CN109633006B - 胃疡宁指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胃疡宁指纹图谱的构建方法及其应用，属于中药质量监控技术领域。该构建方法，包括以下步骤：(1)称取去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素、α‑香附酮对照品中的一种作为参考品，配制参考品溶液；(2)称取若干批次胃疡宁丸为供试品，制得相应批次供试品溶液；(3)吸取上述参考品溶液和若干批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪以预定液相条件测定，构建得到由上述共有特征峰构成的胃疡宁指纹图谱。上述胃疡宁指纹图谱的构建方法，以参考品所对应参考峰的保留时间和峰面积为基准，对其它共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，从而对胃疡宁中多组分的复杂体系进行全面的评价。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量监控技术领域，特别是涉及一种胃疡宁指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
基于中医药理论的中药组合物(中成药)，其药味组成一般比较繁多；在药物组合物的制备过程中，不同成分之间还可能相互发生反应，导致药物组合物的成分更加复杂。仅靠定性或定量检测其中某个或某几个成分，由于信息量有限，难以体现组合物作为整体的化学特征。
随着现代分析技术的发展，指纹图谱已经成为评价多组分中药组合物样品的整体质量的有效手段。美国食品药品管理局(FDA)在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料，德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会也都将指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。因此，建立指纹图谱对于中药组合物的质量控制和研究具有重要意义。
中药组合物指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发性和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。2015版《中国药典》收载了中成药品种共计1440个，但是仅收载了高效液相指纹图谱22项，其中中成药仅15项。可见中成药指纹图谱的建立，绝非易事，需要解决众多的技术问题，花费大量的劳动。
胃疡宁丸，是一种由乌药、白术(制)、山药(炒)、白及、青皮、香附、赤芍、高良姜、仙鹤草、甘草、珍珠层粉和五指毛桃12味中药材组成的中药组合物。具有温中散寒，理气止痛，制酸止血的作用，用于胃脘胀痛或刺痛，呕吐反酸。胃疡宁丸现执行标准为《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册，标准编号：WS3-B-3935-98，标准中仅有显微鉴别、化学鉴别。
然而，上述药品标准是对个别成分进行的鉴别，无法全面表征胃疡宁丸的化学特征和质量情况。因此，有必要研究如何建立胃疡宁丸的指纹图谱，从而更好地保证临床用药的质量和治疗效果。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种胃疡宁指纹图谱的构建方法及检测方法，采用该方法，能够实现全面评价胃疡宁丸这样多组分中药组合物的整体质量，从而对胃疡宁丸进行有效的质量监控。
一种胃疡宁指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)参考品溶液的配制：
精密称取去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素、α-香附酮对照品中的一种作为参考品，配制参考品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密称取若干批次胃疡宁丸为供试品，分别以有机溶剂提取，即得相应批次供试品溶液；
(3)构建指纹图谱：
分别吸取上述参考品溶液和若干批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪以预定液相条件测定，分别得到参考品色谱图和各批次供试品色图谱；以各批次供试品色图谱中共有的色谱峰作为共有特征峰，以参考品的色谱峰保留时间为参考，确定供试品色图谱中相应的色谱峰为参考峰，以所述参考峰的保留时间和峰面积为基准，对其它共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，构建得到由上述共有特征峰构成的胃疡宁指纹图谱。
上述胃疡宁指纹图谱的构建方法，选取去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素、α-香附酮中的一种作为参考品，以参考品所对应参考峰的保留时间和峰面积为基准，对其它共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，从而对胃疡宁中多组分的复杂体系进行全面的评价，能全面表征胃疡宁的化学特征和质量情况，进而对胃疡宁质量进行整体描述和评价。
可以理解的，具体选取的胃疡宁丸批次可根据具体情况选择，通常情况下选取10个以上批次，能够较好的反应该中药组合物的整体情况。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，所述供试品溶液通过以下方法制备得到：取胃疡宁丸粉碎，精密称定，加硅藻土分散研细，置于容器中，精密加入甲醇，称重，超声处理，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中，所述液相条件包括：
固定相：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。
在其中一个实施例中，所述色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱，规格为4.6×250mm，填料粒径为5μm；
所述梯度洗脱条件为：
0min-30min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；
30min-72min，流动相A的体积百分数由20％变化至35％；
72min-130min，流动相A的体积百分数由35％变化至75％。
在其中一个实施例中，所述液相条件还包括：
流速：0.8±0.1ml/min；
柱温：25±3℃；
紫外检测波长：230±2nm；
进样量：10±2μL。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，所述参考品为橙皮苷。橙皮苷峰面积较大，分离较好且稳定，因此以其作为参考品。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中，以共有特征峰的保留时间与橙皮苷色谱峰保留时间的比值为相对保留时间，所述共有特征峰选自以下色谱峰：
本发明还公开了上述的胃疡宁指纹图谱的构建方法得到的胃疡宁指纹图谱。
本发明还公开了上述的胃疡宁指纹图谱在胃疡宁丸质量描述、评价和监控中的应用。
本发明还公开了一种胃疡宁指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)参考品溶液的配制：
配制与上述相对应的参考品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密称取待测胃疡宁丸为供试品，按照上述的方法制备供试品溶液；
(3)检测：
分别精密吸取上述参考品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪以预定液相条件测定；
(4)评价：将上述检测得到的供试品溶液色谱图与上述的胃疡宁指纹图谱的构建方法得到的胃疡宁指纹图谱进行比较，计算相似度，对胃疡宁的质量进行评价。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的胃疡宁指纹图谱的构建方法，选取去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素、α-香附酮中的一种作为参考品，以参考品所对应参考峰的保留时间和峰面积为基准，对其它共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，从而对胃疡宁中多组分的复杂体系进行全面的评价，能全面表征胃疡宁的化学特征和质量情况，进而对胃疡宁质量进行整体描述和评价。
本发明的胃疡宁指纹图谱的构建方法得到的胃疡宁指纹图谱和胃疡宁指纹图谱的检测方法，可用于对胃疡宁丸的质量进行描述、评价和监控。
将本发明的胃疡宁指纹图谱以相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.90，说明本发明专属性强、稳定性好与重现性良好。
附图说明
图1为实施例1中Waters symmetry C18色谱柱分离色谱图；
图2为实施例1中Agilent XDB plus C18色谱柱分离色谱图；
图3为实施例1中Phenomenex Luna C18色谱柱分离色谱图；
图4为实施例1中三款色谱柱分离色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为Waters symmetry C18、Agilent XDB plus C18和Phenomenex Luna C18色谱柱的分离色谱图；
图5为实施例1中乙腈-水系统分离色谱图；
图6为实施例1中乙腈-0.05％磷酸水系统分离色谱图；
图7为实施例1中乙腈-0.1％磷酸水系统分离色谱图；
图8为实施例1中甲醇-0.1％磷酸水系统分离色谱图；
图9为实施例1中四种流动相系统分离色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水和甲醇-0.1％磷酸水的分离色谱图；
图10为实施例1中波长226nm下的检测色谱图；
图11为实施例1中波长230nm下的检测色谱图；
图12为实施例1中波长235nm下的检测色谱图；
图13为实施例1中波长246nm下的检测色谱图；
图14为实施例1中波长266nm下的检测色谱图；
图15为实施例1中五种波长下的检测色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为226nm、230nm、235nm、246nm和266nm的分离色谱图；
图16为实施例1中柱温25℃下的检测色谱图；
图17为实施例1中柱温30℃下的检测色谱图；
图18为实施例1中柱温35℃下的检测色谱图；
图19为实施例1中三种柱温下的检测色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为25℃、30℃和35℃的分离色谱图；
图20为实施例1中流速0.6ml/min下的检测色谱图；
图21为实施例1中流速0.8ml/min下的检测色谱图；
图22为实施例1中流速1.0ml/min下的检测色谱图；
图23为实施例1中三种流速下的检测色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为0.6ml/min、0.8ml/min和1.0ml/min的分离色谱图；
图24为实施例1中进样体积5μl下的检测色谱图；
图25为实施例1中进样体积10μl下的检测色谱图；
图26为实施例1中进样体积15μl下的检测色谱图；
图27为实施例1中三种进样体积下的检测色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为5μl、10μl和15μl的分离色谱图；
图28为实施例1中甲醇超声提取检测色谱图；
图29为实施例1中乙醇回流提取检测色谱图；
图30为实施例1中甲醇回流提取检测色谱图；
图31为实施例1中三种制备方法检测色谱图叠加图；
其中：由下至上分别为甲醇超声、乙醇回流和甲醇回流的分离色谱图；
图32为实施例2中精密度考察叠加图；
图33为实施例2中重现性考察叠加图；
图34为实施例2中稳定性考察叠加图；
图35为实施例3中胃疡宁丸色谱峰共有模式叠加色谱图；
图36为实施例3中胃疡宁指纹图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例所用仪器与材料如下：
1仪器：
Agilent1200高效液相色谱仪，配置脱气机G1322A、四元泵G1311A、自动进样器G1329B、柱温箱G1316A、二极管阵列检测器G1315B；分离色谱柱：Waters symmetry-C18，(4.6×250mm，粒径5μm)；型超声仪(40KHz，昆山市)；电子天平(sartorius BS100S)；Synergy超纯水机(Millipore中国有限公司)。
2试剂：
乙腈、甲醇、磷酸(HPLC级，Merck公司)；超纯水；乙醇(分析纯)。
3样品、对照药材、标准品：
3.1胃疡宁丸：批号：EK1141、EK1151、EQ1221、FL1061、FL1081、O51006、E51005、E51006、E51007、F51001；均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供。
3.2对照药材：
下列对照药材购自中国食品药品检定研究院：仙鹤草批号120966-201307、乌药批号121096-201405、白术批号120925-201411、白及批号121262-201405、青皮批号121155-201103、赤芍12093-201303、香附121059-201407、甘草批号120904-201519、五指毛桃批号121486-201202、山药批号121137-201606、高良姜批号1263-201605。
3.3对照品：
下列对照品购自中国食品药品检定研究院：去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素、α-香附酮。
以下实施例所用中药组合物胃疡宁丸通过如下方法制备：
1、准备如下重量份的药材：乌药360重量份，白术(制)360重量份，山药(炒)360重量份，白及360重量份，青皮180重量份，香附180重量份，赤芍60重量份，高良姜90重量份，仙鹤草600重量份，甘草360重量份，珍珠层粉90重量份，五指毛桃600重量份；
2、以上十二味药材除珍珠层粉外，香附、青皮、高良姜用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油备用，药液滤过，滤液备用；白术、白及、乌药和山药粉碎成粗粉；其余仙鹤草等四味加水煎煮二次，每次2小时，滤过，滤液与上述滤液合并，浓缩成稠膏，与白术等粗粉混匀，干燥，加入珍珠层粉，混匀，粉碎成细粉，与上述挥发油混匀。每100g粉末加炼蜜80-100g，制成大蜜丸，即得。
实施例1
胃疡宁指纹图谱的构建方法的条件摸索和优化。
本实施例考察了不同的色谱柱、流动相系统、检测波长、柱温、流速、进样体积对色谱图的影响；考察了样品提取方式、提取溶剂、提取时间对成分的影响。
(1)色谱柱考察
1、方法。
在同一色谱条件下，考察同一规格(4.6×250mm，5μm)下的Waters symmetry C18色谱柱、Agilent XDB plus C18色谱柱、Phenomenex Luna C18色谱柱条件下的系统适用性。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如下梯度洗脱方式；
表1.梯度洗脱条件
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL。
2、考察结果。
上述Waters symmetry C18色谱柱、Agilent XDB plus C18色谱柱、PhenomenexLuna C18色谱柱的色谱图如图1-3所示，将上述色谱图合并叠加，如图4所示。
根据上述色谱图，综合考虑该3款色谱柱的分离度、色谱峰个数、色谱峰峰形及基线的稳定情况，确定选用分离度和色谱峰形较为理想的Waters symmetry C18色谱柱。
(2)流动相系统考察
1、方法。
在同一色谱条件下，考察乙腈(A相)-水(B相)、乙腈(A相)-0.05％磷酸水(B相)、乙腈(A相)-0.1％磷酸水(B相)、甲醇(A相)-0.1％磷酸水(B相)流动相系统条件下系统适用性。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以上述相互配合的流动相，采用如表1所示梯度洗脱方式洗脱；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL。
2、考察结果。
上述乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％磷酸水流动相系统的色谱图分别如图5-8所示，将上述色谱图合并叠加，如图9所示。
根据上述色谱图，综合考虑该4种条件下的色谱峰分离情况可知，乙腈系统对比甲醇系统洗脱效果好，色谱峰较多，分离结果较好；而0.1％磷酸水系统分离效果优于纯水和0.05％磷酸水系统，柱效、峰形和分离度更优，确定选择乙腈-0.1％磷酸水系统作为流动相系统。
(3)检测波长考察
1、方法。
根据组成化合物中不同的特征峰物质最大吸收波长，筛选出226nm、230nm、235nm、246nm、266nm波长进行比较，在同一色谱条件下检测系统适用性。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如表1所示梯度洗脱方式；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
进样量：10μL。
2、考察结果。
上述226nm、230nm、235nm、246nm、266nm波长下的色谱图分别如图10-14所示，将上述色谱图合并叠加，如图15所示。
根据上述色谱图，综合考察该5种波长下的色谱图可知，230nm下的色谱峰较多，表观峰度较高，且基线相对平稳，因此确定该波长为检测波长。
(4)柱温考察
1、方法。
在同一色谱条件下，考察柱温25℃、30℃、35℃条件下系统适用性。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如表1所示梯度洗脱方式；
流速：0.8ml/min；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL。
2、考察结果。
上述25℃、30℃、35℃柱温下的色谱图分别如图16-18所示，将上述色谱图合并叠加，如图19所示。
根据上述色谱图，综合考虑该3种条件下的色谱峰分离情况可知，25℃柱温下的色谱峰分离度更优，表观峰度较高，且基线相对平稳，因此选择柱温25℃作为该方法的检测温度。
(5)流速考察
1、方法。
在同一色谱条件下，考察流速0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min条件下系统适用性。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如表1所示梯度洗脱方式；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL。
2、考察结果。
上述0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min流速下的色谱图分别如图20-22所示，将上述色谱图合并叠加，如图23所示。
根据上述色谱图，综合考虑该3种条件下的色谱峰分离情况可知，0.8ml/min流速下的色谱峰分离度更优，表观峰度较高，且基线相对平稳，因此选择0.8ml/min作为该方法的检测流速。
(6)进样体积考察
1、方法。
在同一色谱条件下，考察进样体积5μl、10μl、15μl对系统适用性的影响。
提取方法：取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如表1所示梯度洗脱方式；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm。
2、考察结果。
上述进样体积5μl、10μl、15μl下的色谱图分别如图24-26所示，将上述色谱图合并叠加，如图27所示。
根据上述色谱图，综合考虑该3种条件下的色谱峰分离情况可知，进样体积10μl的色谱峰分离度优于15μl，基线相对平稳，且表观峰度较进样体积5μl的高，因此选择进样体积为10μl。
(7)样品制备方法考察。
(7.1)甲醇超声提取。
取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，加适量硅藻土分散研细，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(7.2)乙醇回流提取。
取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，加适量硅藻土分散研细，置于50ml的锥形瓶中，精密加入乙醇25ml，称重，加热回流提取1小时，放冷至室温用乙醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(7.3)甲醇回流提取。
取胃疡宁丸3g，粉碎，精密称定，加适量硅藻土分散研细，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，加热回流提取1小时，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在同一色谱条件下，考察三种提取方法制备的供试品溶液的色谱峰数量和峰值响应
所选用的色谱条件为：
色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，采用如表1所示梯度洗脱方式；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL。
上述甲醇超声提取、乙醇回流提取、甲醇回流提取的色谱图分别如图28-30所示，将上述色谱图合并叠加，如图31所示。
根据上述色谱图，综合考虑可知，甲醇比乙醇提取的成分色谱峰较多，甲醇溶剂超声提取效果与回流提取相似，但简单方便快速，因此选择甲醇超声提取方法。
综上，最终确定胃疡宁指纹图谱的构建方法中，所选用的前处理方法和液相色谱条件如下：
1、供试品溶液制备方法：
取胃疡宁丸粉碎，精密称定3g，加适量硅藻土分散研细，置于50ml的锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、液相条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流速：0.8ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：230nm；
进样量：10μL
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，按表1的梯度程序洗脱。
实施例2
胃疡宁指纹图谱检测方法的方法学考察。
(1)精密度。
取胃疡宁丸(批号F51001)，参照上述确定方法制备1份供试品，连续进样6次，测定色谱图，将所得色谱图合并叠加，如图32所示。
各共有特征峰中，以14号峰橙皮苷为参考峰，将其保留时间和峰面积定为1，分别对各共有特征峰相对保留时间和相对峰面积的变化情况进行考察，其相对保留时间如下表2所示，相对峰面积如表3所示。
表2.精密度相对保留时间
表3.精密度相对峰面积
| 共有峰号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 1 | 0.464 | 0.460 | 0.431 | 0.457 | 0.459 | 0.463 | 2.73 |
| 2 | 0.267 | 0.268 | 0.241 | 0.248 | 0.254 | 0.258 | 4.16 |
| 3 | 0.685 | 0.682 | 0.637 | 0.680 | 0.677 | 0.678 | 2.71 |
| 4 | 1.790 | 1.782 | 1.669 | 1.779 | 1.780 | 1.790 | 2.68 |
| 5 | 2.070 | 2.064 | 1.928 | 2.067 | 2.062 | 2.054 | 2.72 |
| 6 | 0.182 | 0.185 | 0.177 | 0.188 | 0.185 | 0.180 | 2.10 |
| 7 | 2.905 | 2.894 | 2.707 | 2.893 | 2.887 | 2.882 | 2.66 |
| 8 | 6.493 | 6.316 | 6.000 | 6.457 | 6.286 | 6.429 | 2.86 |
| 9 | 0.357 | 0.354 | 0.330 | 0.349 | 0.350 | 0.346 | 2.72 |
| 10 | 0.173 | 0.174 | 0.163 | 0.174 | 0.174 | 0.172 | 2.49 |
| 11 | 0.377 | 0.374 | 0.351 | 0.374 | 0.372 | 0.372 | 2.60 |
| 12 | 1.498 | 1.487 | 1.394 | 1.489 | 1.484 | 1.483 | 2.64 |
| 13 | 2.256 | 2.243 | 2.118 | 2.243 | 2.238 | 2.235 | 2.31 |
| 14S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 15 | 3.112 | 3.094 | 2.898 | 3.093 | 3.095 | 3.089 | 2.66 |
| 16 | 0.248 | 0.247 | 0.255 | 0.270 | 0.273 | 0.272 | 4.61 |
| 17 | 0.496 | 0.497 | 0.465 | 0.493 | 0.494 | 0.494 | 2.48 |
| 18 | 0.321 | 0.323 | 0.300 | 0.317 | 0.315 | 0.316 | 2.57 |
| 19 | 0.075 | 0.075 | 0.066 | 0.072 | 0.074 | 0.073 | 4.77 |
| 20 | 0.281 | 0.283 | 0.266 | 0.283 | 0.281 | 0.283 | 2.39 |
| 21 | 1.019 | 0.993 | 0.930 | 0.984 | 0.979 | 0.976 | 2.99 |
| 22 | 0.241 | 0.236 | 0.222 | 0.236 | 0.242 | 0.236 | 3.03 |
| 23 | 1.453 | 1.442 | 1.349 | 1.440 | 1.438 | 1.429 | 2.67 |
| 24 | 0.774 | 0.772 | 0.724 | 0.774 | 0.772 | 0.769 | 2.58 |
| 25 | 0.103 | 0.102 | 0.097 | 0.102 | 0.106 | 0.103 | 2.75 |
| 26 | 0.218 | 0.215 | 0.200 | 0.214 | 0.214 | 0.213 | 2.93 |
| 27 | 0.076 | 0.076 | 0.072 | 0.076 | 0.077 | 0.076 | 2.43 |
| 28 | 0.180 | 0.179 | 0.169 | 0.177 | 0.179 | 0.180 | 2.47 |
| 29 | 0.359 | 0.357 | 0.335 | 0.354 | 0.356 | 0.355 | 2.47 |
| 30 | 0.057 | 0.056 | 0.052 | 0.054 | 0.055 | 0.054 | 3.57 |
| 31 | 0.040 | 0.040 | 0.037 | 0.038 | 0.039 | 0.039 | 2.88 |
| 32 | 0.114 | 0.112 | 0.104 | 0.109 | 0.108 | 0.110 | 3.04 |
上述结果显示，在测定时间内，各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD小于5％，表明实验仪器的精密度良好。
(2)重现性
取胃疡宁丸(批号F51001)，平行制备6份供试品，参照上述方法测定色谱图，将所得色谱图合并叠加，如图33所示。
各共有特征峰中，以14号峰橙皮苷为参考峰，将其保留时间和峰面积定为1，分别对各共有特征峰相对保留时间和相对峰面积的变化情况进行考察。其相对保留时间如下表4所示，相对峰面积如表5所示。
表4.重现性相对保留时间
| 共有峰号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 1 | 0.109 | 0.109 | 0.109 | 0.109 | 0.109 | 0.109 | 0.12 |
| 2 | 0.163 | 0.163 | 0.163 | 0.162 | 0.162 | 0.163 | 0.20 |
| 3 | 0.218 | 0.218 | 0.218 | 0.217 | 0.218 | 0.218 | 0.17 |
| 4 | 0.258 | 0.257 | 0.258 | 0.257 | 0.257 | 0.257 | 0.20 |
| 5 | 0.424 | 0.422 | 0.423 | 0.422 | 0.423 | 0.422 | 0.18 |
| 6 | 0.554 | 0.552 | 0.553 | 0.552 | 0.553 | 0.552 | 0.13 |
| 7 | 0.610 | 0.608 | 0.608 | 0.607 | 0.608 | 0.608 | 0.13 |
| 8 | 0.674 | 0.672 | 0.673 | 0.671 | 0.673 | 0.673 | 0.12 |
| 9 | 0.759 | 0.756 | 0.758 | 0.757 | 0.757 | 0.757 | 0.12 |
| 10 | 0.822 | 0.820 | 0.822 | 0.821 | 0.822 | 0.822 | 0.07 |
| 11 | 0.911 | 0.910 | 0.911 | 0.911 | 0.911 | 0.911 | 0.04 |
| 12 | 0.928 | 0.927 | 0.928 | 0.928 | 0.927 | 0.927 | 0.05 |
| 13 | 0.973 | 0.973 | 0.973 | 0.973 | 0.973 | 0.974 | 0.02 |
| 14S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 15 | 1.033 | 1.031 | 1.032 | 1.032 | 1.032 | 1.031 | 0.08 |
| 16 | 1.061 | 1.061 | 1.060 | 1.060 | 1.061 | 1.060 | 0.02 |
| 17 | 1.143 | 1.142 | 1.143 | 1.143 | 1.142 | 1.142 | 0.03 |
| 18 | 1.221 | 1.221 | 1.220 | 1.221 | 1.221 | 1.221 | 0.06 |
| 19 | 1.295 | 1.294 | 1.293 | 1.295 | 1.295 | 1.294 | 0.06 |
| 20 | 1.555 | 1.554 | 1.552 | 1.555 | 1.554 | 1.554 | 0.07 |
| 21 | 1.577 | 1.574 | 1.574 | 1.576 | 1.574 | 1.574 | 0.08 |
| 22 | 1.711 | 1.710 | 1.708 | 1.711 | 1.711 | 1.710 | 0.06 |
| 23 | 1.939 | 1.936 | 1.935 | 1.938 | 1.937 | 1.936 | 0.07 |
| 24 | 2.032 | 2.033 | 2.030 | 2.033 | 2.034 | 2.032 | 0.08 |
| 25 | 2.330 | 2.329 | 2.326 | 2.330 | 2.330 | 2.327 | 0.07 |
| 26 | 2.384 | 2.383 | 2.380 | 2.383 | 2.384 | 2.381 | 0.07 |
| 27 | 2.416 | 2.415 | 2.412 | 2.415 | 2.416 | 2.413 | 0.07 |
| 28 | 2.452 | 2.450 | 2.448 | 2.451 | 2.452 | 2.449 | 0.07 |
| 29 | 2.480 | 2.479 | 2.475 | 2.479 | 2.480 | 2.477 | 0.07 |
| 30 | 2.641 | 2.639 | 2.636 | 2.640 | 2.641 | 2.638 | 0.07 |
| 31 | 2.691 | 2.689 | 2.686 | 2.690 | 2.690 | 2.688 | 0.07 |
| 32 | 2.738 | 2.737 | 2.733 | 2.737 | 2.737 | 2.735 | 0.07 |
表5.重现性相对峰面积
上述结果显示，在测定时间内，各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD小于5％，表明方法重现性良好。
(3)稳定性
取胃疡宁丸(批号F51001)，参照上述方法，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h测定色谱图，将所得色谱图合并叠加，如图34所示。
各共有特征峰中，以14号峰橙皮苷为参考峰，将其保留时间和峰面积定为1，分别对各共有特征峰相对保留时间和相对峰面积的变化情况进行考察。其相对保留时间如下表6所示，相对峰面积如表7所示。
表6.稳定性相对保留时间
表7.稳定性相对峰面积
上述结果显示，在24小时内测定，各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD小于5％，表明在测定时间内，供试品溶液稳定。
实施例3
胃疡宁指纹图谱的建立。
按照上述建立的指纹图谱检测方法，检测了10批胃疡宁丸(S1-S10)，使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012版》软件，生成了胃疡宁丸色谱共有模式，叠加的色谱图见图35所示。并用相对保留时间标定了HPLC对照图谱中的32个共有峰，如图36所示，即为胃疡宁指纹图谱。
上述10批供试品检测图谱中，指纹图谱共有特征峰中，14号峰(橙皮苷吸收峰)峰面积较大，分离较好且稳定，因而选择该橙皮苷色谱峰作为参考峰。上述10批供试品的共有特征峰的相对保留时间如下表8所示，相对峰面积如表9所示。
表8. 10批胃疡宁丸共有特征峰相对保留时间
表9. 10批胃疡宁丸共有特征峰相对峰面积
上述结果显示，10批胃疡宁丸32个共有峰保留时间的RSD均小于1.0％，相对峰面积的RSD小于5.0％。
实施例4
胃疡宁指纹图谱的评价。
对上述10批胃疡宁指纹图谱进行相似度评价，具体为：
以S1(批号：EK1141)样品图谱为参照图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012版》软件评价10批胃疡宁丸指纹图谱，结果见表10。
表10. 10批胃疡宁丸样品相似度比较结果
数据显示10批次胃疡宁丸供试品的相似度都在0.99～1.0之间，未发现离群样本，符合国家食品药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。
实施例5
胃疡宁丸制剂产品与各种原药材的相关性特征峰归属。
(1)方法。
根据胃疡宁组方制备工艺方法，分别制备处方中各药材、阴性样品(即少加入某一药材制备得到的组方)以及对照品的供试品溶液，按上述建立指纹图谱方法，测定与制剂相应量各药材的指纹图谱以及阴性样品和对照品的图谱。
将获得的图谱通过比较药材与成品色谱峰保留时间及与阴性样品的对照，标示其对共有峰的贡献，保留时间RSD值小于1％的峰即为胃疡宁丸样品指纹图谱在药材图谱上的归属峰，同时与阴性样品色谱图比较，阴性样品中无干扰的，即为该味药材的特有峰。利用上述方法对胃疡宁丸中各峰进行药材及对照品归属。
(2)结果。
在胃疡宁指纹图谱的32个共有特征峰的归属如下表11所示。
表11. 10批胃疡宁丸样品32号共有峰特征化合物与药材峰归属
上述结果中，对比对照药材与阴性样品分析可知：5号峰去甲异波尔定、25号峰乌药醚内酯为乌药的特有峰，8号峰芍药苷为赤芍的特有峰，12号峰甘草苷为甘草的特有峰，14号峰橙皮苷为青皮的特有峰，29号峰高良姜素为高良姜的特有峰，31号峰α-香附酮为香附的特有峰。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种胃疡宁指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)参考品溶液的配制：
精密称取去甲异波尔定、芍药苷、甘草苷、橙皮苷、乌药醚内酯、高良姜素和α-香附酮对照品作为参考品，配制参考品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密称取若干批次胃疡宁丸为供试品，分别以甲醇提取，即得相应批次供试品溶液；
(3)构建指纹图谱：
分别吸取上述参考品溶液和若干批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以填料为碳十八烷基硅烷基键合硅胶，规格为4.6×250mm，填料粒径为5μm的Waters Symmetry C18色谱柱作为固定相；以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0min-30min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；
30min-72min，流动相A的体积百分数由20％变化至35％；
72min-130min，流动相A的体积百分数由35％变化至75％；
分别得到参考品色谱图和各批次供试品色图谱；以各批次供试品色图谱中共有的色谱峰作为共有特征峰，以参考品的色谱峰保留时间为参考，确定供试品色图谱中相应的色谱峰为参考峰，以所述参考峰的保留时间和峰面积为基准，对其它共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，构建得到由上述共有特征峰构成的胃疡宁指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的胃疡宁指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述供试品溶液通过以下方法制备得到：取胃疡宁丸粉碎，精密称定，加硅藻土分散研细，置于容器中，精密加入甲醇，称重，超声处理，放冷至室温用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.根据权利要求1所述的胃疡宁指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述液相条件还包括：
流速：0.8±0.1ml/min；
柱温：25±3℃；
紫外检测波长：230±2nm；
进样量：10±2μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的胃疡宁指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，以共有特征峰的保留时间与橙皮苷色谱峰保留时间的比值为相对保留时间，所述共有特征峰选自以下色谱峰：
5.一种胃疡宁指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)参考品溶液的配制：
配制与权利要求1中相对应的参考品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密称取待测胃疡宁丸为供试品，按照权利要求1中的方法制备供试品溶液；
(3)检测：
分别精密吸取上述参考品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪以权利要求1的液相色谱条件测定；
(4)评价：将上述检测得到的供试品溶液色谱图与权利要求1-4任一项所述的胃疡宁指纹图谱的构建方法得到的胃疡宁指纹图谱进行比较，计算相似度，对胃疡宁的质量进行评价。
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| CN109633006A (zh) | 2019-04-16 |
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