CN113759017A - 一种当归六黄汤的制备工艺及其评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种当归六黄汤的制备工艺及其评价方法，包括：至少采用特征图谱或指纹图谱的关键质量属性相似系数S_cqa作为评价指标对工艺参数进行评价；评价过程为：通过该特征图谱或指纹图谱的S_cqa值筛选出数量最多的值更接近数值1的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺参数为最佳工艺参数；其中，S_cqa值＝供试品中各特征峰对应S峰的相对峰面积/标准汤剂中各特征峰对应S峰的相对峰面积。本发明能更加简便且准确的筛选出与临床标准汤剂中所含物质基础更为一致的产物所对应的工艺，通过对制备工艺进行评价，因此可以有效保证通过该工艺制备得到的物质基准实物或复方制剂能够与临床标准汤剂的物质基础保持一致，进而保证疗效的一致性。

Description

一种当归六黄汤的制备工艺及其评价方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种当归六黄汤的制备工艺及其评价方法。

背景技术

当归六黄汤为《古代经典名方目录(第一批)》其中之一，出自金·李东垣《兰室秘藏》，为治盗汗之圣药也。《兰室秘藏》记载当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏各等分，黄芪加倍。上为粗末，每服五钱，水两盏，煎至一盏，食前服，小儿减半服之。主治阴虚火旺之盗汗证。而现行的《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》中记载有中药经典名方可以不再做临床研究而直接申报生产，这恰好给医药行业指出了一条创新中药研究开发的途径。

同时，在国家药监局发布的《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报材料要求 (征求意见稿)》中，明确记载有如下规定：除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。上述经典名方物质基准是指以古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准。

但目前现有的药学研究思路都与临床实际应用并不一致，现有针对当归六黄汤的制备工艺通常是以出膏率、有效指标成分的含量、有效指标成分转移率最大值为指导，并以此对制备工艺进行研究，并没有与临床标准汤剂的具体成分组成进行综合比较研究。因此，现有公开的当归六黄汤制备工艺所得产物与其临床标准汤剂中所含的物质基础通常不太一致，进而无法保证临床疗效的一致性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中当归六黄汤的制备工艺通常是以出膏率、有效指标成分的含量、有效指标成分转移率最大值为指导，导致产物与临床标准汤剂中所含物质基础不一致的缺陷；从而提供一种能够更加简便且准确的筛选出与临床标准汤剂中所含物质基础更为一致的产物所对应工艺的工艺评价方法。

一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，包括：至少采用特征图谱或指纹图谱的关键质量属性相似系数S_cqa作为评价指标对工艺参数进行评价；评价过程为：通过该特征图谱或指纹图谱的S_cqa值筛选出数量最多的值更接近数值1的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺参数为最佳工艺参数；

其中，特征图谱或指纹图谱的关键质量属性相似系数S_cqa的获取过程为：获得当归六黄汤的标准汤剂和供试品；该标准汤剂为古法汤剂，该供试品为采用对应工艺参数制备得到的当归六黄汤的物质基准实物或复方制剂；将标准汤剂和供试品进行特征图谱或指纹图谱检测，采用标准汤剂具有的一种成分作为指标成分，采用该指标成分所对应的特征峰作为S峰，获得供试品和标准汤剂的特征图谱或指纹图谱的各个特征峰相对于S 峰的相对峰面积，根据各特征峰的相对峰面积计算S_cqa值，S_cqa值＝供试品中各特征峰对应S峰的相对峰面积/标准汤剂中各特征峰对应S峰的相对峰面积。

其中，特征图谱或指纹图谱的S_cqa值的数量与特征图谱或指纹图谱中特征峰的数量相同，一个特征峰对应一个S_cqa值。具体的，特征图谱或指纹图谱的S_cqa中，特征峰1 的S_cqa值＝供试品中特征峰1对应S峰的相对峰面积/标准汤剂中特征峰1对应S峰的相对峰面积。本发明中的物质基准实物是指生产过程中获得的中间物，如：提取液、浓缩液、浸膏、干燥粉剂等中间制剂，该复方制剂是指含有辅料的颗粒剂、粉剂等成品制剂。

所述特征图谱或指纹图谱的检测方法为高效液相色图谱法，该高效液相色图谱法的色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；检测波长：230-250nm；以乙腈为流动相A，以0.04-0.12％体积浓度的磷酸水溶液为流动相B，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：

梯度洗脱程序中，A11为0～3％，A12为1～4％，A13为2～5％，A14为6～10％， A15为8～12％，A16为10～14％，A17为12～18％，A18为22～26％，A19为35～45％， A12＜A13＜A14＜A15＜A16＜A17。

在特征图谱或指纹图谱的检测方法中，所述色谱柱的柱长为100～150mm，内径为2.1mm，粒度为1.6～1.9μm，柱温为25℃～40℃；进样量为2μl～5μl；流速为0.2ml/min～0.4ml/min；理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

采用标准汤剂进行处理后获得标准溶液，采用供试品进行处理后获得供试品溶液，采用标准溶液和供试品溶液进行特征图谱或指纹图谱检测；

标准溶液的获取过程为：取标准汤剂，精密称定重量，在标准汤剂中精密添加醇溶液，摇匀，滤过，取续滤液即得标准溶液；

所述供试品为提取液或浓缩液时，供试品溶液的获取过程为：取供试品，精密称定重量，在供试品中精密添加醇溶液，且使溶液中含醇量达到10％～20％，摇匀，滤过，取续滤液即得标准溶液；

所述供试品为固体时，供试品溶液的获取过程为：取供试品，精密称定重量，在供试品中添加醇溶液，且使溶液中含醇量达到10％～20％，精密称定重量，超声处理，放冷，用醇溶液补足失重，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

所述标准汤剂的特征图谱或指纹图谱中具有不低于24个的特征峰，该特征峰中采用小檗碱所对应的特征峰作为S峰；

获取特征图谱或指纹图谱中所有特征峰相对于S峰的相对保留时间，设标准汤剂的特征图谱或指纹图谱中所有特征峰的相对保留时间为规定值，则供试品的特征图谱或指纹图谱中各个特征峰的相对保留时间在规定值的±8％之内；

所述规定值包括：0.103，0.117，0.285，0.397，0.408，0.598，0.612，0.624，0.666，0.750，0.796，0.815，0.832，0.815，0.959，1.000，1.095，1.177，1.277，1.347，1.376，1.385，1.450，1.467；

所述特征图谱或指纹图谱的S_cqa值为0.80～1.30。优选的，在0.80～1.30范围内数量最多的特征图谱或指纹图谱有两组以上时，采用S_cqa值在0.9～1.1范围内的数量最多的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺为最佳工艺，在0.9～1.1范围内数量最多的特征图谱或指纹图谱有两组以上时，筛选出最接近于1的数量最多的S_cqa值的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺为最佳工艺。

所述评价指标还包括有效指标成分的含量，有效指标成分的转移率，出膏率，或者特征图谱或指纹图谱的相似度中的至少一种；

当评价指标为有效指标成分的含量、有效指标成分的转移率或出膏率时，供试品的评价指标为标准汤剂对应的评价指标的±30％以内；

当评价指标为特征图谱或指纹图谱的相似度时，相似度范围为0.900～1.000。

所述有效指标成分的含量采用高效液相色图谱法进行检测，该高效液相色图谱法的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A，以0.04-0.12％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为250-300nm，理论板数按小檗碱计算应不低于5000；

梯度洗脱程序中，A21为0～4％，A22为5～8％，A23为8～12％，A24为12～17％，A25为25～30％，A26为38～42％，A27为80～100％，A21＜A22＜A23＜A24。

在含量测定方法中，所述色谱柱的柱长为100～150mm，内径为2.1mm，粒度为1.6～1.9μm，柱温为25℃～40℃；进样量为2μl～5μl；流速为0.2ml/min～0.4ml/min；理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

所述采用高效液相色图谱法进行检测时，采用的对照品溶液中的有效指标成分为：盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷；对照品溶液中的溶剂为醇溶液。

出膏率范围为25.47％～47.71％，收粉率范围为21.39％～48.01％，盐酸黄柏碱的含量范围为0.100％～0.500％，盐酸黄连碱的含量范围为0.100％～0.460％，盐酸小檗碱的含量范围为0.120％～1.110％，盐酸巴马汀的含量范围为0.103％～0.398％，黄芩苷的含量范围为0.450％～1.69％，汉黄芩苷的含量范围为0.12％～0.60％，阿魏酸的含量范围为0.010％～0.090％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量范围为0.003％～0.099％；

超高效液相指纹图谱的相似度范围为0.900～1.000。

当归六黄汤的制备工艺，包括：取当归六黄汤的原料加20倍水，煎煮前浸泡30min，加盖煎煮，武火沸腾后，改文火煎煮45min，煎煮一次，300目，趁热过滤，获取提取液，在60℃浓缩1.5h，冷冻干燥即可。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的了一种新的质量控制的指标S_cqa值，通过S_cqa值可以有效质控出不同生产工艺步骤制备得到的产物所含的物质基础是否与标准汤剂一致，因而可以用于评价不同制备工艺制备出的物质基准实物或复方制剂与标准汤剂的物质基础一致性，即可筛选出能够保证物质基础一致性的最佳制备工艺。具体的，可以通过S_cqa值比较每步工艺所得中间体与标准汤剂的相似性，当其值越接近数值1，表明所得中间体的关键质量属性指标与标准汤剂越一致，在工艺过程中造成的物质变化越小；进而有效促使经方制剂当归六黄汤的物质基准实物或复方制剂与传统的标准汤剂之间物质基础的差异减少，进而避免经方制剂当归六黄汤的临床疗效与传统汤剂存在较大差异，保证临床疗效的一致性；

同时，通过该S_cqa值的设置，可以更加简便、高效的选择出与传统的标准汤剂的物质基础最为接近的物质基准实物或复方制剂所对应的工艺作为优选工艺，提供更加简便有效的用于工艺筛选的工艺质控方法，有效缩短分析时间，节约成本。

2.本发明提供的评价方法中的S_cqa值，其不仅仅能够用于筛选出与传统的标准汤剂更为一致的物质基础最为接近的物质基准实物或复方制剂所对应的工艺，并且还能够有效监控物质基准实物或复方制剂的质量优劣，保证批与批之间成品质量的稳定性，从而最大程度保证所制备的当归六黄汤物质基准实物及复方制剂及复方制剂的安全性与有效性。

3.本发明提供的评价方法中不仅仅包括S_cqa值，还包括有效指标成分的含量、有效指标成分的转移率、出膏率、指纹图谱或特征图谱相似度等评价指标，通过该评价指标的进一步优化限定，例如限定供试品的出膏率范围为25.47％～47.71％，收粉率范围为21.39％～48.01％，盐酸黄柏碱的含量范围为0.10％～0.50％，盐酸黄连碱的含量范围为0.10％～0.46％，盐酸小檗碱的含量范围为0.12％～1.11％，盐酸巴马汀的含量范围为0.103％～0.398％，黄芩苷的含量范围为0.450％～1.69％，汉黄芩苷的含量范围为0.12％～ 0.60％，阿魏酸的含量范围为0.010％～0.090％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量范围为0.003％～0.099％，超高效液相指纹图谱的相似度范围为0.900～1.000；在上述参数条件范围内，可以更好的辅助筛选出最佳的制备工艺，更好的保证与临床标准汤剂的物质基础的一致性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明中标准汤剂的指纹图谱。

图2是本发明中不同浓缩温度制备得到的浓缩液的S_cqa结果。

图3是本发明中不同浓缩温度制备得到的浓缩液的指纹图谱。

图4是本发明中不同浓缩时间制备得到的浓缩液的S_cqa结果。

图5是本发明中不同浓缩时间制备得到的浓缩液的指纹图谱。

图6是本发明中不同干燥方式制备得到的干燥粉的S_cqa结果。

图7是本发明中不同干燥方式制备得到的干燥粉的指纹图谱。

具体实施方式

实施例1

一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，本实施例进行了标准汤剂的工艺研究和确定，并且还进行了浓缩步骤对当归六黄汤中物质基础的影响的考察，具体如下：

1、标准汤剂的工艺研究和确定

当归六黄汤出自《兰室秘藏》，为治盗汗之圣药也。方中记载煎煮方法为：“当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏各等分，黄芪加倍。上为粗末，每服五钱，水两盏，煎至一盏”。而根据文献调研及古代衡器(权)核算，按代剂量法换算比例(1钱＝4.13g， 1盏＝200ml)换算后，将当归六黄汤的临床标准汤剂的制备方法暂定为：以上药味，粉碎为粗末，加20倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，200～300目煎液滤过，立即冷却至室温，量取药液体积，体积范围为：加入水量一半，上下浮动10％。

通过以上对煎煮时间、次数、煎煮前浸泡时间等因素的考察确定标准汤剂的煎煮工艺为：以上七味，粉碎为过6目筛的粗末，加水400ml，煎煮前浸泡30min，加盖煎煮，武火沸腾后，改文火煎煮45min，煎煮1次，300目，趁热过滤，即得。

2、色谱条件的确认

2.1当归六黄汤高效液相指纹/特征图谱方法

色谱条件与系统适应性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.7μm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长：230nm。理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

表1梯度洗脱表

对照品溶液的制备取盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加15％甲醇制成每1ml含上述对照品各0.04mg、0.14mg的混合溶液，即得。

标准溶液的制备精密量取5ml标准汤剂置于10ml容量瓶中，加入15％甲醇适量，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备：

供试品为提取液时，精密量取5ml提取液置于10ml容量瓶中，加入15％甲醇适量，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品为浓缩液时，精密量取2ml浓缩液置于10ml容量瓶中，加入15％甲醇适量，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品为冻干粉时，取当归六黄汤冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟，放冷，再称定重量，用15％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取标准溶液、对照品溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2当归六黄汤物质基准含量测定方法

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm。理论板数按小檗碱计算应不低于5000。

表2梯度洗脱表

对照品溶液的制备取盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷加35％乙醇制成每1ml分别含盐酸黄柏碱80μg，盐酸黄连碱20μg，盐酸小檗碱6μg，盐酸巴马汀12μg，黄芩苷30μg，汉黄芩苷 60μg，阿魏酸6μg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷18μg的溶液，即得。

标准溶液的制备精密量取5ml标准汤剂至10ml容量瓶中，用35％乙醇定容至刻度，摇匀，即得

供试品溶液的制备：

供试品为提取液时，精密量取5ml提取液置于10ml容量瓶中，用35％乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品为浓缩液时，精密量取2ml浓缩液置于10ml容量瓶中，用35％乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品为冻干粉时，取当归六黄汤冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入35％乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用35％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、对不同批次的当归六黄汤的标准汤剂的物质基础进行检测

采用上述1中的标准汤剂的制备方法，对不同原料批次的当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏的中药饮片复配得到的方剂进行煎煮，获得20批次的标准汤剂。采用该20批次的标准汤剂进行采用上述2中的检测方法进行图谱和含量的检测。

其中，指纹/特征图谱方法检测得到的结果如下：

该20批标准汤剂均呈现24个特征峰，在24个特征峰中，以小檗碱相应的峰为S 峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，计算相对保留时间的规定值，保证所有标准汤剂的相对保留时间应在规定值的±8％之内，该规定值为：0.103(峰1)，0.117(峰2)，0.285(峰3)，0.397(峰4)，0.408(峰5)，0.598(峰6)，0.612(峰7)，0.624(峰8)， 0.666(峰9)，0.750(峰10)，0.796(峰11)，0.815(峰12)，0.832(峰13)，0.815(峰 14)，0.959(峰15)，1.000(峰16，S)，1.095(峰17)，1.177(峰18)，1.277(峰19)， 1.347(峰20)，1.376(峰21)，1.385(峰22)，1.450(峰23)，1.467(峰14)。其中，峰3：盐酸黄柏碱；峰4：木兰花碱；峰6：阿魏酸；峰11：盐酸黄连碱；峰13：表小檗碱；峰15：小檗红碱；峰16(S)：盐酸小檗碱；峰17：盐酸巴马汀；峰19：黄芩苷；峰23：汉黄芩苷。

其中，物质基准含量测定方法得到的结果如下：

该20批标准汤剂的出膏率范围为25.47％～47.71％，收粉率范围为21.39％～48.01％，盐酸黄柏碱的含量范围为0.100％～0.500％，盐酸黄连碱的含量范围为0.100％～ 0.460％，盐酸小檗碱的含量范围为0.120％～1.110％，盐酸巴马汀的含量范围为0.103％～ 0.398％，黄芩苷的含量范围为0.450％～1.69％，汉黄芩苷的含量范围为0.12％～0.60％，阿魏酸的含量范围为0.010％～0.090％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量范围为0.003％～ 0.099％。

4、浓缩步骤对当归六黄汤中物质基础的影响

4.1、浓缩温度对当归六黄汤中物质基础的影响

采用上述3中其中一批当归六黄汤标准汤剂作为本实施例的提取液，该标准汤剂的色谱图如图1所示。浓缩液的获取：取该提取液1200ml，平均分成四份，分别在50℃、 60℃、70℃、80℃四个温度下分别减压浓缩至100ml，得到当归六黄汤浓缩液。

取浓缩液制成供试品溶液，取同批次的标准汤剂制备成标准溶液，进行指纹图谱以及盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量检测。检测结果如图2-3和表3-表5所示。其中图3中S1-S4 依次为50℃、60℃、70℃、80℃浓缩条件下的浓缩液。

表3不同浓缩温度下有效指标成分含量比较

表4不同浓缩温度指纹图谱结果分析

表5不同浓缩温度指纹图谱相似度比较

浓度温度(℃)	50	60	70	80	标准汤剂
						50	1.000	0.996	0.996	0.996	0.997
60	0.996	1.000	1.000	1.000	1.000
						70	0.996	1.000	1.000	1.000	1.000
80	0.996	1.000	1.000	1.000	1.000
						标准汤剂	0.997	1.000	1.000	1.000	1.000

通过上述结果可知：浓缩温度在50℃、60℃、70℃、80℃时，盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量RSD均小于10％，浓缩温度在50℃、60℃、70℃、80℃时的指纹图谱与当归六黄汤标准汤剂指纹图谱相似度大于0.9，说明其浓缩液中物质种类与标准汤剂一致，浓缩温度考察指纹图谱S_cqa值结果及折线图可知，50℃、60℃样品时的24个特征峰均在0.80～1.30范围内，70℃、80℃样品个别特征峰不在0.80～1.30范围内，综合考虑，暂定当归六黄汤浓缩温度为60℃。

4.2、浓缩时间对当归六黄汤中物质基础的影响

采用上述3中其中一批当归六黄汤标准汤剂作为本实施例的提取液，取600ml提取液60℃温度下减压浓缩至1.5h、3h、4h，得到当归六黄汤浓缩液。取浓缩液稀释后进行盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量检测及指纹图谱检测，检测结果如图3-图4和表6-8所示。

表6不同浓缩时间下有效指标成分含量比较

表7不同浓缩时间指纹图谱结果分析

表8不同浓缩温度指纹图谱相似度比较

通过上述结果表明，在考察浓缩时间时，盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量RSD均小于10％，不同浓缩时间的特征图谱与当归六黄汤标准汤剂特征图谱成分一致，相对峰面积浓缩 1.5h大于浓缩3.0h、浓缩4.0h，浓缩温度考察指纹图谱S_cqa值结果及折线图可知，浓缩 1.5h样品时的24个特征峰均在0.80～1.30范围内，浓缩3.0h、4.0h样品个别特征峰不在0.80～1.30范围内，综合考虑，暂定当归六黄汤浓缩时间为1.5h。

4.3、三批验证

称取同批号的当归六黄汤标准汤剂按照浓缩温度60℃，浓缩时间1.5h制备得到三批次浓缩液。取浓缩液进行盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及指纹图谱相似度检测，检测结果如表9-10所示。下述浓缩液中指标成分的百分含量为(mg/ml)％。

表9工艺验证三批浓缩液指标成分含量

表10工艺验证三批浓缩液指纹图谱相似度比较

序号	验证1	验证2	验证3
				验证1	1.000	0.935	0.951
验证2	0.935	1.000	0.941
				验证3	0.951	0.941	1.000

结果表明：工艺验证三批浓缩液特征图谱与当归六黄汤标准汤剂特征图谱成分一致，三批浓缩液验证的指纹图谱S_cqa值结果见下表11所示。

表11浓缩三批验证指纹图谱结果分析

通过上述三批浓缩液验证的指纹图谱S_cqa值可知：三批浓缩液的24个特征峰均在0.80～1.30范围内，说明浓缩工艺稳定、可行。

4.4、小结

通过以上对浓缩温度、体积、时间等因素的考察确定浓缩工艺为：浓缩温度60℃，浓缩时间1.5h。

实施例2

一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，本实施例进行了干燥步骤对当归六黄汤中物质基础的影响的考察，具体考察过程如下：

1.1不同干燥方式的考察

采用实施例1中的最优工艺进行提取、浓缩，将所得浓缩液3份分别于60℃电热鼓风干燥箱、减压干燥箱、真空冷冻干燥机中进行干燥，得当归六黄汤物质基准常压干燥粉。所得干燥粉进行盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量检测及指纹图谱检测。检测方法和条件与实施例1相同。检测得到的有效指标成分的含量以及S_cqa结果以及指纹图谱相似度如表 12-14以及图6-7所示。下述干燥粉中指标成分的百分含量为(mg/g)％。

表12干燥方式考察有效指标成分含量

表13不同干燥方式指纹图谱结果比较

表14干燥方式考察与当归六黄汤标准汤剂对照图谱相似度

通过上述结果表明，减压干燥、常压干燥，冷冻干燥，除盐酸巴马汀、阿魏酸外，黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量 RSD均小于10％，不同干燥方式的特征图谱与标准汤剂特征图谱比较，只有冷冻干燥相似度大于0.900，不同干燥方式中，常压、减压干燥的S_cqa值折线图趋势与真空冷冻干燥不一致，真空冷冻干燥24个特征峰的S_cqa值均在0.80～1.30范围内，说明在干燥粉中物质种类与标准汤剂一致。综合考虑，暂定当归六黄汤干燥方式为冷冻干燥。

1.2三批次最佳干燥方式的验证

取浓缩液采用上述最佳干燥方式采用同批次的原料制备获得三批次干燥粉，采用干燥粉作为供试品进行盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量检测及指纹图谱相似度检测，检测结果如表 15-16所示。

表15工艺验证三批冻干粉出粉率及指标成分含量

表16工艺验证三批冻干粉指纹图谱相似度比较

上述结果表明：工艺验证三批冻干粉特征图谱与当归六黄汤标准汤剂特征图谱成分一致，提取、浓缩、冻干工艺稳定，具有重现性。

1.3小结

通过以上对不同干燥方式的考察确定最佳干燥工艺为：真空冷冻干燥。

实施例3

本实施例提供了对不同制备工艺条件下制备得到的当归六黄汤物质基准实物进行检测，包括实例1～实例10，并根据检测结果可以简单有效的实现当归六黄汤制备工艺的评价，进而筛选出最佳的制备工艺条件。

其中，特征图谱或指纹图谱的S_cqa检测的方法以及有效指标成分的含量的检测方法与实施例1中记载的方法相同，均是采用高效液相指纹图谱检测方法进行检测，检测条件与实施例1也完全相同，区别仅仅在于供试品不同。

实例1：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，浸泡1小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩1.5h(60℃)，60℃常压干燥，得到当归六黄汤物质基准实物样品1。

实例2：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过2号筛，煎煮剂量为4倍，浸泡0.5小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩1.5h，冻干，预冻温度为-20℃，冻干时长为35h，得到当归六黄汤物质基准实物样品2。

实例3：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，不浸泡，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液70℃浓缩，浓缩0.8h，减压干燥，得到当归六黄汤物质基准实物样品3。

实例4：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过1号筛，煎煮剂量为3倍，浸泡0.5小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液80℃浓缩，浓缩1h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为37h，得到当归六黄汤物质基准实物样品4。

实例5：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水22倍，前处理粒径为过6目筛，煎煮剂量为5倍，浸泡1.0小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液70℃浓缩，浓缩1h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为39h，得到当归六黄汤物质基准实物样品5。

实例6：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水21倍，前处理粒径为过1号筛，煎煮剂量为6倍，浸泡0.5小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液55℃浓缩，浓缩1h，冻干，预冻温度为-28℃，冻干时长为37h，得到当归六黄汤物质基准实物样品6。

实例7：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过6目筛，煎煮剂量为6倍，浸泡0.5小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩1.5h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为38h，得到当归六黄汤物质基准实物样品7。

实例8：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过3号筛，煎煮剂量为4倍，浸泡1.0小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩1.5h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为37h，得到当归六黄汤物质基准实物样品8。

实例9：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过1号筛，煎煮剂量为4倍，浸泡0.7小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩3h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为36h，得到当归六黄汤物质基准实物样品9。

实例10：按处方比例称取当归六黄汤饮片，加水20倍，前处理粒径为过6目筛，煎煮剂量为3倍，浸泡0.5小时，煎煮至药液量为加水量的一半，过滤，滤过药液60℃浓缩，浓缩1.0h，冻干，预冻温度为-25℃，冻干时长为38h，得到当归六黄汤物质基准实物样品10。

对上述样品1-10采用实施例1中记载的检测方法进行检测，检测结果如下表17和18所示。

表17

表18

综上可知：本发明可以评价上述实例1-实例10的制备工艺与标准汤剂关键质量属性的一致性，根据显示结果可知，样品2、6-8和10中24个峰都在0.8-1.3的范围值之内，均满足质控要求。且本实例2、6-8的当归六黄汤物质基准实物的S_cqa值中，有24 个峰在0.9-1.1的范围值之内，实例10有23个峰在0.9-1.1的范围值之内。在实例2、 6-8中，实例2中更接近数值1的S_cqa值的数量最多，因此，优选为实例2的制备工艺为最佳工艺。

实施例4

本实施例与实施例2的区别在于，检测的色谱条件不同，具体设置如下：

采用实施例2中最佳工艺条件制备得到的三批次当归六黄汤的物质基准实物分别进行以下特征图谱或指纹图谱检测，检测方法如下：

检测一、

1.1当归六黄汤高效液相指纹/特征图谱方法

色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.04％磷酸溶液为流动相B，按下表19中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟0.4ml；检测波长：240nm。理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

表19梯度洗脱表

1.2当归六黄汤物质基准含量测定方法

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.7μm)；乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表20中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；检测波长为280nm，柱温25℃。理论板数按小檗碱计算应不低于5000。

表20梯度洗脱表

检测二、

2.1当归六黄汤高效液相指纹/特征图谱方法

色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒度为1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表21中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长：250nm。理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

表21梯度洗脱表

2.2当归六黄汤物质基准含量测定方法

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒度为1.9μm)色谱柱乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表22中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；检测波长为275nm，柱温35℃。理论板数按小檗碱计算应不低于5000。

表22梯度洗脱表

检测三、

3.1当归六黄汤高效液相指纹/特征图谱方法

色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以体积浓度0.08％磷酸溶液为流动相B，按下表23中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟 0.4ml；检测波长：230nm。理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

表23梯度洗脱表

3.2当归六黄汤物质基准含量测定方法

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，(柱长为 150mm，内径为2.1mm，粒度为1.9μm)；乙腈为流动相A，以0.12％磷酸溶液为流动相B，按下表24中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.6ml；检测波长为280nm，柱温40℃。理论板数按小檗碱计算应不低于5000。

表24梯度洗脱表

通过上述检测一至检测三的方法分别对同一批次的当归六黄汤物质基准实物的干燥粉进行检测，检测结果如表25和表26所示。

表25

表26

通过检测结果对比可知，三批次当归六黄汤物质基准实物分别检测得到的S_cqa值的结果差异在5％以内，三批次当归六黄汤物质基准实物的出膏率和有效指标成分转移率的结果差异也在5％以内。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，包括：至少采用特征图谱或指纹图谱的关键质量属性相似系数S_cqa作为评价指标对工艺参数进行评价；评价过程为：通过该特征图谱或指纹图谱的S_cqa值筛选出数量最多的值更接近数值1的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺参数为最佳工艺参数；

其中，特征图谱或指纹图谱的关键质量属性相似系数S_cqa的获取过程为：获得当归六黄汤的标准汤剂和供试品；该标准汤剂为古法汤剂，该供试品为采用对应工艺参数制备得到的当归六黄汤的物质基准实物或复方制剂；将标准汤剂和供试品进行特征图谱或指纹图谱检测，采用标准汤剂具有的一种成分作为指标成分，采用该指标成分所对应的特征峰作为S峰，获得供试品和标准汤剂的特征图谱或指纹图谱的各个特征峰相对于S峰的相对峰面积，根据各特征峰的相对峰面积计算S_cqa值，S_cqa值＝供试品中各特征峰对应S峰的相对峰面积/标准汤剂中各特征峰对应S峰的相对峰面积。

2.根据权利要求1所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，所述特征图谱或指纹图谱的检测方法为高效液相色图谱法，该高效液相色图谱法的色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；检测波长：230-250nm；以乙腈为流动相A，以0.04-0.12％体积浓度的磷酸水溶液为流动相B，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：

梯度洗脱程序中，A11为0～3％，A12为1～4％，A13为2～5％，A14为6～10％，A15为8～12％，A16为10～14％，A17为12～18％，A18为22～26％，A19为35～45％，A12＜A13＜A14＜A15＜A16＜A17。

3.根据权利要求2所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，

在特征图谱或指纹图谱的检测方法中，所述色谱柱的柱长为100～150mm，内径为2.1mm，粒度为1.6～1.9μm，柱温为25℃～40℃；进样量为2μl～5μl；流速为0.2ml/min～0.4ml/min；理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

4.根据权利要求2或3所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，采用标准汤剂进行处理后获得标准溶液，采用供试品进行处理后获得供试品溶液，采用标准溶液和供试品溶液进行特征图谱或指纹图谱检测；

标准溶液的获取过程为：取标准汤剂，精密称定重量，在标准汤剂中精密添加醇溶液，摇匀，滤过，取续滤液即得标准溶液；

所述供试品为提取液或浓缩液时，供试品溶液的获取过程为：取供试品，精密称定重量，在供试品中精密添加醇溶液，且使溶液中含醇量达到10％～20％，摇匀，滤过，取续滤液即得标准溶液；

所述供试品为固体时，供试品溶液的获取过程为：取供试品，精密称定重量，在供试品中添加醇溶液，且使溶液中含醇量达到10％～20％，精密称定重量，超声处理，放冷，用醇溶液补足失重，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

5.根据权利要求2-4任一所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，所述标准汤剂的特征图谱或指纹图谱中具有不低于24个的特征峰，该特征峰中采用小檗碱所对应的特征峰作为S峰；

获取特征图谱或指纹图谱中所有特征峰相对于S峰的相对保留时间，设标准汤剂的特征图谱或指纹图谱中所有特征峰的相对保留时间为规定值，则供试品的特征图谱或指纹图谱中各个特征峰的相对保留时间在规定值的±8％之内；

所述规定值包括：0.103，0.117，0.285，0.397，0.408，0.598，0.612，0.624，0.666，0.750，0.796，0.815，0.832，0.815，0.959，1.000，1.095，1.177，1.277，1.347，1.376，1.385，1.450，1.467；

所述特征图谱或指纹图谱的S_cqa值在0.80～1.30范围内，优选的，在0.80～1.30范围内数量最多的特征图谱或指纹图谱有两组以上时，采用S_cqa值在0.9～1.1范围内的数量最多的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺为最佳工艺，在0.9～1.1范围内数量最多的特征图谱或指纹图谱有两组以上时，筛选出最接近于1的数量最多的S_cqa值的特征图谱或指纹图谱所对应的工艺即可。

6.根据权利要求1-5任一所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，所述评价指标还包括有效指标成分的含量，有效指标成分的转移率，出膏率，或者特征图谱或指纹图谱的相似度中的至少一种；

当评价指标为有效指标成分的含量、有效指标成分的转移率或出膏率时，供试品的评价指标为标准汤剂对应的评价指标的±30％以内；

当评价指标为特征图谱或指纹图谱的相似度时，相似度范围为0.900～1.000。

7.根据权利要求6所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，所述有效指标成分的含量采用高效液相色图谱法进行检测，该高效液相色图谱法的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A，以0.04-0.12％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为250-300nm，理论板数按小檗碱计算应不低于5000；

梯度洗脱程序中，A21为0～4％，A22为5～8％，A23为8～12％，A24为12～17％，A25为25～30％，A26为38～42％，A27为80～100％，A21＜A22＜A23＜A24；

在含量测定方法中，所述色谱柱的柱长为100～150mm，内径为2.1mm，粒度为1.6～1.9μm，柱温为25℃～40℃；进样量为2μl～5μl；流速为0.2ml/min～0.4ml/min；理论板数按小檗碱峰计算应不低于5000。

8.根据权利要求7所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，所述采用高效液相色图谱法进行检测时，采用的对照品溶液中的有效指标成分为：盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷；

对照品溶液中的溶剂为醇溶液。

9.根据权利要求8所述的一种当归六黄汤制备工艺的评价方法，其特征在于，

出膏率范围为25.47％～47.71％，收粉率范围为21.39％～48.01％，盐酸黄柏碱的含量范围为0.10％～0.50％，盐酸黄连碱的含量范围为0.10％～0.46％，盐酸小檗碱的含量范围为0.12％～1.11％，盐酸巴马汀的含量范围为0.103％～0.398％，黄芩苷的含量范围为0.450％～1.69％，汉黄芩苷的含量范围为0.12％～0.60％，阿魏酸的含量范围为0.010％～0.090％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量范围为0.003％～0.099％；

超高效液相指纹图谱的相似度范围为0.900～1.000。

10.采用权利要求1-9任一项所述的评价方法评价获得的当归六黄汤的制备工艺，其特征在于，包括：取当归六黄汤的原料加20倍水，煎煮前浸泡30min，加盖煎煮，武火沸腾后，改文火煎煮45min，煎煮一次，300目，趁热过滤，获取提取液，在60℃浓缩1.5h，冷冻干燥即可。

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