背景技术

基于中医药理论的中药组合物(中成药)，药味组成一般比较繁多，且在中药组合物的制备过程中，不同成分之间还可能相互发生反应，导致中药组合物的成分更加复杂，如仅定性或定量的检测其中某个或某几个成分，由于信息量有限，难以体现中药组合物作为整体的化学特征。因此，随着现代分析技术的发展，指纹图谱已经是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。

中药组合物指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。

古方黄耆散，北宋《圣济总录》(第五十九卷·消渴门·渴利)和明代《普济方》(消渴门·渴利附论)均有收录。全方由黄芪、葛根、桑白皮三味药组成。方中黄芪补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，为君药；葛根生津止渴，通经活络，为臣药；桑白皮泻肺平喘，利水消肿，为佐药。三药相伍，共奏益气养阴，通络利水之效。以扶正治本为主，治疗糖尿病肾脏疾病(DKD)气虚、气阴两虚之证。

目前，对黄耆散的研究较少，且实验结果都不能全面的反映该方中的有效化学信息，不能很好的对黄耆散进行控制质量。

发明内容

基于此，有必要提供一种中药组合物的指纹图谱构建方法。

一种中药组合物的指纹图谱构建方法，所述中药组合物的原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮，所述指纹图谱构建方法包括如下步骤：

精密称定所述中药组合物，加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的所述中药组合物的指纹图谱，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以甲醇为流动相A，体积浓度0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱。

所述中药组合物可为由黄芪、葛根和桑白皮作为原料的提取物或包括该提取物的制剂。根据需要选择加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取进行供试品溶液的制备。

上述甲醇水溶液的体积浓度进一步优选为55％～65％，加入量优选为所述中药组合物重量的9～11倍。上述22个共有特征峰中包括葛根素的吸收峰，所述中药组合物的指纹图谱优选为以葛根素的吸收峰为参照峰。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：

0～10min，所述流动相A的体积百分比保持为23％，所述流动相B的体积百分比保持为77％；

10min～40min，所述流动相A的体积百分比由23％变化至40％，所述流动相B的体积百分比由77％变化至60％；

40min～55min，所述流动相A的体积百分比由40％变化至60％，所述流动相B的体积百分比由60％变化至40％；

55min～75min，所述流动相A的体积百分比由60％变化至80％，所述流动相B的体积百分比由40％变化至20％；

75min～85min，所述流动相A的体积百分比由80％变化至85％，所述流动相B的体积百分比由20％变化至15％。

在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0.1％～0.3％的甲酸水溶液。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；所述流动相的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；柱温为25℃～40℃；紫外检测波长为250nm～280nm。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为Alltima C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为260nm。

在其中一个实施例中，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

将黄芪、葛根和桑白皮按照重量比0.5～1.5：1.5～2.5：0.5～1.5混合后，加乙醇回流提取，所得提取液浓缩，即可。优选为在所述浓缩后再加入药学上可接受的辅料制成丸剂。

本发明还提供一种中药组合物的检测方法，所述中药组合物的原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮，所述检测方法包括如下步骤：

精密称定所述中药组合物，加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即可，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以甲醇为流动相A，体积浓度0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱。

上述甲醇水溶液的体积浓度进一步优选为55％～65％，加入量优选为所述中药组合物重量的9～11倍；上述流动相B优选为体积浓度0.1％～0.3％的甲酸水溶液。

所述中药组合物的制备方法优选为包括如下步骤：将黄芪、葛根和桑白皮按照重量比0.5～1.5：1.5～2.5：0.5～1.5混合后，加乙醇回流提取，所得提取液浓缩，即可。进一步优选为在所述浓缩后再加入药学上可接受的辅料制成丸剂。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：

0～10min，所述流动相A的体积百分比保持为23％，所述流动相B的体积百分比保持为77％；

10min～40min，所述流动相A的体积百分比由23％变化至40％，所述流动相B的体积百分比由77％变化至60％；

40min～55min，所述流动相A的体积百分比由40％变化至60％，所述流动相B的体积百分比由60％变化至40％；

55min～75min，所述流动相A的体积百分比由60％变化至80％，所述流动相B的体积百分比由40％变化至20％；

75min～85min，所述流动相A的体积百分比由80％变化至85％，所述流动相B的体积百分比由20％变化至15％。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；所述流动相的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；柱温为25℃～40℃；紫外检测波长为250nm～280nm。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为Alltima C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为260nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的中药组合物的指纹图谱构建方法，以高效液相色谱和紫外光谱联用为分离和鉴别手段，得到由22个共有特征峰构成的指纹图谱，该指纹图谱具有系统性、特征性和稳定性，具体体现在：

1、系统性：中药组合物的原料组成为黄芪、葛根和桑白皮三味药材，在指纹图谱中全面系统的体现了三味药材的化学成分，22个特征峰的归属如见表1所示。

表1丸剂指纹图谱色谱峰归属表

2、特征性：采用本发明建立的指纹图谱，是基于本发明所述中药组合物的特定的原料药以及在制剂过程中化学成分间的相互作用，各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积在一定范围内是固定的(尤其是在以葛根素的吸收峰作为参照峰时)，并且会在药味组成发生变化(比如使用伪劣药材)时产生差异。据此，可以很好地鉴别真伪，控制中药组合物的质量。

3、稳定性：本发明指纹图谱的构建方法进一步对供试品溶液的制备、色谱条件、测定过程等都做了详细限定，从而保证不同操作者、不同实验室多重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内，体现了所述指纹图谱的通用性和实用性。

总之，本发明提供的指纹图谱的构建方法，为原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮的中药组合物的质量评价提供了更高和更深层次的依据，可以更好地保障患者用药安全和治疗效果。

附图说明

图1为考察紫外检测波长试验的色谱图，其中S1：250nm；S2：260nm；S3：280nm；S4：300nm；

图2为考察流动相试验的色谱图，其中，S1：甲醇-水；S2：甲醇-0.2％甲酸；S3：甲醇-0.2％磷酸；S4：甲醇-0.2％柠檬酸的色谱图；

图3为考察流动相洗脱程序试验的色谱图，其中，S1：洗脱条件1；S2：洗脱条件2；S3：洗脱条件3；S4：洗脱条件4；S5：洗脱条件5；

图4为考察色谱柱的色谱图，其中，S1：Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；S2：Agilent C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；S3：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；

图5为考察柱温的色谱图，其中，S1：25℃；S2：30℃；S3：40℃；

图6为样品制备方法考察的色谱图，其中，S1：30％甲醇回流提取；S2：60％甲醇回流提取；

图7为仪器精密度考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号；

图8为方法重现性考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号；

图9为供试品稳定性考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号；

图10为13批样品的叠加色谱图，其中S1-S13为样品的编号；

图11为本发明提供的中药组合物的指纹图谱，其中的1-22为特征峰的编号；

图12为本发明的指纹图谱与对照药材色谱图的叠加比对图，其中，S1：本发明指纹图谱；S2：黄芪对照药材色谱图；S3：葛根对照药材色谱图；S4：桑白皮对照药材色谱图；

图13为实施例2中2批样品与对照指纹图谱叠加色谱图，其中，S1：批号20150401样品指纹图谱；S2：批号20150401样品指纹图谱；S3：对照指纹图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的中药组合物的指纹图谱构建方法及检测方法作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例一中药组合物的指纹图谱构建方法。

一、仪器和原料

1.仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配置脱气机G1322B、四元泵G1311B、自动进样器G1329B、柱温箱G1316A、紫外检测器G4212B；

色谱柱：Agilent C18(250×4.6mm，5μm)；Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)；Alltima C18(250×4.6mm，5μm)。

KQ-250B型超声仪(40KHz，昆山市超声仪器有限公司)；

BT25S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；

Synergy超纯水机(Millipore中国有限公司)。

2.试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；

甲酸(色谱纯，Merck公司)；

超纯水；

乙醇、甲醇(分析纯)；

3.样品、对照药材与标准品

3.1样品

微丸，批号：20150401、20150402、20150403、20150404、20150405、20150406、20150407、20150408、20150409、20150410、20150411、20150412、20150413，均由广州康臣药物研究有限公司提供，制备工艺为：

1)准备如下重量比的药材：黄芪：葛根：桑白皮＝1：2：1；

2)以上三味药材，加乙醇回流提取两次，滤过，合并滤液，超滤，收集滤液，回收乙醇并浓缩至浓浸膏，收膏备用；

3)取以上浸膏，加适量药用辅料，混匀，制软材，制成微丸；干燥，过筛取合格微丸，包薄膜衣，干燥，过筛；收集合格微丸，质检，包装，即得成品。

3.2对照药材：

下列对照药材购买于中国食品药品检定研究院：黄芪批号120974-201311、葛根批号121551-201103、桑白皮批号121124-201207。

3.2对照品：

葛根素对照品(批号：110752-201313，购买于中国食品药品检定研究院)。

二、色谱条件的建立

供试品的制备：

取批号20150401的样品4g，研碎，精密称定，加入样品10倍量体积浓度60％甲醇水溶液回流提取2h，以相同溶剂定容至1000mL，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品。

色谱条件：

色谱仪：Agilent1260高效液相色谱仪；色谱柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min。

1.1紫外检测波长的确定

流动相：以甲醇-0.2％甲酸水溶液为流动相，按表2程序进行梯度洗脱。

表2梯度洗脱

分别考察250、260、280、300nm波长下的色谱图，结果见图1。

结果显示：260nm波长下的色谱峰较多，表观峰度较高，且基线相对平稳。因此选择260nm作为本发明所述方法的HPLC的检测波长。

1.2流动相的确定

柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min，分别考察甲醇-水、甲醇-0.2％甲酸、甲醇-0.2％磷酸和甲醇-0.2％柠檬酸为流动相，全部按表2程序进行梯度洗脱，结果见图2。

结果显示：甲醇-0.2％甲酸为流动相，色谱峰的保留时间更合适、峰形更好、基线更平稳。因此选择甲醇-0.2％甲酸为流动相。

1.3流动相流脱程序的确定

柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min，按照下列洗脱条件进行洗脱，结果见图3。结合保留时间、分离度、峰的数量和基线分析，结果选择洗脱条件1作为本研究洗脱条件。

洗脱条件1，见表3。

表3洗脱条件1

洗脱条件2，见表4。

表4洗脱条件2

洗脱条件3，见表5。

表5洗脱条件3

洗脱条件4，见表6。

表6洗脱条件4

洗脱条件5，见表7。

表7洗脱条件5

1.4色谱柱的考察

研究发现，即使是同种规格的C18色谱柱，同一化合物在不同商家的产品中的出峰时间及峰形是有差异的。经过对比Agilent C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱、Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱、Alltima C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱，综合考虑分离度、色谱峰个数、峰形及基线的稳定情况，确定选用Alltima C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱，结果见图4。

1.5柱温考察

考察柱温25℃、30℃、40℃对色谱分离的影响，结果见图5。结果表明温度对分离无影响，本研究选择30℃。

三、供试品制备方法的考察

在建立的色谱条件下，分别考察采用体积浓度30％甲醇水溶液、体积浓度60％甲醇水溶液回流提取制备供试品溶液的色谱图。

体积浓度30％甲醇水溶液提取：取批号20150401的样品4g，研碎，精密称定，加入样品10倍重量体积浓度30％甲醇水溶液，回流提取2h，以相同溶剂定容至1000mL，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品。

体积浓度60％甲醇水溶液提取：取批号20150401的样品4g，研碎，精密称定，加入样品10倍重量体积浓度60％甲醇水溶液，回流提取2h，以相同溶剂定容至1000mL，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品。

结果见图6。

从图6可以看出，体积浓度30％甲醇水溶液提取的色谱图中极性小的色谱峰数明显少于体积浓度60％甲醇水溶液提取的色谱图，而极性大的色谱峰数相当，因此选择60％甲醇回流提取。

四、成分检测

1.1色谱柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)；

1.2流动相：以甲醇-0.2％甲酸水溶液为流动相，按程序进行梯度洗脱，见表8。

表8梯度洗脱

1.3柱温：30℃；

1.4流速：1.0mL/min；

1.5检测波长：260nm；

1.6供试品溶液制备：按照(三)中“体积浓度60％甲醇水溶液提取”项方法制备；

1.7测定法：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，记录85min的色谱图。

五、方法学验证

1.1仪器精密度

取样品(批号：20150401)，参照(四)的方法，连续进样6次，测定色谱图，见图7。在测定时间内，共有22个吸收峰，以葛根素为参照，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间、相对峰面积。结果见表9和表10。采用指纹图谱软件评价相似度，结果见表11。

表9精密度试验共有峰相对保留时间

表10精密度试验共有峰相对峰面积

表11精密度试验相似度评价结果

表9～11的数据显示，22个峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.999，表明实验仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。

1.2方法重现性

取样品(批号：20150401)，按照(三)中“体积浓度60％甲醇水溶液提取”项方法平行制备6份供试品溶液，参照(四)的方法测定，色谱图结果见图8。在测定时间内，共有22个吸收峰，以葛根素为参照，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见表12和表13。采用指纹图谱软件计算其相似度，结果见表14。

表12重现性试验共有峰相对保留时间

表13重现性试验共有峰相对峰面积

表14重现性试验相似度评价结果

表12～14的数据显示，22个峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.999，表明实验方法重现性良好。

1.3稳定性考察

取样品(批号：20150401)，参照(四)的方法，分别在0、4、8、12、24、48h6个时间点测定，色谱图结果见图9。在测定时间内，共有22个吸收峰，以葛根素为参照，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见表15和表16。采用指纹图谱软件计算其相似度，结果见表17。

表15稳定性实验共有峰相对保留时间

表16稳定性试验共有峰相对峰面积

表17稳定性试验相似度评价结果

表15～17的数据显示，22个峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.999，表明实验样品48小时内稳定。

六、指纹图谱建立

参照(四)的方法，检测13批成品，色谱图见图10，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，建立样品指纹图谱。

1.1指纹图谱共有峰的标定

根据13批供试品检测色谱图，用相对保留时间标定HPLC指纹图谱中的22个共有特征峰，峰号见图11。

1.2指纹图谱参照峰的选择

5号峰(葛根素吸收峰)峰面积最大，分离较好，保留时间适中且稳定，因而选择葛根素色谱峰作为参照峰。

1.3共有峰的相对保留时间及相对峰面积值

确定的22个共有峰，以葛根素为参照，将其保留时间和峰面积定为1，计算其他色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见表18和表19。

表18 13批样品22个特征峰相对保留时间

表19 13批样品22个特征峰相对峰面积

1.4 13批成品HPLC指纹图谱相似度评价

使用所述中药指纹图谱相似度评价软件对13批样品进行相似度评价。结果见表20。

表20 13批成品相似度结果

13批次成品供试液的相似度都在0.9～1.0之间，未发现离群样本，符合国家食品药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。

1.5制剂产品与各种原药材的相关性及特征峰归属

参照(四)的方法，分别制备处方中各对照药材、以及对照品和供试品溶液，在(四)的色谱条件下，分别测定与样品相应量各对照药材的指纹图谱以及对照品的图谱。将获得的样品以及对照药材色谱图比对，从而确认样品指纹图谱各特征峰的归属。所得样品的供试品溶液的色谱图中22个色谱峰中，检出与处方中各对照药材参照指纹图谱相同的色谱峰共22个。对样品中各峰进行药材及对照品归属，结果见图12和表1。

结果显示，本发明建立的指纹图谱，原料中的各个药材的化学成分都有体现，与药材有良好的相关性。

通过以上研究，建立了包含黄芪、葛根、桑白皮三味药材的中药组合物的高效液相指纹图谱。通过对多批次样品的测定证明该方法重现性、专属性等良好，可以提供比常规质量标准更深层次的质量评价依据。

实施例2

本实施例一种中药组合物的检测方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备

另取由广州康臣药物研究有限公司提供的微丸(批号20150401、20150402)，研碎，精密称定得待测样品；加入待测样品10倍重量体积浓度60％甲醇水溶液，回流提取2h，以相同溶剂定容至1000mL，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品。

(2)检测

精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中进行测定，记录85min的色谱图，所述高效液相色谱仪的条件如下：色谱柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：以甲醇-0.2％甲酸水溶液为流动相，按程序进行梯度洗脱，见表8；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；检测器：紫外检测。

待测样品的指纹图谱如图13所示。

通过与对照指纹图谱(图11)比较，可知，该待测样品的指纹图谱与对照指纹谱图的相似度均大于0.99，可以认为该待测样品符合所建立的指纹图谱标准。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述中药组合物的原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮，所述指纹图谱构建方法包括如下步骤：

精密称定所述中药组合物，加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取，过滤，得供试品溶液；

精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的所述中药组合物的指纹图谱，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相以甲醇为流动相A，体积浓度0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱；所述梯度洗脱方式为：

0～10min，所述流动相A的体积百分比保持为23％，所述流动相B的体积百分比保持为77％；

10min～40min，所述流动相A的体积百分比由23％变化至40％，所述流动相B的体积百分比由77％变化至60％；

40min～55min，所述流动相A的体积百分比由40％变化至60％，所述流动相B的体积百分比由60％变化至40％；

55min～75min，所述流动相A的体积百分比由60％变化至80％，所述流动相B的体积百分比由40％变化至20％；

75min～85min，所述流动相A的体积百分比由80％变化至85％，所述流动相B的体积百分比由20％变化至15％；

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。

2.根据权利要求1所述的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述流动相B为体积浓度0.1％～0.3％的甲酸水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：所述流动相的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；柱温为25℃～40℃；紫外检测波长为250nm～280nm。

4.根据权利要求3所述的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为Alltima C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为260nm。

5.根据权利要求1或2所述的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

将黄芪、葛根和桑白皮按照重量比0.5～1.5：1.5～2.5：0.5～1.5混合后，加乙醇回流提取，所得提取液浓缩。

6.一种中药组合物的检测方法，其特征在于，所述中药组合物的原料组成包括黄芪、葛根和桑白皮，所述检测方法包括如下步骤：

精密称定所述中药组合物，加入体积浓度50％～70％的甲醇水溶液溶解或回流提取，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即可，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以甲醇为流动相A，体积浓度0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱；所述梯度洗脱方式为：

0～10min，所述流动相A的体积百分比保持为23％，所述流动相B的体积百分比保持为77％；

10min～40min，所述流动相A的体积百分比由23％变化至40％，所述流动相B的体积百分比由77％变化至60％；

40min～55min，所述流动相A的体积百分比由40％变化至60％，所述流动相B的体积百分比由60％变化至40％；

55min～75min，所述流动相A的体积百分比由60％变化至80％，所述流动相B的体积百分比由40％变化至20％；

75min～85min，所述流动相A的体积百分比由80％变化至85％，所述流动相B的体积百分比由20％变化至15％；

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。

7.根据权利要求6所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：所述流动相的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；柱温为25℃～40℃；紫外检测波长为250nm～280nm。

8.根据权利要求7所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为Alltima C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为260nm。