CN113759058A - 中药组合物的指纹图谱建立方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药组合物的指纹图谱建立方法及检测方法。所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;所述指纹图谱建立方法包括对照药材溶液和供试品溶液的制备;以高效液相色谱法对所述对照药材溶液和供试品溶液进行检测;所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。上述方法构建得到的所述中药组合物的指纹图谱,能够有效地表征所述中药组合物,为其质量评价提供了更丰富的化学信息和更全面的依据,更好地保障患者用药安全和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种中药组合物的指纹图谱建立方法及检测方法。
背景技术
中药组合物中包含了多种来源和成分复杂的植物药材,中药组合物的药效不是来自单一的活性成分,而是整个中药组合物的原料共同作用的结果,中药组合物中活性成分的含量、组成比例等差异均会对药效产生影响。基于中药组合物成分的复杂性,任何单一的活性成分或者指标成分都难以有效地评价中药的质量,评价中药组合物及其制剂的质量时应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法,传统的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题,而建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。
中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经过适当处理后,采用一定的分析手段,得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图,是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性,具体包括两方面:(1)通过指纹图谱的特征性,能有效鉴别中药的真伪;(2)通过指纹图谱主要特征峰面积和比例,能够有效控制中药质量。
目前,中药指纹图谱技术已涉及众多方法,其中色谱方法为主流方法,尤其是高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描(TLCS)和气相色谱法(GC)已成为公认的三种常规分析手段。HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点,不受样品挥发度和热稳定性的限制,中药样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测,因此HPLC已成为中药指纹图谱技术的首选方法。
中国专利CN100500206C公开了一种治疗慢性肾炎的中药组合物及其制备方法,该中药组合物全方由人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣十六味药组成,具有升阳补脾,益肾化湿,利水消肿,能够治疗用于慢性肾小球肾炎(肾功能:SCr <2mg/dL)脾虚湿盛证出现的蛋白尿,兼见水肿,疲倦乏力,畏寒肢冷,纳少。目前对该方的研究较少,现有的信息无法全面反映该方的化学特征和质量情况,使得该方用药质量和治疗效果难以得到保证。
发明内容
基于此,本发明提供一种能够全面反映上述中药组合物的化学特征和质量情况的中药组合物的指纹图谱建立方法及检测方法。
具体技术方案如下:
本发明的第一方面,提供一种中药组合物的指纹图谱建立方法,所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
所述指纹图谱建立方法包括如下步骤:
称取所述中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备供试品溶液;
采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测,建立指纹图谱;
所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一实施例中,所述梯度洗脱包括如下程序:
0~10min,所述乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,所述乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,所述乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,所述乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,所述乙腈的体积百分比保持为90%。
在其中一实施例中,所述高效液相色谱法还包括如下检测条件:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.1~0.5mL/min;
柱温:30~45℃;
紫外检测波长:200~320nm。
在其中一实施例中,所述高效液相色谱法的柱温为35~45℃,紫外检测波长为200~300nm。
在其中一实施例中,所述提取溶剂为体积分数40~60%甲醇水溶液。
在其中一实施例中,提取的方法为超声提取20~40min。
在其中一实施例中,所述指纹图谱,包括17个特征峰,以峰6作为参照, 17个特征峰的相对保留时间分别为:
峰1:0.353±0.019%;峰2:0.491±0.018%;峰3:0.582±0.021%;
峰4:0.758±0.032%;峰5:0.908±0.016%;峰6:1.000±0.000%;
峰7:1.103±0.036%;峰8:1.273±0.026%;峰9:1.354±0.032%;
峰10:1.540±0.049%;峰11:1.585±0.054%;峰12:1.720±0.047%;
峰13:1.770±0.038%;峰14:1.875±0.023%;峰15:1.890±0.021%;
峰16:1.982±0.046%;峰17:2.435±0.035%。
本发明的第二方面,提供一种中药组合物的检测方法,所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
所述中药组合物的检测方法包括如下步骤:
称取待测中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备待测品溶液;
采用高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测;
所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一实施例中,所述梯度洗脱包括如下程序:
0~10min,所述乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,所述乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,所述乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,所述乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,所述乙腈的体积百分比保持为90%。
在其中一实施例中,所述高效液相色谱法还包括如下检测条件:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.1~0.5mL/min;
柱温:30~45℃;
紫外检测波长:200~320nm。
在其中一实施例中,所述高效液相色谱法的柱温为35~45℃,紫外检测波长为200~300nm。
在其中一实施例中,所述提取溶剂为体积分数40~60%甲醇水溶液。
在其中一实施例中,提取的方法为超声提取20~40min。
本发明提供的指纹图谱建立方法,采用高效液相色谱法,结合合适的流动相设置,得到的指纹图谱具有系统性、特征性和稳定性,具体体现在:
1、系统性:所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、茯苓、大枣、白术、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草和生姜。本发明建立的指纹图谱中,包括了17个特征峰,该17个特征峰在所述中药组合物各原料药材中的归属如下,见表1。
表1中药组合物指纹图谱色谱峰归属表
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | |
白术 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||||||
茯苓 | ● | ||||||||||||||||
炙甘草 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||
白芍 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | |||||||||||
陈皮 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | |||||
清半夏 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||
生姜 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | |||||||||
防风 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | |||||||||||
黄芪 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||||
独活 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||
羌活 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||||
大枣 | ● | ||||||||||||||||
柴胡 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | |||||||||
人参 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||||||
泽泻 | ● | ● | ● | ● | ● | ||||||||||||
黄连 | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● | ● |
2、特征性:采用本发明所述方法建立的指纹图谱,是基于本发明所述中药组合物特定的原料药以及在制剂过程中化学成分间的相互作用,以峰6作为参照,各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积在一定范围内是固定的,并且会在药味组成发生变化(比如使用伪劣药材)时产生差异。因此,可以很好地对所述中药组合物进行真伪鉴别和质量控制。
3、稳定性:本发明所述方法能够保证不同操作者、不同实验室多重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内,体现了所述方法的通用性和实用性。
总之,本发明提供的中药组合物指纹图谱建立方法所建立的指纹图谱,能够有效地表征本发明所述中药组合物,为其质量评价提供了更丰富的化学信息和更全面的依据,更好地保障患者用药安全和治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中中药组合物不同紫外检测波长的色谱图(S1:203nm; S2:254nm;S3:280nm;S4:320nm);
图2为实施例1中中药组合物不同柱温的色谱图(S1:30℃;S2:35℃; S3:40℃);
图3为实施例1中中药组合物不同提取溶剂的色谱图(S1:30%甲醇水溶液;S2:50%甲醇水溶液;S3:70%甲醇水溶液);
图4为实施例1中仪器精密度考察的叠加色谱图;
图5为实施例1中方法重现性考察的叠加色谱图;
图6为实施例1中方法稳定性考察的叠加色谱图(S1:0h;S2:4.5h;S3: 8h;S4:24h;S5:48h);
图7为实施例1中10批益肾化湿颗的叠加指纹图谱;
图8为实施例1中10批益肾化湿颗的指纹图谱特征峰编号;
图9为实施例1中益肾化湿颗的指纹图谱与原料中各药材的指纹图谱叠加 (1.益肾化湿颗粒、2.白术、3.茯苓、4.炙甘草、5.白芍、6.陈皮、7.清半夏、8.生姜、9.防风、10.黄芪、11.独活、12.羌活、13.大枣、14.柴胡、15.人参、16.泽泻、 17.黄连);
图10为实施例2中6批益肾化湿颗粒的叠加指纹图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中,“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的,应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中,涉及到数值区间,如无特别说明,上述数值区间内视为连续,且包括该范围的最小值及最大值,以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地,当范围是指整数时,包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并该范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量,如无特别说明,对于固液混合和固相~固相混合均指质量百分比,对于液相~液相混合指体积百分比。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明提供一种中药组合物的指纹图谱建立方法,中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
指纹图谱建立方法包括如下步骤:
称取中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备得到供试品溶液;
采用高效液相色谱法对供试品溶液进行检测,建立指纹图谱;
高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一示例中,梯度洗脱包括如下程序:
0~10min,乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,乙腈的体积百分比保持为90%。
在其中一示例中,高效液相色谱法还包括如下检测条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。进一步地,色谱柱为AdvanceBio Peptide Mapping (2.1×250mm,2.7μm)色谱柱。
在其中一示例中,高效液相色谱法还包括如下检测条件:流速为 0.1~0.5mL/min。进一步地,流速包括但不限于:0.1mL/min、0.15mL/min、 0.2mL/min、0.25mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min。
在其中一示例中,高效液相色谱法还包括如下检测条件:柱温为30~45℃。进一步地,柱温包括但不限于:30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、41℃、45℃。
在其中一示例中,高效液相色谱法还包括如下检测条件:紫外检测波长为 200~320nm。进一步地,紫外检测波长包括但不限于:200nm、203nm、205nm、 210nm、230nm、258nm、280nm、300nm。
具体地,在其中一示例中,高效液相色谱法还包括如下检测条件:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.1~0.5mL/min;
柱温:30~45℃;
紫外检测波长为200~320nm。
在其中一示例中,提取溶剂为体积分数40~60%甲醇水溶液。进一步地,甲醇水溶液的体积分数包括但不限于:40%、45%、47%、50%、53%、55%、60%。
在其中一示例中,提取的方法为超声提取20~40min。进一步地,超声提取的时间包括但不限于:20min、25min、29min、30min、31min、35min、40min。
在其中一示例中,超声提取的超声功率为300w,频率为40kHz。
在其中一示例中,中药组合物按照所述方法建立的指纹图谱,包括17个特征峰,以峰6作为参照,17个特征峰的相对保留时间分别为:
峰1:0.353±0.019%;峰2:0.491±0.018%;峰3:0.582±0.021%;
峰4:0.758±0.032%;峰5:0.908±0.016%;峰6:1.000±0.000%;
峰7:1.103±0.036%;峰8:1.273±0.026%;峰9:1.354±0.032%;
峰10:1.540±0.049%;峰11:1.585±0.054%;峰12:1.720±0.047%;
峰13:1.770±0.038%;峰14:1.875±0.023%;峰15:1.890±0.021%;
峰16:1.982±0.046%;峰17:2.435±0.035%。
在其中一示例中,指纹图谱建立方法的步骤包括:
(1)取所述中药组合物0.5g,精密称定,加入体积分数45~55%甲醇水溶液定容至100mL,超声提取25~35min,放置常温后,用体积分数45~55%甲醇水溶液补足至100mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,制备供试品溶液;
(2)采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测,检测方法:精密吸取供试品溶液5μL,注入高效液相色谱仪,测定,记录100min的色谱图;
检测步骤包括如下色谱条件:
色谱柱:AdvanceBio Peptide Mapping(2.1×250mm,2.7μm)色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流动相:以乙腈-水溶液为流动相,按如下程序进行梯度洗脱:
0~10min,所述乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,所述乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,所述乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,所述乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,所述乙腈的体积百分比保持为90%。
流速:0.1~0.3mL/min;
柱温:35~45℃;
紫外检测波长:200~220nm。
在其中一示例中,中药组合物以质量份计,原料组成包括:人参170~171份、黄芪340~342份、白术51~52份、茯苓51~52份、泽泻51~52份、清半夏170~171 份、羌活85~86份、独活85~86份、防风85~86份、柴胡51~52份、黄连34~35 份、白芍85~86份、陈皮68~69份、炙甘草170~171份、生姜49~51份、大枣 99~101份。
在其中一示例中,中药组合物的剂型为颗粒剂。
在其中一示例中,颗粒剂的制备步骤包括:
(1)按照中药组合物的原料组成取各药材;
(2)将白术、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜等12味药材加水煎煮2~4次,第一次加10倍量水煎煮1~3小时,同时提取挥发油,另器保存。第二、三次加8倍量水各煎煮0.5~1.5小时,煎液滤过,滤液减压浓缩成密度约1.15(60-65℃)的稠膏,放冷后,加乙醇使含醇量为55~65%,搅拌均匀,静置12-72小时,取上清液,减压浓缩至相对密度约为1.2(60-65℃)稠膏1;
将人参、黄芪、茯苓、大枣四味药材加水煎煮2~4次,第一次加10倍量水煎煮0.5~1.5小时,第二,三次加8倍量水各煎煮0.5~1.5小时,煎液滤过,滤液减压浓缩成相对密度约1.2(60-65℃)的稠膏2;
合并稠膏1与稠膏2,制粒,加入挥发油并密封存放,制备颗粒剂。
本发明还提供一种中药组合物的检测方法,中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
中药组合物的检测方法包括如下步骤:
称取待测中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备得到待测品溶液;
采用高效液相色谱法对待测品溶液进行检测;
高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
可以理解地,采用高效液相色谱法对待测品溶液进行检测所获得的图谱,可以根据需要进行数据分析。如进行单一待测品的检测,并与上述指纹图谱建立方法建立的指纹图谱进行比较,以获得该单一待测品的质量;或进行多批待测品的检测,互相比较多批待测品的图谱,获得多批待测品之间的相似度。
可以理解地,上述中药组合物的检测方法的技术方案类似前述中药组合物的指纹图谱建立方法,其中待测品溶液的制备同供试品溶液的制备,在此不再赘述。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、辅料、试剂等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
实施例1中药组合物的指纹图谱建立方法
1、仪器、试剂与试药
(1)仪器
AgiLent 1260高效液相色谱仪;
AdvanceBio Peptide Mapping(2.1×250mm,2.7μm)色谱柱;
超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司,JP-060);
BS224S电子天平(Sartorius);
Synergy超纯水机(广州东锐科技)。
(2)试剂
乙腈(色谱纯,Merck公司);
超纯水(实验室自制);
甲醇(分析纯,广州化学试剂厂)。
(3)试药
益肾化湿颗粒(广州康臣药物研究有限公司,批号:20180303、20180301、20180302、20180401、20180402、20180403、20180404、20180501、20180502、20180503)。该益肾化湿颗粒的制备方法如下:
1)准备如下药材:人参170.5g、黄芪341g、白术51.1g、茯苓51.1g、泽泻 51.1g、清半夏170.5g、羌活85.2g、独活85.2g、防风85.2g、柴胡51.1g、黄连 34.1g、白芍85.2g、陈皮68.2g、炙甘草170.5g、生姜50g、大枣100g;
2)将白术、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜12味药材加水煎煮3次:第一次加10倍量水煎煮2小时,同时提取挥发油,另器保存;第二、三次加8倍量水各煎煮1小时,煎液滤过,滤液减压浓缩成相对密度约1.15(60-65℃)的稠膏,放冷后,加乙醇使含醇量为60%,搅拌均匀,静置24小时,取上清液,减压浓缩至相对密度约为1.2(60-65℃)的稠膏1;
将人参、黄芪、茯苓、大枣4味药材加水煎煮3次:第一次加10倍量水煎煮1小时,第二、三次加8倍量水各煎煮1小时,煎液滤过,滤液减压浓缩成相对密度约1.2(60-65℃)的稠膏2;
将稠膏1与稠膏2于60℃加热合并,收膏,加糊精至制剂处方量,喷雾制粒,干燥,整粒,制成颗粒,总混,喷入挥发油,密封存放,颗粒按分装,包装即得。
2、指纹图谱构建
2.1色谱条件的建立
(1)紫外检测波长的确定
精密称定益肾化湿颗粒0.5g,加入50%甲醇水溶液定容至100mL,超声提取30min,放置常温后,用50%甲醇水溶液补足至100mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。进样测定,以乙腈-水溶液为流动相,按表2中的规定进行梯度洗脱,流速为0.2mL/min;柱温为40℃;进样量为5μL。
表2梯度洗脱
分别考察紫外波长为203nm、258nm、280nm和300nm的色谱图,结果见图1。
结果显示,203nm波长下的色谱峰较多,表观峰度较高,且基线相对平稳,故选择203nm作为本实施例的紫外检测波长。
(2)柱温的确定
进样测定,以乙腈-水溶液为流动相,按表2中的规定进行梯度洗脱,流速为0.2mL/min;紫外检测波长为203nm;进样量为5μL。
分别考察柱温为30℃、35℃和40℃的色谱图,结果见图2。
结果显示,温度为40℃时,柱压相对较低,比较安全,且分离情况较好,故选择40℃作为本实施例的柱温。
(3)色谱条件的确定
色谱柱:AdvanceBio Peptide Mapping(2.1×250mm,2.7μm)色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流动相:以乙腈-水溶液为流动相,按表2中的规定进行梯度洗脱;
流速:0.2mL/min
柱温:40℃;
紫外检测波长:203nm;
测定方法:精密吸取供试品溶液5μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图。
2.2供试品的制备
(1)提取溶剂的考察
本次实验分别考察了不同提取溶剂对特征图谱的影响,选取体积分数分别为30%、50%和70%甲醇水溶液作为提取溶剂,比较采用不同提取溶剂的色谱图结果。
取益肾化湿颗粒0.5g,精密称定,分别加入30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液定容至100mL,超声提取30min,放置常温后,分别用相应溶剂补足至100mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。进样测定,以乙腈-水溶液为流动相,按表2中的规定进行梯度洗脱,流速为0.2mL/min;柱温为40℃;紫外检测波长为203nm;进样量为5μL。结果见图3。
从图3可以看出,以50%甲醇水溶液作为提取溶剂时,特征峰峰面积最大,故选择50%甲醇水溶液作为提取溶剂。
(2)供试品制备方法的确定
精密称定益肾化湿颗粒0.5g,加入50%甲醇水溶液定容至100mL,超声提取30min,放置常温后,用50%甲醇水溶液补足至100mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
3、方法学验证
(1)精密度考察
取益肾化湿颗粒(批号:20180301)约0.5g,制备供试品溶液,连续进样6 次进行测定,采用指纹图谱软件进行相似度评价,实验结果见表3,图4。
表3精密度考察实验结果
结果显示,色谱图的相似度均大于0.95,表明实验方法的精密度良好。
(2)重现性考察
精密称定6份益肾化湿颗粒(批号:20180301),每份0.5g,平行制备6份供试品溶液,分别进样测定,采用指纹图谱软件进行相似度评价,实验结果见表 4,图5。
表4重现性考察实验结果
结果显示,色谱图的相似度均大于0.95,表明实验方法重现性良好。
(3)稳定性考察
取益肾化湿颗粒(批号:20180301)约0.5g,制备供试品溶液,于室温下放置,分别在0h、4h、8h、24h、48h进样测定,采用指纹图谱软件进行相似度评价,实验结果见表5,图6。
表5稳定性考察测试结果
结果显示,色谱图的相似度均大于0.95,表明供试品溶液在48h内稳定。
4、指纹图谱测定
4.1实验步骤
(1)取10批益肾化湿颗粒,按“指纹图谱构建”项下规定制备供试品溶液,进样测定,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统,2004A版》进行匹配,建立所述制剂的对照指纹图谱,如图7所示。通过对指纹图谱进行对比分析,标定出17个共有的特征峰,如图8所示;其中峰6面积最大,分离较好,保留时间适中且稳定,因而选择峰6作为参照。
(2)将峰6的保留时间和峰面积定为1,计算其它色谱峰的相对保留时间、相对峰面积,结果见表6和表7。
表6 10批益肾化湿颗粒的17个共有峰的相对保留时间
表7 10批益肾化湿颗粒的17个共有峰的相对峰面积
(3)将10批益肾化湿颗粒的指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统,2004A版》进行共有峰匹配,计算不同批号益肾化湿颗粒的指纹图谱之间的相似度,结果见表8。
表8 10批益肾化湿颗粒指纹图谱相似度
结果表明,不同批号益肾化湿颗粒的色谱图之间的相似度均大于0.950,表明相似度良好。
(4)益肾化湿颗粒与原料中包含的十六味药材的相关性及特征峰的归属
取原料中包含的十六味药材,精密称定与处方相应量各药材,分别加入50%甲醇水溶液定容至100mL,超声提取30min,放置常温后,分别用50%甲醇水溶液补足至100mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得各药材对照品溶液,按“色谱条件的确定”项下规定进样测定,得到各药材的指纹图谱。
将益肾化湿颗粒的指纹图谱与原料中各药材的指纹图谱进行比对,结果见图9,所得益肾化湿颗粒的指纹图谱包含的17个特征峰中,检出与原料中各药材的指纹图谱相同的特征峰共17个。依据原料中各药材的指纹图谱对益肾化湿颗粒的指纹图谱进行特征峰归属,结果见表1。
结果显示,本发明建立的中药组合物的指纹图谱,原料中的各个药材的化学成分均得到体现,与药材之间具有良好的相关性。
本申请通过以上研究,确立了所述中药组合物的指纹图谱方法,并建立了所述中药组合物的指纹图谱。通过对多批次样品的测定实验证明该方法具有较好的精密度、重现性、稳定性,针对该中药组合物提供了比常规质量标准更深层次的质量评价依据。
实施例2中药组合物的检测方法
取待测益肾化湿颗粒(广州康臣药物研究有限公司,批号:20201207、 20201208、20201209、20201218、20201219、20201220),按照实施例1“供试品制备方法的确定”项下方法制成待测样品。
按实施例1“色谱条件的确定”项下方法进行检测,得到待测益肾化湿颗粒的指纹图谱,将6批益肾化湿颗粒的指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统,2004A版》进行共有峰匹配,计算该6批益肾化湿颗粒的指纹图谱之间的相似度,结果见图10,表9。
表9 6批益肾化湿颗粒指纹图谱相似度
结果显示,6批益肾化湿颗粒的指纹图谱相似度均大于0.990,说明该6批益肾化湿颗粒重复性良好,批间差异小。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.一种中药组合物的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
所述指纹图谱建立方法包括如下步骤:
称取所述中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备供试品溶液;
采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测,建立指纹图谱;
所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述梯度洗脱包括如下程序:
0~10min,所述乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,所述乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,所述乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,所述乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,所述乙腈的体积百分比保持为90%。
3.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述高效液相色谱法还包括如下检测条件:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.1~0.5mL/min;
柱温:30~45℃;
紫外检测波长:200~320nm。
4.根据权利要求3所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述高效液相色谱法的柱温为35~45℃,紫外检测波长为200~300nm。
5.根据权利要求1~4任一项所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述提取溶剂为体积分数40~60%甲醇水溶液。
6.根据权利要求1~4任一项所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,提取的方法为超声提取20~40min。
7.根据权利要求1~4任一项所述的指纹图谱建立方法,其特征在于,所述指纹图谱,包括17个特征峰,以峰6作为参照,17个特征峰的相对保留时间分别为:
峰1:0.353±0.019%;峰2:0.491±0.018%;峰3:0.582±0.021%;
峰4:0.758±0.032%;峰5:0.908±0.016%;峰6:1.000±0.000%;
峰7:1.103±0.036%;峰8:1.273±0.026%;峰9:1.354±0.032%;
峰10:1.540±0.049%;峰11:1.585±0.054%;峰12:1.720±0.047%;
峰13:1.770±0.038%;峰14:1.875±0.023%;峰15:1.890±0.021%;
峰16:1.982±0.046%;峰17:2.435±0.035%。
8.一种中药组合物的检测方法,其特征在于,所述中药组合物的原料组成包括:人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、清半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜和大枣;
所述中药组合物的检测方法包括如下步骤:
称取待测中药组合物,以提取溶剂进行提取,过滤,取续滤液,制备待测品溶液;
采用高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测;
所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的中药组合物的检测方法,其特征在于,所述梯度洗脱包括如下程序:
0~10min,所述乙腈的体积百分比由5%上升至15%;
10~30min,所述乙腈的体积百分比由15%上升至20%;
30~50min,所述乙腈的体积百分比由20%上升至30%;
50~80min,所述乙腈的体积百分比由30%上升至90%;
80~95min,所述乙腈的体积百分比保持为90%。
10.根据权利要求8所述的中药组合物的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱法还包括如下检测条件:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.1~0.5mL/min;
柱温:30~45℃;
紫外检测波长:200~320nm。
11.根据权利要求10所述的中药组合物的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱法的柱温为35~45℃,紫外检测波长为200~300nm。
12.根据权利要求8~11任一项所述的中药组合物的检测方法,其特征在于,所述提取溶剂为体积分数40~60%甲醇水溶液。
13.根据权利要求8~11任一项所述的中药组合物的检测方法,其特征在于,提取的方法为超声提取20~40min。
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