CN117571899A - 一种包含当归的中药组合物中的质量控制方法及其应用 - Google Patents
一种包含当归的中药组合物中的质量控制方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种包含当归的中药组合物的含量测定方法，该测定方法包括如下步骤：(1)取第一中药组合物供试品溶液、第一对照品溶液进行第一次检测，根据第一次检测结果，获得该第一中药组合物供试品溶液中该第一对照品的含量信息；(2)取第二中药组合物供试品溶液、第二对照品溶液进行第二次检测，根据第二次检测结果，获得该第二中药组合物供试品溶液中该第二对照品的含量信息；其中，该中药组合物包括当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，该第一对照品为盐酸黄柏碱和黄芩苷，该第二对照品为阿魏酸。本发明对包含当归的中药组合物的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含当归的中药组合物的质量控制方法及其应用。
背景技术
根据《中华人民共和国中医药法》，古代经典名方是指“至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂”。古代经典名方在我国有着历史悠久、丰富的人用历史并应用至今，是历代医家临床实践精华的总结，承载着数千年来中医药灿烂文明的深厚积淀，是中医药理论经过几千年的锤炼，是历代临床经验的总结，是中医药伟大宝库中最精华的部分。对中药经典名方进行深入的研究与开发，是挖掘传统中医药宝库的一把金钥匙。尤其在抗击新型冠状病毒过程中，中医药在经典名方的基础上筛选出有效方剂“三药三方”，如三方其中的清肺排毒汤是来自张仲景《伤寒杂病论》的经典名方组合，在治疗新冠患者以及预防上发挥了巨大的作用，凸显了中医药的优势。
中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的最常用的剂型，具有组方合理、起效迅速、疗效显著、易于吸收等优点，深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大，以及标准难以统一，严重影响其临床疗效等缺点，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势，克服汤剂的种种不足，国家药品监督管理局药品审评中心于2021年08月31日发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中明确指出按古代经典名方目录管理的中药复方制剂的质量应与经典名方基准样品的质量基本一致。基准样品代表了制剂的整体内在质量，除了成型工艺外，基准样品与制剂的其余质量控制指标均基本一致。因此基准样品是制剂内在质量的实物对照，是大生产工艺优化及其质量标准制定的参照物。基准样品是经典名方乃至所有中药研发的基准，是保证药物的安全性和有效性的对照物。经典名方复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定要以经典名方基准样品为参照。基准样品是沟通临床-企业-科研的纽带，是传承、应用和发扬传统中医药的基准。
指纹图谱是基于中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药指纹图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下，对中药材及中药产品进行质量控制。中药指纹图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素，以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣，更可用于中药生产过程的质量控制：追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
目前，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含当归的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究，现有技术中，仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效，故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的指纹图谱的质控方法控制其关键质量。
发明内容
基于此，本发明提供了一种包含当归的中药组合物的含量测定方法，该测定方法包括如下步骤：
(1)取第一中药组合物供试品溶液、第一对照品溶液进行第一次检测，该第一次检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，79％B；12～13min，78％B→57％B；13～37min，57％B→55％；37～38min，55％B→10％B；38～40min，10％B；40～41min，10％B→79％B；41～55min，79％B，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为20～40℃，检测波长为150～350nm，进样量为5～20μl；根据第一次检测结果，获得该第一中药组合物供试品溶液中该第一对照品的含量信息；
(2)取第二中药组合物供试品溶液、第二对照品溶液进行第二次检测，该第二次检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～38min，74％B→73％B；38～39min，73％B→10％B；39～41min，10％B；41～42min，10％B→74％B；42～55min，74％B；，流速为0.1～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm，进样量为5～20μl；根据第二次检测结果，获得该第二中药组合物供试品溶液中该第二对照品的含量信息；
其中，该中药组合物包括当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，该第一对照品为盐酸黄柏碱和黄芩苷，该第二对照品为阿魏酸。
在本发明中，流速、波长、温度、速率、时间、浓度、进样量、当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“30～50”时，所描述的范围应被解释为包括范围“30～50”、“30～45”、“30～40”、“30～35”、“35～50”、“35～45”、“35～40”、“40～50”、“40～45”、“45～50”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
进一步地，在步骤(1)中，该信息为根据所记录的该第一中药组合物供试品溶液的色谱图和该第一对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该第一中药组合物供试品溶液中该第一对照品的含量。进一步地，该盐酸黄柏碱的标准曲线为y＝88552x－9415，r2＝0.9998。进一步地，该黄芩苷的标准曲线为y＝36862x－97119，r2＝0.9998。进一步地，该第一中药组合物供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药组合物粉末，添加醇进行提取之后，放冷、补重、摇匀、过滤，取续滤液，得到该第一中药组合物供试品溶液。进一步地，该中药组合物粉末的质量为0.1～10g，例如约0.3g。进一步地，该中药组合物粉末与该醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.1～10):(10～60)，例如约0.3:约50。进一步地，该醇为甲醇。进一步地，该甲醇的质量体积百分比为10％～100％，例如约50％。进一步地，该提取为回流提取、冷浸提取、振摇提取和/或超声提取，例如回流提取，例如加热回流提取。进一步地，该加热回流提取的时间为10～60min，例如约30min。进一步地，该盐酸黄柏碱对照品溶液的制备方法包括：称取适量的盐酸黄柏碱，添加质量体积百分比为10％～100％例如约40％的甲醇配制成盐酸黄柏碱浓度为0.001～10mg/ml例如约0.01mg/ml的该盐酸黄柏碱对照品溶液。进一步地，该黄芩苷对照品溶液的制备方法包括：称取适量的黄芩苷，添加质量体积百分比为10％～100％例如约70％的甲醇配制成黄芩苷浓度为0.01～100mg/ml例如约0.15mg/ml的该黄芩苷对照品溶液。进一步地，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约1.0ml/min。进一步地，该柱温为25～35℃，例如约30℃。进一步地，该检测波长为180～240nm，例如210nm。进一步地，该进样量为8～12μl，例如约10μl。进一步地，该盐酸黄柏碱对应的色谱峰的理论塔板数不低于4000。进一步地，该盐酸黄柏碱对应的色谱峰的分离度大于2.0。进一步地，该色谱柱选自以下的一种：Kromasil100-5-C18柱、Kinetex 5umC18柱、Hypersil_GOLD柱、Agilent 5TC-C18柱和HALO AQ-C18柱。进一步地，该色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.3”包括0.3的±5％，或从0.285到0.315；“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5；“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约40”包括40的±5％，或从38到42；“约0.01”包括0.01的±5％，或从0.0095到0.0105；“约70”包括70的±5％，或从66.5到73.5；“约0.15”包括0.15的±5％，或从0.1425到0.1575；“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05；“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。
进一步地，在步骤(2)中，该信息为根据所记录的该第二中药组合物供试品溶液的色谱图和该第二对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该第二中药组合物供试品溶液中该第二对照品的含量。进一步地，该阿魏酸的标准曲线为y＝79017x+7596，r2＝0.9999。进一步地，该第二中药组合物供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药组合物粉末，添加水进行超声处理之后，用第一溶剂进行提取，得到第一溶液；将该第一溶液进行蒸干，得到残渣，将该残渣用第二溶剂进行溶解，定容，摇匀，得到该第二中药组合物供试品溶液。进一步地，该中药组合物粉末的质量为1～10g，例如约2g。进一步地，该中药组合物粉末与该水的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(10～70)，例如约2:约60。进一步地，该中药组合物粉末与该第一溶剂的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(10～30)，例如约2:约20。进一步地，该中药组合物粉末与该第二溶剂的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(5～20)，例如约2:约10。进一步地，该超声处理的功率为300～700W，例如约500W。进一步地，该超声处理的频率为20～60kHZ，例如约40kHZ。进一步地，该超声处理的时间为5～20min，例如约10min。进一步地，该第一溶剂为有机溶剂，例如乙酸乙酯。进一步地，该提取为回流提取、冷浸提取、振摇提取和/或超声提取，例如振摇提取。进一步地，该振摇提取的次数为2～7次，例如4次。进一步地，该第二溶剂为醇，例如甲醇。进一步地，该甲醇的质量体积百分比为10％～100％，例如约70％。进一步地，该阿魏酸对照品溶液的制备方法包括：称取适量的阿魏酸，添加质量体积百分比为10％～100％的甲醇例如约70％的甲醇配制成阿魏酸浓度为0.01～100mg/ml例如约0.05mg/ml的该阿魏酸对照品溶液。进一步地，该高效液相检测的该流速为0.5～1.0ml/min，例如约0.7ml/min。进一步地，该柱温为35～45℃，例如约40℃。进一步地，该检测波长为300～350nm，例如323nm。进一步地，该进样量为8～12μl，例如约10μl。进一步地，该阿魏酸对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。进一步地，该阿魏酸对应的色谱峰的分离度大于2.0。进一步地，该色谱柱选自以下的一种：Kromasil 100-5-C18柱、Kinetex 5um C18柱、Hypersil_GOLD柱、Agilent 5TC-C18柱和HALO AQ-C18柱。进一步地，该色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1；“约60”包括60的±5％，或从57到63；“约20”包括20的±5％，或从19到21；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约500”包括500的±5％，或从475到525；“约40”包括40的±5％，或从38到42；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约70”包括70的±5％，或从66.5到73.5；“约0.05”包括0.05的±5％，或从0.0475到0.0525；“约0.7”包括0.7的±5％，或从0.665到0.735。
进一步地，该流动相A为甲醇。进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液。进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液。进一步地，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105。
进一步地，该中药组合物粉末的制备方法包括：称取适量的当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，破碎至粗颗粒，加水浸泡，武火煎煮至沸，文火煎煮一段时间，得到煎煮液；以及将该煎煮液趁热过滤取滤液，减压浓缩至在15～25℃下相对密度为1.05～1.10的浸膏，预冻或速冻之后将该浸膏在冷冻干燥机中干燥，粉碎，过筛，混匀，得到该中药组合物粉末。进一步地，该当归、该生地黄、该熟地黄、该黄柏、该黄连、该黄芩与该黄芪之间的质量之比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～20)。进一步地，该当归、该生地黄、该熟地黄、该黄柏、该黄连、该黄芩与该黄芪之间的质量之比为约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约15.48。进一步地，该粗颗粒的直径为3～6mm，例如4～5mm。进一步地，该水与该包含当归的中药组合物的体积/质量之比为25～35，例如约29。进一步地，该浸泡的时间为10～100min，例如约60min。进一步地，该武火煎煮时加盖。进一步地，该文火煎煮时不加盖。进一步地，该文火煎煮的时间为10～100min，例如约50min。进一步地，该趁热过滤的温度为80～85℃。进一步地，该过滤为120目尼龙滤布单层过滤。进一步地，该滤液与该水的体积之比值为0.2～1，例如约0.5。进一步地，在该预冻或速冻之前，将该浸膏置于不锈钢盘中，使其铺料厚度为9～11mm。进一步地，该预冻为在≦-18℃冰柜中将该浸膏预冻过夜。进一步地，该速冻为使用液氮将该浸膏速冻至内无湿心。进一步地，该减压浓缩的温度不高于60℃。进一步地，该减压浓缩的真空度为-0.085～-0.099Mpa。进一步地，该冷冻干燥的冷阱温度不高于-40℃。进一步地，该冷冻干燥的真空度不高于100Pa。进一步地，该冷冻干燥至水分不高于8％。进一步地，该筛为三号筛。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约7.74”包括7.74的±5％，或从7.353到8.127；“约15.48”包括15.48的±5％，或从14.706到16.254；“约29”包括29的±5％，或从27.55到30.45；“约60”包括60的±5％，或从57到63；“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归的中药组合物的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：中药组合物供试品溶液的制备：称取适量的中药组合物粉末，加水溶解，超声处理之后，放冷、定容，摇匀，得到该中药组合物供试品溶液，其中，该中药组合物包括当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪；对照品溶液的制备：称取适量的盐酸巴马汀、盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、汉黄芩苷、阿魏酸和黄芩苷，添加甲醇配制成浓度分别为0.01～100mg/ml的该对照品溶液；根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱；该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，95％B→91％B；8～17min，91％B→81％B；17～33min，81％B；33～35min，81％B→73％B；35～49min，73％B→71％B；49～56min，71％B；56～74min，71％B→67％B；74～81min，67％B→52％B；81～95min，52％B→47％B；95～100min，47％B→10％B，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm，进样量为5～20μl。
进一步地，该中药组合物供试品溶液的制备中，该超声提取的功率为300～700W，例如约500W。进一步地，该超声提取的频率为20～60kHz，例如约40kHz。进一步地，该超声提取的时间为5～20min，例如约10min。进一步地，该对照品溶液中盐酸巴马汀的浓度为约0.06mg/ml。进一步地，该对照品溶液中盐酸药根碱的浓度为约0.06mg/ml。进一步地，该对照品溶液中表小檗碱的浓度为约0.075mg/ml。进一步地，该对照品溶液中盐酸黄连碱的浓度为约0.075mg/ml。进一步地，该对照品溶液中盐酸小檗碱的浓度为约0.075mg/ml。进一步地，该对照品溶液中盐酸黄柏碱的浓度为约0.075mg/ml。进一步地，该对照品溶液中汉黄芩苷的浓度为约0.1mg/ml。进一步地，该对照品溶液中阿魏酸的浓度为约0.1mg/ml。进一步地，该对照品溶液中黄芩苷的浓度为约0.15mg/ml。进一步地，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约1.0ml/min。进一步地，该柱温为25～35℃，例如约30℃。进一步地，该检测波长为200～250nm，例如225nm。进一步地，该进样量为8～16μl，例如约10μl。进一步地，该盐酸黄柏碱对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约500”包括500的±5％，或从475到525；“约40”包括40的±5％，或从38到42；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约0.06”包括0.06的±5％，或从0.057到0.063；“约0.075”包括0.075的±5％，或从0.07125到0.07875；“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105；“约0.15”包括0.15的±5％，或从0.1425到0.1575；“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05；“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。
进一步地，在该检测波长为225nm时，该指纹图谱包括1-15号峰，其中，15号峰为汉黄芩苷作为参照峰，1-15号峰的保留时间平均值分别对应为约15.96min、约26.90min、约28.07min、约32.19min、约43.44min、约44.37min、约58.67min、约63.35min、约69.90min、约75.17min、约77.14min、约80.11min、约86.74min、约90.48min和约94.44min。进一步地，在该检测波长为225nm时，该指纹图谱包括1-15号峰，其中，15号峰为汉黄芩苷作为参照峰，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、12号峰、13号峰和14号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.17、约0.28、约0.30、约0.34、约0.46、约0.47、约0.62、约0.67、约0.74、约0.80、约0.82、约0.85、约0.92、和约0.96。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约15.96”包括15.96的±5％，或从15.162到16.758；“约26.90”包括26.90的±5％，或从25.555到28.245；“约28.07”包括28.07的±5％，或从26.6665到29.4735；“约32.19”包括32.19的±5％，或从30.5805到33.7995；“约43.44”包括43.44的±5％，或从41.268到45.612；“约44.37”包括44.37的±5％，或从42.1515到46.5885；“约58.67”包括58.67的±5％，或从55.7365到61.6035；“约63.35”包括63.35的±5％，或从60.1825到66.5175；“约69.90”包括69.90的±5％，或从66.405到73.395；“约75.17”包括75.17的±5％，或从71.4115到78.9285；“约77.14”包括77.14的±5％，或从73.283到80.997；“约80.11”包括80.11的±5％，或从76.1045到84.1155；“约86.74”包括86.74的±5％，或从82.403到91.077；“约90.48”包括90.48的±5％，或从85.956到95.004；“约94.44”包括94.44的±5％，或从89.718到99.162；“约0.17”包括0.17的±5％，或从0.1615到0.1785；“约0.28”包括0.28的±5％，或从0.266到0.294；“约0.30”包括0.30的±5％，或从0.285到0.315；“约0.34”包括0.34的±5％，或从0.323到0.357；“约0.46”包括0.46的±5％，或从0.437到0.483；“约0.47”包括0.47的±5％，或从0.4465到0.4935；“约0.62”包括0.62的±5％，或从0.589到0.651；“约0.67”包括0.67的±5％，或从0.6365到0.7035；“约0.74”包括0.74的±5％，或从0.703到0.777；“约0.80”包括0.80的±5％，或从0.76到0.84；“约0.82”包括0.82的±5％，或从0.779到0.861；“约0.85”包括0.85的±5％，或从0.8075到0.8925；“约0.92”包括0.92的±5％，或从0.874到0.966；“约0.96”包括0.96的±5％，或从0.912到1.008；“约1.00”包括1.00的±5％，或从0.95到1.05。
进一步地，该当归、该生地黄、该熟地黄、该黄柏、该黄连、该黄芩与该黄芪之间的质量之比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～20)。进一步地，该当归、该生地黄、该熟地黄、该黄柏、该黄连、该黄芩与该黄芪之间的质量之比为约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约15.48。进一步地，该中药组合物粉末的制备方法包括：称取适量的当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，破碎至粗颗粒，加水浸泡，武火煎煮至沸，文火煎煮一段时间，得到煎煮液；以及将该煎煮液趁热过滤取滤液，减压浓缩至在15～25℃下相对密度为1.05～1.10的浸膏，预冻或速冻之后将该浸膏在冷冻干燥机中干燥，粉碎，过筛，混匀，得到该中药组合物粉末。进一步地，该粗颗粒的直径为3～6mm，例如4～5mm。进一步地，该水与该包含当归的中药组合物的体积/质量之比为25～35，例如约29。进一步地，该浸泡的时间为10～100min，例如约60min。进一步地，该武火煎煮时加盖。进一步地，该文火煎煮时不加盖。进一步地，该文火煎煮的时间为10～100min，例如约50min。进一步地，该趁热过滤的温度为80～85℃。进一步地，该过滤为120目尼龙滤布单层过滤。进一步地，该滤液与该水的体积之比值为0.2～1，例如约0.5。进一步地，在该预冻或速冻之前，将该浸膏置于不锈钢盘中，使其铺料厚度为9～11mm。进一步地，该预冻为在≦-18℃冰柜中将该浸膏预冻过夜。进一步地，该速冻为使用液氮将该浸膏速冻至内无湿心。进一步地，该减压浓缩的温度不高于60℃。进一步地，该减压浓缩的真空度为-0.085～-0.099Mpa。进一步地，该冷冻干燥的冷阱温度不高于-40℃。进一步地，该冷冻干燥的真空度不高于100Pa。进一步地，该冷冻干燥至水分不高于8％。进一步地，该筛为三号筛。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约7.74”包括7.74的±5％，或从7.353到8.127；“约15.48”包括15.48的±5％，或从14.706到16.254；“约29”包括29的±5％，或从27.55到30.45；“约60”包括60的±5％，或从57到63；“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。
进一步地，该流动相A为甲醇。进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液。进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液。进一步地，该酸水溶液为约0.5％的磷酸水溶液。进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。进一步地，该色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱或Kromasil 100-5-C18色谱柱。进一步地，该色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。
进一步地，在该检测波长为225nm时，2号峰为盐酸黄柏碱，4号峰为木兰花碱，7号峰为盐酸黄连碱，8号峰为表小檗碱，9号峰为盐酸药根碱，11号峰为盐酸小檗碱，12号峰为盐酸巴马汀，13号峰为黄芩苷，15号峰为汉黄芩苷。
特别优选地，在该检测波长为225nm时，1号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，2号峰来自黄柏药材，3号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，4号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，5号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，6号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，7号峰来自黄连药材，8号峰来自黄连药材，9号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，10号峰来自黄芩药材，11号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，12号峰来自黄连药材，13号峰来自黄芩药材，14号峰为该中药组合物在煎煮过程中产生的物质，15号峰来自黄芩药材。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归的中药组合物的质量控制方法，其特征在于，该质量控制方法包括如下步骤：(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱；(2)取中药组合物供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品指纹图谱；以及(3)将步骤(2)所得到的该中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
进一步地，该符合要求包括以下的一种或多种：(1)该中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出15个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；(2)以15号峰汉黄芩苷峰为S峰，中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药组合物待测样品指纹图谱与该中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述测定方法或上述构建方法或上述质量控制方法在包含当归的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
本发明的有益效果：
简而言之，本发明提供了一种包含当归的中药复方基准样品的指纹图谱测定和质量控制方法，该方法确认了15个共有特征峰，条件简单，分析时间短，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据，确保产品的质量稳定，保障中药复方的疗效，让该中药复方更好地为人类生命健康服务。
具体而言，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量，保证了药物的疗效，利用现代药物研究的主要手段，实现精品传承经典，使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(2)本发明中药复方基准样品中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明在建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱过程中，确认了15个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续真武汤复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照。
(4)以本发明中药复方基准样品中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段。
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为不同波长下样品粉末供试品溶液3D色谱图。
图2为本品粉末供试品溶液对照指纹图谱。其中，峰2：盐酸黄柏碱，峰4：木兰花碱，峰7：盐酸黄连碱，峰8：表小檗碱，峰9：盐酸药根碱，峰11：盐酸小檗碱，峰12：盐酸巴马汀，峰13：黄芩苷，峰15(S)：汉黄芩苷。
图3为本品粉末供试品溶液指纹图谱HPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪安捷伦1260InfinityⅡ色谱系统，包括G7111A型四元泵、G7129A型自动进样器、G7115A型DAD二极管阵列检测器、G7116A型柱温箱、Empower 3色谱工作站；高效液相色谱仪Waters 2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance 2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2996型DAD二极管阵列检测器、Empower 3色谱管理系统；电子分析天平：SHIMADZU(岛津)AUW120D、Sartorius(赛得利斯)BSA124S、上海浦春JY2002、上海佑科仪器仪表有限公司FA2004B；超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司电热套：DZTW型邦西仪器科技(上海)有限公司；电子恒温水浴锅：HH-6上海力辰邦西仪器科技有限公司；超纯水机：AXLK1820-2阿修罗重庆阿修罗科技发展有限公司；色谱柱：色谱柱1：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USCL093865；色谱柱2：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:E404174；色谱柱3：SVEA C18 Gold(4.6×250mm,5μm)S.N.:1902212；色谱柱4：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USCL090110；色谱柱5：HALO AQ-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USEQU001271；色谱柱6：Phenomenex-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:H18-057911；色谱柱7：Hypersil_GOLDC18(4.6×250mm,5μm)S.N.:10695399；色谱柱8：Agilent 5TC-C18(2)(4.6×250mm,5μm)S.N.:565121；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。
对照品信息：盐酸小檗碱(批号110713-201814，含量86.7％，中国食品药品检定研究院)；盐酸药根碱(批号110733-201609，含量89.5％，中国食品药品检定研究院)；盐酸黄连碱(批号112026-201601，含量95.1％，中国食品药品检定研究院)；盐酸黄柏碱(批号111895-201504，含量94.9％，中国食品药品检定研究院)；黄芩苷(批号110715-201821，含量95.4％，中国食品药品检定研究院)；汉黄芩苷(批号112002-201702，含量98.5％，中国食品药品检定研究院)；盐酸巴马汀(批号110732-201812，含量97.6％，中国食品药品检定研究院)；表小檗碱(批号W11A9Z58574，含量≥98％，上海源叶生物科技有限公司)；阿魏酸(批号110773-201614，含量99.0％，中国食品药品检定研究院)；毛蕊花糖苷(麦角甾醇)(批号111530-201713，含量92.5％，中国食品药品检定研究院)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201606，含量97.6％，中国食品药品检定研究院)。
包含当归的中药组合物粉末(以下简称为“本品粉末”)。
包含当归的中药组合物粉末的制备方法描述
【处方量】当归7.74g、生地黄7.74g、熟地黄7.74g、黄柏7.74g、黄连7.74g、黄芩7.74g、黄芪15.48g
【制法】取以上七味(1日剂量)，破碎成直径为4～5mm的粗颗粒，置3L多功能电热煲中，加水1800ml，浸泡60分钟，加盖，武火(220V)煎煮至沸，不加盖，文火(200V)，煎煮50分钟，趁热80～85℃用120目尼龙滤布单层滤过，得滤液约900ml。取滤液，置旋转蒸发仪中减压浓缩(温度不高于60℃，真空度-0.085～-0.099Mpa)，浓缩至相对密度为1.05～1.10(20℃)的浸膏。将浸膏置不锈钢盘中，使铺料厚度为9～11mm，在≦-18℃冰柜中预冻过夜或用液氮速冻至内无湿心，取出，置冷冻干燥机中干燥，冷阱温度≦-40℃，真空度≦100Pa，冷冻干燥至水分≦8.0％，取出，粉碎，过三号筛，混匀，即得。收率范围：22.5％～41.8％。
实施例一盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量测定
1、溶液的制备
1.1、盐酸黄柏碱对照品溶液的制备
精密称取盐酸黄柏碱对照品10.75mg，置50ml量瓶中，加40％甲醇适量超声处理使溶解，放冷，并用40％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得即得每1ml含盐酸黄柏碱(以94.9％计)0.2040mg的母液。
精密吸取上述盐酸黄柏碱母液1ml，置20ml量瓶中，加40％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含盐酸黄柏碱(以94.9％计)10.20μg的对照品溶液。
1.2、黄芩苷对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品13.84mg，置50ml量瓶中，加70％甲醇适量超声处理使溶解，放冷，并用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含黄芩苷(以95.4％计)0.2641mg的母液。
精密吸取上述黄芩苷母液3ml，置5ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含黄芩苷(以95.4％计)0.1584mg的对照品溶液。
1.3、供试品溶液的制备
取本品粉末0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
1.4、阴性溶液的制备
①缺黄柏的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄柏的其他药味，按物质基准制备方法制得缺黄柏的阴性样品冻干粉，按“1.3、供试品溶液的制备”制备缺黄柏的阴性样品溶液。
②缺黄芩的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄芩的其他药味，按物质基准制备方法制得缺黄芩的阴性样品冻干粉，按“1.3、供试品溶液的制备”制备缺黄芩的阴性样品溶液。
③空白溶剂
50％甲醇。
2、色谱条件的建立
2.1、检测波长的选择
选择黄柏中盐酸黄柏碱和黄芩中黄芩苷最大吸收波长285nm和278nm及210nm，三个波长进行比较，278nm及284nm检测波长下盐酸黄柏碱峰高很小，不适合作含量检测，210nm检测波长下，盐酸黄柏碱及黄芩苷均有合适的峰高，可用于含量检测，故选择210nm作为检测波长。
2.2、流动相梯度的选择
按表1中的规定进行梯度洗脱。
表1盐酸黄柏碱、黄芩苷检测流动相洗脱梯度1
结果表明，盐酸黄柏碱与黄芩苷分离较差，分离度大于1.5但小于2.0，为保证色谱条件有微小变动盐酸黄柏碱与黄芩苷的分离度仍然能满足含量测定要求，需进一步优化色谱条件，优化的条件如表2所示。
表2盐酸黄柏碱、黄芩苷检测流动相洗脱梯度2
结果表明，该条件下盐酸黄柏碱、黄芩苷与其相邻的峰得到明显分离，符合含量测定要求，故选择此流动相梯度进行后续研究。
2.3、不同酸种类的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同酸种类(甲醇-0.1％甲酸溶液、甲醇-0.1％乙酸溶液、甲醇-0.1％磷酸溶液)对色谱峰的影响。
结果表明，以甲醇-0.1％甲酸溶液为流动相，盐酸黄柏碱峰拖尾严重；以甲醇-0.1％乙酸溶液为流动相，盐酸黄柏碱和黄芩苷峰均拖尾严重；且以上两种流动相基线下漂明显。以甲醇-0.1％磷酸为流动相，盐酸黄柏碱和黄芩苷分离佳、对称性好，图谱基线平衡，故选择以甲醇-0.1％磷酸溶液为后续研究用流动相。
2.4、不同磷酸浓度的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同磷酸浓度(0.05％、0.10％和0.15％)对色谱峰的影响。
结果表明，以上三种不同磷酸浓度对黄芩苷无显著影响，对盐酸黄柏碱有影响：以甲醇-0.05％磷酸溶液为流动相，盐酸黄柏碱与紧邻其后的相邻色谱峰分离度下降，基线后延，理论塔板数最低；以甲醇-0.15％磷酸溶液为流动相，盐酸黄柏碱与紧邻其后的相邻色谱峰分离度最大，理论塔板数较高；以甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相，盐酸黄柏碱与紧邻其后的相邻色谱峰分离度为大于2，可以满足含量检测要求，磷酸浓度在0.1％～0.15％之间均适合。结合阿魏酸含量测定，选择以甲醇-0.1％磷酸溶液作为流动相。
2.5、不同柱温的选择
取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同柱温(25℃、30℃和35℃)，对色谱峰的影响。
结果表明，当柱温为25℃～35℃时，盐酸黄柏碱与黄芩苷保留时间有差别，但各系统适用性参数无显著差异；柱温为30℃时盐酸黄柏碱与黄芩苷的对称性更好，故仍选择柱温为30℃进行后续研究。
2.6、不同流速的选择
取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min)对色谱峰的影响。
结果表明，当流速为0.8ml/min～1.2ml/min时，盐酸黄柏碱与黄芩苷保留时间有差别，但各系统适用性参数无显著差异，流速为1.0ml/min时保留时间适中，故仍选择流速为1.0ml/min进行后续研究。
3、供试品溶液制备方法考察
3.1、提取溶剂的预实验
通过预实验发现用含水甲醇提取，黄芩苷在水中溶解度不如在含水甲醇中溶解度大，并随甲醇浓度增加溶解度增大，70％甲醇时溶解度最大；盐酸黄柏碱在水中溶解度大，当甲醇浓度达60％时溶解度明显下降，且色谱峰型变差；采用50％甲醇为提取溶剂时，盐酸黄柏碱与黄芩苷均能获得较好的溶解。综合考虑，选择50％甲醇作为供试品考察初始溶剂。预试验得供试品制备方法为：取本品粉末约0.3g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入50％甲醇40ml，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.2、提取方式的选择
对比回流提取与超声提取两种不同提取方式对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约0.3g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入50％甲醇40ml，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。再称取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤。分别精密吸取上述两种溶液，注入液相色谱仪，测定，计算。
结果表明，回流提取与超声(功率500W，频率40kHz)提取供试品中黄柏碱、黄芩苷的含量无明显差异，以上两种提取方式效率基本一致，本品粉末均能完全溶解于50ml50％甲醇中，结合前期预实验发现黄芩苷加热溶解性更好，故本实验选取回流提取方式。
3.3、不同溶剂种类的选择
对比不同溶剂(水、50％甲醇与50％乙醇)回流提取对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约0.3g，共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、50％甲醇与50％乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定，计算。
结果表明，水回流提取黄芩苷含量很低；50％乙醇回流提取盐酸黄柏碱的含量非常低，50％甲醇回流提取黄芩苷、盐酸黄柏碱的含量均较高。综合考虑，择优选取提取溶剂为50％甲醇。
3.4、不同溶剂浓度的选择
对比不同溶剂浓度(40％甲醇、50％甲醇与60％甲醇)回流提取对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约0.3g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，40％甲醇、50％甲醇与60％甲醇回流提取对黄芩苷含量无显著影响，对盐酸黄柏碱有影响，以60％甲醇回流提取的盐酸黄柏碱含量较低，峰形较差，40％甲醇与50％甲醇回流提取对盐酸黄柏碱的含量无显著影响，综合考虑，择优选取50％甲醇作为提取溶剂。
3.5、不同溶剂用量的选择
对比不同溶剂用量(25ml、50ml和100ml)回流提取对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约0.3g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入25ml、50ml、100ml50％甲醇，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，不同溶剂用量(25ml、50ml、100ml)对盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量无显著影响；当溶剂用量为100ml时，目标成分浓度较低，峰高较小；溶剂用量为25ml时，黄芩苷峰较大；溶剂用量为50ml时，峰高适中，故选择溶剂用量为50ml。
3.6、不同提取时间的选择
对比不同回流提取时间(15分钟、30分钟、45分钟)对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约0.3g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加50％甲醇50ml，密塞，称定重量，分别加热回流15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，回流提取15分钟、30分钟、45分钟，供试品中盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量无显著差异，为了保证不同批次的样品充分提取，故选择回流提取时间为30分钟。
3.7、不同取样量的选择
对比不同取样量(0.2g、0.3g、0.4g)对盐酸黄柏碱与黄芩苷色谱峰及含量的影响。
分别取本品粉末0.2g、0.3g、0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，取样量在0.2g～0.4g之间，供试品中盐酸黄柏碱、黄芩苷含量无显著差异，表明取样量在0.2g～0.4g之间能被充分提取，取样量为0.3g时，供试品中盐酸黄柏碱与黄芩苷峰的响应值和系统适应性参数均较合适，故择优选择取样量为0.3g。
3.8、供试品溶液制备方法的确立
综上，本品供试品处理方法为：取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、色谱条件的确认及系统适用性参数的建立
照高效液相色谱法(《中国药典》2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性参数：以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm。理论板数按盐酸黄柏碱峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加40％甲醇制成每1ml含盐酸黄柏碱10μg的溶液，即得。
另取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含黄芩苷0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5、方法学验证
5.1、专属性考察
取供试品溶液、对照品溶液、阴性供试品溶液和空白溶液按“1.4”中色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，阴性对照无干扰，本方法专属性好。
5.2、检测限
按照《中国药典》2015年版四部通则药品质量标准分析方法验证指导原则中检测限进行测定，把已知浓度试样检测出的信号与基线进行比较，信噪比为3:1。试验测得能被检测出的盐酸黄柏碱最低量为36.7ng/ml，黄芩苷最低量为105.6ng/ml。
5.3、定量限
按照《中国药典》2015年版四部通则药品质量标准分析方法验证指导原则中定量限进行测定，把已知浓度试样检测出的信号与基线进行比较，信噪比为10:1。试验测得能被可靠地定量的盐酸黄柏碱最低量为61.2ng/ml，黄芩苷最低量为211.3ng/ml。
5.4、线性关系考察
5.4.1、盐酸黄柏碱线性考察
取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加40％甲醇制成每1ml含2.04μg、8.16μg、10.20μg、16.32μg、20.40μg的溶液，精密吸取以上5个不同浓度的盐酸黄柏碱对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以盐酸黄柏碱的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程：y＝88552x–9415，R2＝0.9998。实验结果表明盐酸黄柏碱在2.04μg/ml～20.40μg/ml范围内线性关系良好。
5.4.2、黄芩苷线性考察
取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含52.81μg、105.63μg、158.44μg、211.25μg、264.07μg的溶液，精密吸取以上5个不同浓度的黄芩苷对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以黄芩苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程：y＝36862x-97119，R2＝0.9998。实验结果表明黄芩苷在
52.81μg～264.07μg范围内线性关系良好。
5.5、精密度考察
5.5.1、仪器精密度试验
分别精密吸取盐酸黄柏碱对照品溶液与黄芩苷对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，分别连续进样5次，测定，分别计算盐酸黄柏碱、黄芩苷保留时间及峰面积的RSD值。结果表明，盐酸黄柏碱保留时间RSD值为0.7％、峰面积RSD值为0.3％，黄芩苷保留时间RSD值为0.1％、峰面积RSD值为0.1％，本方法仪器精密度良好。
5.5.2、进样精密度
精密吸取同一供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定，分别计算盐酸黄柏碱、黄芩苷保留时间及峰面积的RSD值。结果表明，盐酸黄柏碱保留时间RSD值为0.1％、峰面积RSD值为0.6％，黄芩苷保留时间RSD值为0.1％、峰面积RSD值为0.2％，本方法进样精密度良好。
5.5.3、方法重复性考察
取同一份供试品，依法制备6份供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算。结果表明，盐酸黄柏碱含量RSD为1.1％、黄芩苷含量RSD为1.3％，该方法重复性良好。
5.5.4、不同人员中间精密度考察
取同一份供试品，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，每人按供试品制备方法制备2份供试品溶液，分别在同一台高效液相色谱仪上进行试验，测定盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量。结果表明，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果RSD值分别为1.6％、0.9％，均小于2％。本法不同操作人员中间精密度良好。
5.5.5、不同仪器中间精密度考察
取同一份供试品，依法制备3份供试品溶液，分别在Waters和Agilent高效液相色谱仪上进行试验，测定盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量。结果表明，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量RSD值分别为：1.8％、0.9％，均小于2％。本法不同仪器中间精密度良好。
5.6、准确度考察
5.6.1、盐酸黄柏碱
即加样回收试验。取精密称取盐酸黄柏碱10.58mg，置100ml量瓶中，加入40％甲醇适量，超声溶解，取出，放冷，用40％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含盐酸黄柏碱(以94.9％计)0.1004mg的母液。
取已测定含量的同一批号样品(含盐酸黄柏碱0.116％)约0.3g，共9份，分别精密称定，按对照品加入量与所取供试品待测定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1的高、中、低浓度分别制备三份样品。其中高浓度分别精密加入盐酸黄柏碱对照品母液5ml，中浓度分别精密加入盐酸黄柏碱对照品母液3.3ml，低浓度分别精密加入盐酸黄柏碱对照品母液1.7ml，依法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算。结果表明，盐酸黄柏碱平均回收率为92％，SD值为2.0，RSD％值为2.1％，盐酸黄柏碱回收率好。
5.6.2、黄芩苷
即加样回收试验。取已测定含量的同一批号样品(含黄芩苷3.12％)约0.3g，共9份，分别精密称定，按高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品待测定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1分别制备三份样品。其中高浓度分别加入黄芩苷对照品约13.8mg，精密称定；中浓度分别加入黄芩苷对照品约9.2mg，精密称定；低浓度分别加入黄芩苷对照品约4.6mg，精密称定。取以上供试品，依法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算。黄芩苷平均回收率为99％，SD值为2.7，RSD％值为2.7％，黄芩苷回收率好。
5.7、耐用性考察
5.7.1、溶液的稳定性
取同一份供试品溶液，分别在配制后第0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、30和36小时进样，测定峰面积，计算。结果表明，供试品溶液36小时内盐酸黄柏碱峰与黄芩苷峰峰面积RSD分别为0.9％、0.2％，供试品溶液在36小时内稳定，可以满足测定需要。
5.7.2、不同流速的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min)下检测，考察盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果的差异。结果表明，流速在0.9ml/min～1.1ml/min之间，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量RSD分别为0.9％、0.4％，流速耐用性良好。
5.7.3、不同柱温的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同柱温(25℃、30℃和35℃)下检测，考察盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果的差异。结果表明，柱温在25℃～35℃之间，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量RSD别为2.3％、0.6％，柱温耐用性良好。
5.7.4、不同磷酸浓度的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别用甲醇-不同磷酸浓度溶液(0.08％磷酸溶液、0.10％磷酸溶液和0.12％磷酸溶液)为流动相条件，进行检测，考察盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果的差异。结果表明，磷酸浓度在0.08％～0.12％之间时，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果RSD别为1.3％、1.2％，磷酸浓度在0.08％～0.12％之间耐用性良好。
5.7.5、不同色谱柱的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别用不同批号色谱柱(色谱柱1：Kromasil100-5-C18(4.6×250mm,5μm)SN：E157930、色谱柱2：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)SN：E404174、色谱柱3：Kinetex 5um C18(4.6×250mm,5μm)SN:H18-057911)、色谱柱4：Hypersil_GOLD(4.6×250mm,5μm)SN:10695399、色谱柱5：Agilent 5TC-C18(4.6×250mm,5μm)SN:5656121、色谱柱6：HALO AQ-C18(4.6×250mm,5μm)SN:USEQU001271进行检测，考察盐酸黄柏碱、黄芩苷的含量结果的差异。结果表明，用不同色谱柱检测，盐酸黄柏碱、黄芩苷含量结果RSD分别为2.7％、0.7％，该方法对不同色谱柱耐用性较好。
实施例二阿魏酸的含量测定
1、溶液的制备
1.1、对照品溶液的配制
精密称取阿魏酸对照品10.52mg，置100ml量瓶中，加70％甲醇适量超声处理使溶解，取出，放冷，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含阿魏酸(以99.0％计)0.1041mg的对照品母液。精密吸取上述对照品母液5ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含阿魏酸(以99.0％计)52.07μg的对照品溶液。
1.2、供试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯溶液，水浴蒸干，残渣加70％甲醇转移并定容至10ml容量瓶中，摇匀，滤过，即得。
1.3、阴性溶液的制备
1.3.1、缺当归、黄柏的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺当归、黄柏的其他药味，按物质基准制备方法制得缺当归、黄柏的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺当归、黄柏的阴性样品溶液。
1.3.2、空白溶剂
70％甲醇。
2、色谱条件的建立
2.1、检测波长的选择
阿魏酸最大吸收波长为323nm。故选择323nm作为检测波长。
2.2、流动相梯度的选择
按表3中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，检测波长为323nm。
表3阿魏酸检测流动相洗脱梯度1
结果表明，阿魏酸与其后面紧邻的色谱小峰未基线分离，需进一步优化色谱条件。色谱条件如表4所示。
表4阿魏酸检测流动相洗脱梯度2
结果表明，阿魏酸与其后面紧邻的色谱小峰得到分离。阿魏酸分离度符合要求。更换仪器检测过程中，发现阿魏酸与其前面相邻色谱小峰分离度小于1.5，继续进行色谱条件优化，调整梯度并改变柱温为40℃，流速为0.7ml/min，流动相梯度如表5所示。
表5阿魏酸检测流动相洗脱梯度3
结果表明，阿魏酸峰与前后相邻的峰均得到很好分离，各系统适用性参数均较好，符合检测要求，将继续以此梯度条件对色谱条件进行考察优化。
2.3、色谱柱的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，考察不同色谱柱(色谱柱1：Kromasil100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)，色谱柱2：Agilent 5TC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)，色谱柱3：Hypersil GOLD
(4.6mm×250mm，5μm)，色谱柱4：Wondasil C18-WR
(4.6mm×250mm，5μm)，色谱柱5：Diamonsil C18(2)5μm
(4.6mm×250mm，5μm)，对阿魏酸峰的影响。
结果表明，Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、Wondasil C18-WR与Diamonsil C18(2)色谱柱阿魏酸色谱峰保留时间延后且峰宽较宽；Hypersil GOLD色谱柱与Kromasil 100-5-C18色谱柱，阿魏酸色谱峰分离效果好，系统适用性参数好。为保持实验连贯性，仍选择Kromasil 100-5-C18色谱柱为后续研究用色谱柱。
2.4、不同酸种类的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同流动相酸种类(甲醇-0.1％磷酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液、甲醇-0.1％乙酸溶液)对阿魏酸色谱峰的影响。
结果表明，以甲醇-0.1％甲酸溶液与甲醇-0.1％乙酸溶液为流动相时，阿魏酸色谱峰峰宽较宽，与其前后相邻色谱峰的分离度较差，故仍选择甲醇-0.1％磷酸溶液作为后续研究用流动相。
2.5、不同酸浓度的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同酸浓度(0.05％磷酸溶液、0.10％磷酸溶液、0.15％磷酸溶液)对阿魏酸色谱峰的影响。
结果表明，三种不同浓度磷酸对阿魏酸色谱峰分离度影响不大，为保持实验连贯性，故仍选择甲醇-0.10％磷酸溶液作为后续研究用流动相。
2.6、不同柱温的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，考察不同柱温(35℃、40℃、42℃、45℃)对阿魏酸色谱峰的影响。
结果表明，35℃～45℃柱温时阿魏酸色谱峰系统适应性参数均较好，为保持实验连贯性，故仍选择柱温40℃作为后续研究。
2.7、不同流速的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，考察不同流速(0.6ml/min、0.7ml/min，0.8ml/min)对阿魏酸色谱峰的影响。
结果表明，流速在0.6ml/min～0.8ml/min之间变化时，供试品阿魏酸色谱峰均有较好的分离，为保持实验连贯性，仍选择流速为0.7ml/min。
3、供试品溶液的制备
3.1、提取方式的选择
对比粉末加乙酸乙酯超声提取、粉末加乙酸乙酯加热回流提取和粉末加水溶解后用乙酸乙酯振摇提取三种提取方式，对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末2份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯80ml，密塞，称定重量，一份超声处理(功率500W，频率40kHZ)30分钟，一份加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，滤过，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取以上三种供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，本品粉末加水复溶后用乙酸乙酯振摇提取阿魏酸含量最高，冻干粉用乙酸乙酯直接超声处理与加热回流提取的提取率非常低，故择优选择加水复溶后用乙酸乙酯振摇提取作为供试品溶液制备的提取方式。
3.2、不同溶剂种类选择
对比不同提取溶剂种类(乙酸乙酯、正丁醇、氯仿)对阿魏酸对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约2g，共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，分别用乙酸乙酯、正丁醇和三氯甲烷振摇提取4次，每次20ml，分别合并乙酸乙酯液、正丁醇液和三氯甲烷液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，用氯仿提取阿魏酸含量结果很低，表明提取不充分；用正丁醇提取杂质峰明显增多，含量结果比乙酸乙酯提取高一倍，由预实验可知是由于其前面相邻色谱峰与阿魏酸重合，导致峰面积增大，含量结果增大。综上，故择优选择提取溶剂为乙酸乙酯。
3.3、振摇提取次数的选择
对比不同振摇提取次数(3次、4次、5次)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约2g，共3份精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，分别用乙酸乙酯振摇提取3次、4次与5次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，用乙酸乙酸提取3次时阿魏酸含量略低于提取4次与5次的，提取4次与提取5次，阿魏酸含量结果无显著差异，故择优选择用乙酸乙酯振摇提取4次。
3.4、取样量的选择
对比不同取样量(1g、2g、3g)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
分别取本品粉末约1g，2g，3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，分别用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，取样量为3g测得阿魏酸含量相对较低，可能是供试品浓度较大，振摇提取不完全，取样量为1g与2g相对平均偏差(％)为1.6％，说明在取样量1g～2g的范围内，阿魏酸能被提取完全，故选择供试品取样量为2g。
3.5、不同乙酸乙酯用量的选择
对比乙酸乙酯不同用量(15ml、20ml、30ml)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约2g，共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次分别为15ml、20ml、30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，并用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，采用三种不同乙酸乙酯用量进行提取，每次乙酸乙酯用量为15ml时阿魏酸的含量较低，而每次溶剂用量为20ml与30ml时阿魏酸的含量较高，且两者测得含量没显著差异，故择优选择每次乙酸乙酯用量为20ml。
3.6、转移稀释溶剂的选择
药典采用70％甲醇为溶剂检测当归中阿魏酸的含量，故对比不同转移稀释溶剂(50％甲醇、70％甲醇、甲醇)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末2g，其3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣分别用50％甲醇、70％甲醇、甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，用相应溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，以50％甲醇溶解的阿魏酸含量较低；以70％甲醇溶解的阿魏酸含量较高，且峰对称性好；以甲醇溶解的阿魏酸含量稍低，但峰对称性差。故择优选择稀释溶剂为70％甲醇。
3.7、进样体积的选择
对比不同进样体积(5μl、10μl和15μl)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，进样体积分别为5μl、10μl和15μl，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，不同进样体积对阿魏酸含量无显著影响，但进样体积15μl时峰宽较宽，理论塔板数较低，当进样体积为5μl和10μl时，系统适应性参数相近，为了考虑实验连贯性仍选择进样量为10μl。
3.8、转移稀释溶剂体积的选择
对比70％甲醇不同用量(5ml、10ml)对阿魏酸色谱峰及含量的影响。
取本品粉末约2g，共2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并分别转移至5ml、10ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，残渣分别稀释定容至5ml和10ml，阿魏酸含量无显著影响，但稀释至10ml操作性更强，故选择转移稀释溶剂体积为10ml。
3.9、供试品制备方法的确定
综上，本品供试品处理方法为：取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
4、本品粉末阿魏酸含量测定方法确定
照高效液相色谱法(《中国药典》2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表5的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟0.7ml；检测波长为323nm。理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含阿魏酸50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水60ml，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5、方法学验证
5.1、专属性考察
取供试品溶液、对照品溶液、阴性供试品溶液和空白溶液，按“2.4”中色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，阴性无干扰，本方法专属性好。
5.2、检测限
按照《中国药典》2015年版四部通则药品质量标准分析方法验证指导原则中检测限进行测定，把已知浓度试样检测出的信号与基线进行比较，信噪比为3:1。试验测得能被检测出的阿魏酸最低量为0.526μg/ml。
5.3、定量限
按照《中国药典》2015年版四部通则质量标准分析方法验证指导原则中定量限进行测定，信噪比为10:1。试验测得能被可靠地定量的阿魏酸最低量为1.052μg/ml。
5.4、线性关系考察
取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含21.05μg、31.57μg、52.62μg、78.93μg、157.86μg的溶液，精密吸取以上5个不同浓度的柚皮苷对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以柚皮苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程：y＝79017x+7596，R2＝0.9999。实验结果表明阿魏酸在21.05μg/ml～157.86μg/ml范围内线性关系良好。
5.5、精密度考察
5.5.1、仪器精密度试验
精密吸取同一阿魏酸对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定，计算阿魏酸保留时间及峰面积的RSD值。结果表明，阿魏酸保留时间RSD值为0.1％、峰面积RSD值为0.7％，本方法仪器精密度良好。
5.5.2、进样精密度
精密吸取同一供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定，计算阿魏酸保留时间及峰面积的RSD值。结果表明，阿魏酸保留时间RSD值为0.2％、峰面积RSD值为0.4％，本方法进样精密度良好。
5.5.3、方法重复性考察
取同一份供试品，依法制备6份供试品溶液，照上述色谱条件进行测定，计算。结果表明，阿魏酸含量测定RSD为2.5％，表明该方法重复性良好。
5.5.4、不同人员中间精密度考察
取同一份供试品，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，每人依法制备2份供试品溶液，分别在同一台高效液相色谱仪上进行试验，测定阿魏酸的含量，计算。结果表明，阿魏酸含量RSD值为2.1％，本方法不同操作人员检测中间精密度良好。
5.5.5、不同仪器中间精密度考察
取同一份供试品，依法制备3份供试品溶液，分别在Waters和Agilent高效液相色谱仪上进行试验，测定，计算。结果表明，阿魏酸含量RSD值为1.4％，本方法不同仪器检测结果中间精密度良好。
5.6、准确度考察
精密称取阿魏酸10.37mg，置100ml量瓶中，加入70％甲醇适量，超声溶解，取出，放冷，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含阿魏酸(以99.0％计)0.1026mg的对照品母液。取已测定含量的同一批号样品(含阿魏酸0.030％)约2g，共9份，分别精密称定，按对照品加入量与所取供试品待测定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1的高、中、低浓度分别制备三份样品。其中高浓度分别精密加入阿魏酸对照品母液9ml，中浓度分别精密加入阿魏酸对照品母液6ml，低浓度分别精密加入阿魏酸对照品母液3ml，依法制备供试品溶液，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，阿魏酸平均回收率为94％，SD值为3.3，RSD值为3.5％，阿魏酸回收率好。
5.7、耐用性考察
5.7.1、溶液的稳定性
取同一份供试品溶液，分别在配制后的第0、1、2、3、4、5、8、12、16、24、30和48小时进样，测定峰面积，计算。结果表明，供试品溶液48小时内阿魏酸峰峰面积RSD为0.4％，供试品溶液在48小时内稳定，可以满足测定需要。
5.7.2、不同流速的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同流速(0.6ml/min、0.7ml/min和0.8ml/min)条件下检测，考察阿魏酸含量结果的差异。结果表明，流速在0.6ml/min～0.8ml/min之间，阿魏酸含量RSD为2.0％，流速耐用性良好。
5.7.3、不同柱温的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同柱温(35℃、40℃和45℃)条件下检测，考察阿魏酸含量结果的差异。结果表明，柱温在35℃～45℃之间，阿魏酸含量RSD为0％，柱温耐用性良好。
5.7.4、不同磷酸浓度的考察
取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，分别用甲醇-不同磷酸浓度溶液(0.08％磷酸溶液、0.10％磷酸溶液和0.12％磷酸溶液)作为流动相进行检测，考察阿魏酸含量结果的差异。结果表明，磷酸浓度在0.08％～0.12％之间时，阿魏酸含量结果RSD为1.3％，磷酸浓度在0.08％～0.12％之间耐用性良好。
5.7.5、不同色谱柱的考察
取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，分别用不同批号色谱柱(色谱柱1：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)SN：E404174、色谱柱2：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)SN：E157930、色谱柱3：Kinetex 5um C18(4.6×250mm,5μm)SN:H18-057911)、色谱柱4：Hypersil_GOLD(4.6×250mm,5μm)SN:10695399、色谱柱5：Agilent 5TC-C18(4.6×250mm,5μm)SN:5656121、色谱柱6：HALO AQ-C18(4.6×250mm,5μm)SN:USEQU001271进行检测，考察阿魏酸的含量结果的差异。结果表明，用不同色谱柱检测，阿魏酸含量结果RSD为2.0％，该方法对不同色谱柱耐用性较好。
实施例三本品粉末指纹图谱
1、溶液的制备
1.1、参照物溶液的配制
混合参照物溶液制备：取盐酸巴马汀对照品1.23mg、盐酸药根碱对照品1.37mg、表小檗碱对照品1.58mg、盐酸黄连碱对照品1.52mg、盐酸小檗碱对照品1.65mg、盐酸黄柏碱对照品1.65mg、汉黄芩苷对照品1.99mg、黄芩苷对照品3.14mg，置20ml量瓶中，加50％甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含盐酸巴马汀(以97.6％计)60.02μg/ml、含盐酸药根碱(以89.5％计)61.31μg/ml、含表小檗碱(以98.0％计)77.42μg/ml含盐酸黄连碱(以95.1％计)72.28μg/ml、含盐酸小檗碱(以86.7％计)71.53μg/ml、含盐酸黄柏碱(以94.9％计)78.29μg/ml、含汉黄芩苷(以98.5％计)98.01μg/ml、含黄芩苷(以95.4％计)0.1498mg/ml的混合参照物溶液。
1.2、供试品溶液的制备
取本品粉末约0.6g，精密称定，置20ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3、阴性溶液的制备
1.3.1、缺当归的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺当归的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺当归的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺当归的阴性样品溶液。
1.3.2、缺生地黄、熟地黄的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺生地黄、熟地黄的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺生地黄、熟地黄的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺生地黄、熟地黄的阴性样品溶液。
1.3.3、缺黄柏的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄柏的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺黄柏的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺黄柏的阴性样品溶液。
1.3.4、缺黄芩的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄芩的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺黄芩的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺黄芩的阴性样品溶液。
1.3.5、缺黄连的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄连的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺黄连的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺黄连的阴性样品溶液。
1.3.6、缺黄芪的阴性样品溶液的制备
按处方称取缺黄芪的其他药味，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得缺黄芪的阴性样品冻干粉，按“1.2、供试品溶液的制备”制备缺黄芪的阴性样品溶液。
1.3.7、空白溶剂
水。
1.3.8、单味药材对照溶液的制备
分别取当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄芩、黄连、黄芪药材，按物质基准制备方法(即，上述包含当归的中药组合物粉末的制备方法)制得单味药材冻干粉。按“1.2、供试品溶液的制备”制备以上各单味药材溶液。
2、色谱条件的建立
2.1、预实验
取本品粉末约0.6g，精密称定，置20ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率500W，频率40kHZ)20分钟，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
通过预实验比较不同流动相组成、不同酸浓度及不同梯度对本品粉末中黄连、黄柏、黄芩等药材的成分进行分离与指认，得到如下初始条件：以Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml，检测波长225nm。进样量10μl。
表6指纹图谱流动相洗脱梯度1
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 5→9 | 95→91 |
| 8～17 | 9→20 | 91→80 |
| 17～33 | 20 | 80 |
| 33～35 | 20→28 | 80→72 |
| 35～49 | 28→30 | 72→70 |
| 49～56 | 30 | 70 |
| 56～58 | 30→34 | 70→68 |
| 58～69 | 34→36 | 68→64 |
| 69～81 | 36→49 | 64→51 |
| 81～95 | 49→54 | 51→46 |
| 95～100 | 54→90 | 46→10 |
| 100～105 | 90 | 10 |
| 105～106 | 90→5 | 10→95 |
| 106～120 | 5 | 95 |
2.2、测定波长的选择
将“2.1、预实验”中供试品溶液注入高效液相色谱仪，以甲醇(A)-0.15％磷酸溶液(B)为流动相，通过二极管阵列检测器在190～400nm的紫外区进行在线检测。盐酸黄柏碱在206.9nm、284.8nm波长处有最大吸收，木兰花碱在221.0nm、268.2nm、302.6nm波长处有最大吸收，阿魏酸在217.5nm、235.1nm、322.8nm波长处有最大吸收，盐酸黄连碱在225.7nm、241.0nm、267.0nm、358.4nm波长处有最大吸收，盐酸黄连碱在225.7nm、241.0nm、267.0nm、358.4nm波长处有最大吸收，表小檗碱在224.5nm、242.2nm、271.7nm、356.2nm波长处有最大吸收，盐酸药根碱在225.7nm、272.9nm、344.3nm波长处有最大吸收，毛蕊花糖苷在199.9nm、331.1nm波长处有最大吸收，盐酸小檗碱在228.1nm、264.6nm、346.7nm波长处有最大吸收，盐酸巴马汀在225.7nm、274.1nm、345.5nm波长处有最大吸收，黄芩苷在202.2nm、277.6nm、316.8nm波长处有最大吸收，汉黄芩苷在202.2nm、274.1nm、340.7nm波长处有最大吸收，且由供试品3D图(如图1所示)可看出在低波长各峰有较大紫外吸收，而甲醇截止吸收波长为210nm，故在3D通道中提取220nm、225nm以及230nm以及270nm四个波长进行对比分析。由色谱图及系统适用性参数可以看出，检测波长220nm时总峰面积最大，尤以峰5、黄芩苷、汉黄芩苷峰面积增加明显，检测波长为225nm时盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱及盐酸巴马汀均有较大吸收，检测波长为230nm时黄芩苷与汉黄芩苷峰高下降明显，检测波长为270nm时，峰2黄柏碱未检测出来，黄芩苷与汉黄芩苷峰峰高增加明显。从整体峰布局综合考虑，225nm各目标峰均能有效检出且相对大小合适，可作为指纹图谱检测波长。
2.3、流动相梯度的选择
按表6中的规定进行梯度洗脱，峰11、峰12未分离，需进一步调整梯度，以改善峰11、峰12的分离。调整后的梯度洗脱条件如表7所示。
表7流动相洗脱梯度2
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 4→8 | 96→92 |
| 8～17 | 8→19 | 92→81 |
| 17～33 | 19 | 81 |
| 33～35 | 19→27 | 81→73 |
| 35～49 | 27→29 | 73→71 |
| 49～56 | 29 | 71 |
| 56～58 | 29→33 | 71→67 |
| 58～69 | 33→35 | 67→65 |
| 69～81 | 35→48 | 65→52 |
| 81～95 | 48→53 | 52→47 |
| 95～100 | 53→90 | 47→10 |
| 100～105 | 90 | 10 |
| 105～106 | 90→4 | 10→96 |
结果表明，峰11、峰12(盐酸小檗碱)分离得到改善，但仍不佳，需进一步调整。调整后的梯度洗脱条件如表8所示。
表8流动相洗脱梯度3
结果表明，峰11、峰12(盐酸小檗碱)分离得到较大改善，能够满足指纹检测。在研究中发现阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及毛蕊花糖苷因为含量很低色谱峰很小，干扰因素多，故不再予以考虑分离；其他各主要色谱峰得到很好分离，峰整体分布适宜，能够满足指纹检测。综上，确定表8的梯度3作为后续研究用流动相洗脱梯度。
2.4、不同柱温的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同柱温(25℃、30℃、35℃)对色谱峰的影响。
结果表明，柱温为25℃时，色谱出峰略延后，峰2、峰3、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10峰宽变宽，峰11、峰12分离变差；柱温为35℃时，色谱出峰略提前，峰2和峰3、峰5和峰6分离变差。柱温为30℃时各主要峰分离度、拖尾因子等均较佳。综合考虑，选择柱温30℃进行后续研究。
2.5、不同流速的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min)对色谱峰的影响。
结果表明，流速为0.9ml/min时，色谱出峰略延后，峰2、峰3、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10峰宽变宽，峰11、峰12分离稍差；流速为1.1ml/min时，色谱出峰略提前，峰5和峰6分离稍差。流速为1.0ml/min时各主要峰分离度、拖尾因子等均较佳。综合考虑，择优选择流速1.0ml/min进行后续研究。
2.6、不同酸种类的选择
取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，分别对比用不同酸种类(0.5％甲酸、0.5％乙酸、0.5％三氟乙酸、0.5％磷酸)对色谱峰的影响。
结果表明，不同酸种类对色谱峰影响较大，0.5％甲酸溶液、0.5％乙酸溶液和0.5％三氟乙酸不仅没有改善峰形，而且基线严重下漂，影响数据采集，故不予采用，仍以甲醇-0.5％磷酸溶液作为后续研究用流动相。
2.7、不同酸浓度的选择
取同一供试品溶液，其他色谱条件不变，比较不同磷酸浓度(0.30％、0.35％、0.40％、0.45％、0.50％)对色谱峰的影响。
结果表明，磷酸浓度在0.3％～0.5％之间对各主要峰有影响，磷酸浓度为0.30％时盐酸小檗碱与紧邻色谱峰完全重叠为一个色谱峰，磷酸浓度为0.35％、0.40％时盐酸小檗碱与紧邻色谱峰分离有改善但仍不佳，磷酸浓度为0.45％、0.50％时盐酸小檗碱与紧邻色谱峰分离得到进一步改善。综上所述，择优选择以甲醇-0.5％磷酸溶液作为后续研究用流动相。
2.8、色谱条件的建立
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-C18色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为225nm。
3、供试品溶液制备的考察
3.1、不同溶剂种类的考察
对比不同提取溶剂对色谱峰的影响。
前期实验过程发现采用含水醇(甲醇或乙醇)制备供试品，黄芩苷与盐酸小檗碱峰显著高于其他色谱峰，峰整体布局有失协调；而本品粉末为水提液的冻干粉，为更好展现煎液的真实面貌，故选择本品粉末加水直接溶解。
3.2、处理方式的选择
对比超声提取、加热回流提取两种不同提取方式对色谱峰的影响。
取本品粉末约0.6g，精密称定，其中一份置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，称定重量，加热回流提取20分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。再称取本品粉末约0.6g，精密称定，置20ml量瓶中超声处理(功率500W，频率40kHz)20分钟，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。取上述两种溶液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，超声处理与回流提取各主要色谱峰峰形无显著差异，考虑到操作简便性，故选择超声处理。
3.3、超声提取时间的考察
对比不同超声时间(10分钟、20分钟、30分钟)对色谱峰的影响。
取本品粉末约0.6g，精密称定，置20ml量瓶中，加水适量，分别超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟、20分钟、30分钟，取出，放冷，分别用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，超声处理10分钟、20分钟、30分钟供试品中指标成分总峰面积无显著差异，各主要峰的峰形也无显著差异，说明超声处理时间在10分钟～30分钟之间对各主要峰提取无显著影响。为节约能耗，选择超声处理时间为10分钟。
3.4、不同进样量的考察
对比不同进样量(5μl、10μl、15μl)对色谱峰的影响。
取同一供试品溶液，分别精密吸取5μl、10μl、15μl，注入液相色谱仪，测定。
结果表明，进样量为5μl，个别色谱峰峰面积较小不易检出，进样量在10μl和15μl，各主要色谱峰无显著性差异，表明进样量在10μl～15μl之间均可以。
3.5、供试品溶液制备方法的确立
综上，本品供试品处理方法为：取本品粉末0.6g，精密称定，置20ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率500W，频率40kHZ)10分钟，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
4、色谱条件的确认及系统适用性参数的建立
照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm)；以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B；按表8中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为225nm。理论板数按盐酸黄柏碱计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取盐酸巴马汀、盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、汉黄芩苷、黄芩苷适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含盐酸巴马汀、盐酸药根碱60μg，表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱75μg，汉黄芩苷0.1mg，黄芩苷0.15mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.6g，精密称定，置20ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率500W，率40kHZ)10分钟，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取参照物液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录100分钟色谱图，即得。
5、方法学验证
5.1、专属性及峰归属考察
取供试品溶液和空白对照溶液、阴性样品溶液，按“4、色谱条件的确认及系统适用性参数的建立”中色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，1号峰来自黄柏、黄连药材饮片；2号峰为盐酸黄柏碱，来自黄柏药材饮片；3号峰来自黄柏、黄连药材饮片；4号峰为木兰花碱来自黄柏、黄连药材饮片；5、6号峰来自黄柏、黄连药材饮片，7号峰为盐酸黄连碱来自黄连药材饮片；8号峰为表小檗碱，来自黄连药材饮片；9号峰来自黄芩药材饮片；10号峰为盐酸药根碱，来自黄连、黄柏药材饮片；11号峰来自黄芩药材饮片；12号峰为盐酸小檗碱，来自黄连、黄柏药材饮片；13号峰为盐酸巴马汀，来自黄连药材饮片；14号峰为黄芩苷，来自黄芩药材饮片；15号峰为煎煮过程中产生物质；16号峰为汉黄芩苷，来自黄芩药材饮片；当归中阿魏酸、黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、生熟地黄中毛蕊花糖苷浓度较低，在供试品与药材饮片单味供试品中均无法检出。
5.2、精密度考察
5.2.1、仪器精密度试验
精密吸取同一参照物溶液，连续进样5次，每次10μl，测定，计算。结果表明，保留时间RSD为0.1～0.4％，小于3.0％；峰面积RSD为0.7～2.5％，小于3.0％。本方法仪器精密度良好。
5.2.2、方法重复性考察
取同一份供试品，依法制备6份供试品溶液，测定，计算。结果表明，相对保留时间RSD为0～0.7％，小于3％；其他相对峰面积RSD为0～7.8％，除峰7为7.8％外，其他共有峰均小于5％。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90，表明该方法重复性良好。
5.2.3、进样精密度
精密吸取同一供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定，计算。结果表明，相对保留时间RSD为0～0.6％，小于3％；相对峰面积RSD为0～14.9％，除峰11为14.9％外，其他相对峰面积RSD均小于3％；峰11，峰面积占比小于10％，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90，表明本方法仪器精密度良好。
5.2.4、不同仪器精密度的考察
取同一供试品溶液，分别在Agilent和Waters高效液相色谱仪上进行试验，测定，计算。结果表明，各共有峰相对保留时间相对平均偏差为0～1.5％，小于3％；相对峰面积相对平均偏差为0～7.7％，除峰1、峰12、峰15，其他各共有峰均小于5％。峰1略大于5％为5.1％，峰9、峰12、峰15分别为6.4，7.7％，7.5％。以上四峰单峰面积占比小于10％，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90，表明本法不同仪器精密度好。
5.2.5、不同人员精密度的考察
取同一份供试品，由甲、乙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法处理供试品，分别在同一台高效液相色谱仪上进行测定，计算。结果表明，各共有峰相对保留时间相对平均偏差为0～0.1于3％；相对峰面积相对平均偏差为0～8.6％，除峰12为8.6％外，其他各共有峰均小于5％。峰12峰面积占比小于10％，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90，表明本法不同人员精密度好。
5.3、耐用性考察
5.3.1、溶液的稳定性
取同一份供试品溶液，分别在配制后的第0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48小时进样，测定峰面积，计算。结果表明，供试品溶液48小时各共有峰相对保留时间RSD为0～1.0％，小于3.0％；相对峰面积RSD为0～11.4％，除峰2、峰11，其他共有峰均小于5.0％。峰2略大于5.0％为5.1％，峰11为11.4％，以上两峰单峰面积占比均小于10％，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90。说明供试品溶液在48小时内稳定，能满足检测需求。
5.3.2、不同流速的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min)检测，考察不同流速对各共有峰的影响。结果表明，流速在0.9ml/min～1.1ml/min之间，各共有峰的相对保留时间相对平均偏差为0～2.8％，小于3.0％。相对峰面积相对平均偏差为0～10.1％，除峰4、峰7、峰9、峰11，其他共有峰均小于5.0％。峰4略大于5.0％为5.1％，峰7、峰9、峰11分别为10.1％、7.5％、9.9％，以上三峰单峰面积占比均小于10％，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中“单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。”的规定，不予考虑。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90。流速在0.9ml/min～1.1ml/min之间均合适。
5.3.3、不同柱温的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同柱温(25℃、30℃、35℃)检测，考察不同柱温对各共有峰的影响。结果表明，柱温在25℃～35℃之间，各共有峰的相对保留时间相对平均偏差为0～5.3％，大于3.0％，与不同柱温下出峰时间延迟或提前有关。相对峰面积相对平均偏差为0～23.1％，波动较大，峰3、峰9、峰11、峰15分别为23.1％、5.4％、22.1％和7.7％。结合色谱图中各色谱峰分离情况，色谱柱温25℃，出峰延后，峰11、峰12分离变差，色谱柱温30℃与35℃，色谱图差异较不明显。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90。综上，建议固定柱温为30℃。
5.3.4、不同磷酸浓度的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别在不同浓度磷酸溶液(0.45％磷酸溶液、0.50％磷酸溶液和0.55％磷酸溶液)条件下检测，考察不同酸浓度对各共有峰的影响。结果表明，磷酸浓度在0.45％～0.55％之间时，各共有峰的相对保留时间相对平均偏差为0～0.6％，小于3％；相对峰面积相对平均偏差为0～7.0％，除峰9、峰10分别为5.4％，7.0％以外，其他共有峰均小于5％。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90。磷酸浓度在0.45％～0.55％之间均合适，磷酸浓度耐用性良好。
5.3.5、不同色谱柱的考察
取同一份供试品，其他色谱条件不变，分别用色谱柱1：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USCL093865；色谱柱2：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:E404174；色谱柱3：SVEA C18 Gold(4.6×250mm,5μm)S.N.:1902212；色谱柱4：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USCL090110；色谱柱5：HALO AQ-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:USEQU001271；色谱柱6：Phenomenex-C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:H18-057911；色谱柱7：Hypersil_GOLD C18(4.6×250mm,5μm)S.N.:10695399；色谱柱8：Agilent 5TC-C18(2)(4.6×250mm,5μm)S.N.:565121，考察不同色谱柱对各共有峰的影响。结果表明，与色谱柱1进行比较，色谱柱2、色谱柱3与色谱柱4：峰8与后面紧邻小峰分离度不合格，其他各峰分离好；色谱柱5：峰5与峰6、峰8与紧邻后面小峰、峰10与峰11出峰顺序发生调换，不适合；色谱柱6：各峰分离均较差，不适合；色谱柱7：峰2与峰3、峰5与峰6未分离，峰8与后面紧邻色谱峰未分离；色谱柱8：峰5与峰6未分离，分离度不合格。对色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3、色谱柱4中各共有峰的系统适用性参数及相似度比较(其中色谱柱4与色谱柱1为同品牌同型号不同批号色谱柱；色谱柱2、色谱柱3与色谱柱1为不同品牌色谱柱)。4根色谱柱之间，各共有峰的相对保留时间相对平均偏差为0～2.8％，小于3％；相对峰面积相对平均偏差为0～17.1％。结合色谱图中各色谱峰分离情况，在色谱柱1中各峰分离度较好，除在色谱柱1里表小檗碱峰(保留时间为63.754min)与其后面紧邻的峰(保留时间为65.149min)在色谱柱4与色谱柱2、色谱柱3里分离相对较差之外，其他色谱峰差异不显著。综合考虑后舍去与表小檗碱峰(保留时间为63.754min)紧邻的峰(保留时间为65.149min，原序号峰9)作为共有峰，择优选取15个色谱峰作为共有峰。以本品粉末对照指纹图谱为参照谱，相似度均大于0.90。综合以上，建议固定色谱柱为：Kromasil 100-5-C18色谱柱或Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱或SVEA C18 Gold色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
实施例四20批供试品指纹图谱的检测
通过对20批供试品指纹图谱的检测结果进行分析，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成如图2所示的对照指纹图谱；通过对共有峰的识别和指认，得到本品粉末HPLC指纹图谱(1)共有色谱峰15个。1号峰来自黄柏、黄连饮片；2号峰为盐酸黄柏碱，来自黄柏饮片；3号峰来自黄柏、黄连饮片；4号峰为木兰花碱来自黄柏、黄连饮片；5、6号峰来自黄柏、黄连饮片，7号峰为盐酸黄连碱来自黄连饮片；8号峰为表小檗碱，来自黄连饮片；9号峰为盐酸药根碱，来自黄连、黄柏饮片；10号峰来自黄芩饮片；11号峰为盐酸小檗碱，来自黄连、黄柏饮片；12号峰为盐酸巴马汀，来自黄连饮片；13号峰为黄芩苷，来自黄芩饮片；14号峰为多味饮片煎煮产生物质；15号峰为汉黄芩苷，来自黄芩饮片。
通过20批相对峰面积比较，发现不同产地药材组成、不同批次的各个共有峰相对峰面积变化较大，无规律可循。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与当归六黄汤对应实物(冻干粉)对照图谱经相似度计算应不低于0.90。结果如表9、表10以及图3所示。
表9指纹图谱供试品色谱峰系统适用性参数
表10 20批冻干粉指纹图谱相似度
| 批号 | 相似度 |
| 对照指纹图谱 | 1.000 |
| DGLHT1-1 | 0.987 |
| DGLHT1-2 | 0.984 |
| DGLHT2-1 | 0.972 |
| DGLHT2-2 | 0.980 |
| DGLHT3-1 | 0.987 |
| DGLHT3-2 | 0.985 |
| DGLHT4-1 | 0.995 |
| DGLHT4-2 | 0.995 |
| DGLHT5-1 | 0.992 |
| DGLHT5-2 | 0.995 |
| DGLHT6-1 | 0.995 |
| DGLHT6-2 | 0.996 |
| DGLHT7-1 | 0.953 |
| DGLHT7-2 | 0.963 |
| DGLHT8-1 | 0.984 |
| DGLHT8-2 | 0.990 |
| DGLHT9-1 | 0.990 |
| DGLHT9-2 | 0.988 |
| DGLHT10-1 | 0.989 |
| DGLHT10-2 | 0.989 |
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种包含当归的中药组合物的含量测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：
(1)取第一中药组合物供试品溶液、第一对照品溶液进行第一次检测，
所述第一次检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，79％B；12～13min，78％B→57％B；13～37min，57％B→55％；37～38min，55％B→10％B；38～40min，10％B；40～41min，10％B→79％B；41～55min，79％B，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为20～40℃，检测波长为150～350nm，进样量为5～20μl；
根据第一次检测结果，获得所述第一中药组合物供试品溶液中所述第一对照品的含量信息；
(2)取第二中药组合物供试品溶液、第二对照品溶液进行第二次检测，
所述第二次检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～38min，74％B→73％B；38～39min，73％B→10％B；39～41min，10％B；41～42min，10％B→74％B；42～55min，74％B；，流速为0.1～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm，进样量为5～20μl；
根据第二次检测结果，获得所述第二中药组合物供试品溶液中所述第二对照品的含量信息；
其中，所述中药组合物包括当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，所述第一对照品为盐酸黄柏碱和黄芩苷，所述第二对照品为阿魏酸。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在步骤(1)中，
所述信息为根据所记录的所述第一中药组合物供试品溶液的色谱图和所述第一对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述第一中药组合物供试品溶液中所述第一对照品的含量；
优选地，所述盐酸黄柏碱的标准曲线为y＝88552x－9415，r2＝0.9998；
优选地，所述黄芩苷的标准曲线为y＝36862x－97119，r2＝0.9998；
更优选地，所述第一中药组合物供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药组合物粉末，添加醇进行提取之后，放冷、补重、摇匀、过滤，取续滤液，得到所述第一中药组合物供试品溶液；
又优选地，所述中药组合物粉末的质量为0.1～10g，例如约0.3g；
又优选地，所述中药组合物粉末与所述醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.1～10):(10～60)，例如约0.3:约50；
又优选地，所述醇为甲醇；
又优选地，所述甲醇的质量体积百分比为10％～100％，例如约50％；
又优选地，所述提取为回流提取、冷浸提取、振摇提取和/或超声提取，例如回流提取，例如加热回流提取；
又优选地，所述加热回流提取的时间为10～60min，例如约30min；
又更优选地，所述盐酸黄柏碱对照品溶液的制备方法包括：称取适量的盐酸黄柏碱，添加质量体积百分比为10％～100％例如约40％的甲醇配制成盐酸黄柏碱浓度为0.001～10mg/ml例如约0.01mg/ml的所述盐酸黄柏碱对照品溶液；
又更优选地，所述黄芩苷对照品溶液的制备方法包括：称取适量的黄芩苷，添加质量体积百分比为10％～100％例如约70％的甲醇配制成黄芩苷浓度为0.01～100mg/ml例如约0.15mg/ml的所述黄芩苷对照品溶液；
尤其优选地，所述高效液相检测的所述流速为0.6～1.2ml/min，例如约1.0ml/min；
尤其优选地，所述柱温为25～35℃，例如约30℃；
尤其优选地，所述检测波长为180～240nm，例如210nm；
尤其优选地，所述进样量为8～12μl，例如约10μl；
特别优选地，所述盐酸黄柏碱对应的色谱峰的理论塔板数不低于4000；
特别优选地，所述盐酸黄柏碱对应的色谱峰的分离度大于2.0；
特别优选地，所述色谱柱选自以下的一种：Kromasil 100-5-C18柱、Kinetex 5um C18柱、Hypersil_GOLD柱、Agilent 5TC-C18柱和HALO AQ-C18柱；
特别优选地，所述色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在步骤(2)中，
所述信息为根据所记录的所述第二中药组合物供试品溶液的色谱图和所述第二对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述第二中药组合物供试品溶液中所述第二对照品的含量；
优选地，所述阿魏酸的标准曲线为y＝79017x+7596，r2＝0.9999；
更优选地，所述第二中药组合物供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药组合物粉末，添加水进行超声处理之后，用第一溶剂进行提取，得到第一溶液；将所述第一溶液进行蒸干，得到残渣，将所述残渣用第二溶剂进行溶解，定容，摇匀，得到所述第二中药组合物供试品溶液；
又优选地，所述中药组合物粉末的质量为1～10g，例如约2g；
又优选地，所述中药组合物粉末与所述水的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(10～70)，例如约2:约60；
又优选地，所述中药组合物粉末与所述第一溶剂的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(10～30)，例如约2:约20；
又优选地，所述中药组合物粉末与所述第二溶剂的质量/体积(g/ml)之比为(1～10):(5～20)，例如约2:约10；
又优选地，所述超声处理的功率为300～700W，例如约500W；
又优选地，所述超声处理的频率为20～60kHZ，例如约40kHZ；
又优选地，所述超声处理的时间为5～20min，例如约10min；
又优选地，所述第一溶剂为有机溶剂，例如乙酸乙酯；
又优选地，所述提取为回流提取、冷浸提取、振摇提取和/或超声提取，例如振摇提取；
又优选地，所述振摇提取的次数为2～7次，例如4次；
又优选地，所述第二溶剂为醇，例如甲醇；
又优选地，所述甲醇的质量体积百分比为10％～100％，例如约70％；
又更优选地，所述阿魏酸对照品溶液的制备方法包括：称取适量的阿魏酸，添加质量体积百分比为10％～100％的甲醇例如约70％的甲醇配制成阿魏酸浓度为0.01～100mg/ml例如约0.05mg/ml的所述阿魏酸对照品溶液；
尤其优选地，所述高效液相检测的所述流速为0.5～1.0ml/min，例如约0.7ml/min；
尤其优选地，所述柱温为35～45℃，例如约40℃；
尤其优选地，所述检测波长为300～350nm，例如323nm；
尤其优选地，所述进样量为8～12μl，例如约10μl；
特别优选地，所述阿魏酸对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000；
特别优选地，所述阿魏酸对应的色谱峰的分离度大于2.0；
又特别优选地，所述色谱柱选自以下的一种：Kromasil 100-5-C18柱、Kinetex 5um C18柱、Hypersil_GOLD柱、Agilent 5TC-C18柱和HALO AQ-C18柱；
又特别优选地，所述色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述流动相A为甲醇；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
又优选地，所述中药组合物粉末的制备方法包括：称取适量的当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，破碎至粗颗粒，加水浸泡，武火煎煮至沸，文火煎煮一段时间，得到煎煮液；以及将所述煎煮液趁热过滤取滤液，减压浓缩至在15～25℃下相对密度为1.05～1.10的浸膏，预冻或速冻之后将所述浸膏在冷冻干燥机中干燥，粉碎，过筛，混匀，得到所述中药组合物粉末；
尤其优选地，所述当归、所述生地黄、所述熟地黄、所述黄柏、所述黄连、所述黄芩与所述黄芪之间的质量之比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～20)；
尤其优选地，所述当归、所述生地黄、所述熟地黄、所述黄柏、所述黄连、所述黄芩与所述黄芪之间的质量之比为约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约15.48；
特别优选地，所述粗颗粒的直径为3～6mm，例如4～5mm；
优选地，所述水与所述包含当归的中药组合物的体积/质量之比为25～35，例如约29；
特别优选地，所述浸泡的时间为10～100min，例如约60min；
特别优选地，所述武火煎煮时加盖；
特别优选地，所述文火煎煮时不加盖；
特别优选地，所述文火煎煮的时间为10～100min，例如约50min；
特别优选地，所述趁热过滤的温度为80～85℃；
特别优选地，所述过滤为120目尼龙滤布单层过滤；
特别优选地，所述滤液与所述水的体积之比值为0.2～1，例如约0.5；
特别优选地，在所述预冻或速冻之前，将所述浸膏置于不锈钢盘中，使其铺料厚度为9～11mm；
特别优选地，所述预冻为在≦-18℃冰柜中将所述浸膏预冻过夜；
特别优选地，所述速冻为使用液氮将所述浸膏速冻至内无湿心；
特别优选地，所述减压浓缩的温度不高于60℃；
特别优选地，所述减压浓缩的真空度为-0.085～-0.099Mpa；
特别优选地，所述冷冻干燥的冷阱温度不高于-40℃；
特别优选地，所述冷冻干燥的真空度不高于100Pa；
特别优选地，所述冷冻干燥至水分不高于8％；
特别优选地，所述筛为三号筛。
5.一种包含当归的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
中药组合物供试品溶液的制备：称取适量的中药组合物粉末，加水溶解，超声处理之后，放冷、定容，摇匀，得到所述中药组合物供试品溶液，其中，所述中药组合物包括当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪；
对照品溶液的制备：称取适量的盐酸巴马汀、盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、汉黄芩苷、阿魏酸和黄芩苷，添加甲醇配制成浓度分别为0.01～100mg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述中药组合物供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱；
所述高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，95％B→91％B；8～17min，91％B→81％B；17～33min，81％B；33～35min，81％B→73％B；35～49min，73％B→71％B；49～56min，71％B；56～74min，71％B→67％B；74～81min，67％B→52％B；81～95min，52％B→47％B；95～100min，47％B→10％B，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm，进样量为5～20μl。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述中药组合物供试品溶液的制备中，所述超声提取的功率为300～700W，例如约500W；
优选地，所述超声提取的频率为20～60kHz，例如约40kHz；
优选地，所述超声提取的时间为5～20min，例如约10min；
更优选地，所述对照品溶液中盐酸巴马汀的浓度为约0.06mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中盐酸药根碱的浓度为约0.06mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中表小檗碱的浓度为约0.075mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中盐酸黄连碱的浓度为约0.075mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中盐酸小檗碱的浓度为约0.075mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中盐酸黄柏碱的浓度为约0.075mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中汉黄芩苷的浓度为约0.1mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中阿魏酸的浓度为约0.1mg/ml；
更优选地，所述对照品溶液中黄芩苷的浓度为约0.15mg/ml；
又更优选地，所述高效液相检测的所述流速为0.6～1.2ml/min，例如约1.0ml/min；
又更优选地，所述柱温为25～35℃，例如约30℃；
又更优选地，所述检测波长为200～250nm，例如225nm；
又更优选地，所述进样量为8～16μl，例如约10μl；
尤其优选地，所述盐酸黄柏碱对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000；
特别优选地，在所述检测波长为225nm时，所述指纹图谱包括1-15号峰，其中，15号峰为汉黄芩苷作为参照峰，1-15号峰的保留时间平均值分别对应为约15.96min、约26.90min、约28.07min、约32.19min、约43.44min、约44.37min、约58.67min、约63.35min、约69.90min、约75.17min、约77.14min、约80.11min、约86.74min、约90.48min和约94.44min；
又特别优选地，在所述检测波长为225nm时，所述指纹图谱包括1-15号峰，其中，15号峰为汉黄芩苷作为参照峰，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、12号峰、13号峰和14号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.17、约0.28、约0.30、约0.34、约0.46、约0.47、约0.62、约0.67、约0.74、约0.80、约0.82、约0.85、约0.92、和约0.96；
尤其特别优选地，所述当归、所述生地黄、所述熟地黄、所述黄柏、所述黄连、所述黄芩与所述黄芪之间的质量之比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～10):(1～20)；
尤其特别优选地，所述当归、所述生地黄、所述熟地黄、所述黄柏、所述黄连、所述黄芩与所述黄芪之间的质量之比为约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约7.74:约15.48；
尤其特别优选地，所述中药组合物粉末的制备方法包括：称取适量的当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩和黄芪，破碎至粗颗粒，加水浸泡，武火煎煮至沸，文火煎煮一段时间，得到煎煮液；以及将所述煎煮液趁热过滤取滤液，减压浓缩至在15～25℃下相对密度为1.05～1.10的浸膏，预冻或速冻之后将所述浸膏在冷冻干燥机中干燥，粉碎，过筛，混匀，得到所述中药组合物粉末；
尤其特别优选地，所述粗颗粒的直径为3～6mm，例如4～5mm；
尤其特别优选地，所述水与所述包含当归的中药组合物的体积/质量之比为25～35，例如约29；
尤其特别优选地，所述浸泡的时间为10～100min，例如约60min；
尤其特别优选地，所述武火煎煮时加盖；
尤其特别优选地，所述文火煎煮时不加盖；
尤其特别优选地，所述文火煎煮的时间为10～100min，例如约50min；
尤其特别优选地，所述趁热过滤的温度为80～85℃；
尤其特别优选地，所述过滤为120目尼龙滤布单层过滤；
尤其特别优选地，所述滤液与所述水的体积之比值为0.2～1，例如约0.5；
尤其特别优选地，在所述预冻或速冻之前，将所述浸膏置于不锈钢盘中，使其铺料厚度为9～11mm；
尤其特别优选地，所述预冻为在≦-18℃冰柜中将所述浸膏预冻过夜；
尤其特别优选地，所述速冻为使用液氮将所述浸膏速冻至内无湿心；
尤其特别优选地，所述减压浓缩的温度不高于60℃；
尤其特别优选地，所述减压浓缩的真空度为-0.085～-0.099Mpa；
尤其特别优选地，所述冷冻干燥的冷阱温度不高于-40℃；
尤其特别优选地，所述冷冻干燥的真空度不高于100Pa；
尤其特别优选地，所述冷冻干燥至水分不高于8％；
尤其特别优选地，所述筛为三号筛。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述流动相A为甲醇；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为约0.5％的磷酸水溶液；
又优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
又优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
尤其优选地，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱或Kromasil 100-5-C18色谱柱；
尤其优选地，所述色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
特别优选地，在所述检测波长为225nm时，2号峰为盐酸黄柏碱，4号峰为木兰花碱，7号峰为盐酸黄连碱，8号峰为表小檗碱，9号峰为盐酸药根碱，11号峰为盐酸小檗碱，12号峰为盐酸巴马汀，13号峰为黄芩苷，15号峰为汉黄芩苷；
特别优选地，在所述检测波长为225nm时，1号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，2号峰来自黄柏药材，3号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，4号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，5号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，6号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，7号峰来自黄连药材，8号峰来自黄连药材，9号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，10号峰来自黄芩药材，11号峰为黄柏药材、黄连药材的共有峰，12号峰来自黄连药材，13号峰来自黄芩药材，14号峰为所述中药组合物在煎煮过程中产生的物质，15号峰来自黄芩药材。
8.一种包含当归的中药组合物的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据权利要求5至7中任一项所述的指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药组合物供试品溶液，根据权利要求5至7中任一项所述的指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的所述中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的所述中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
9.根据权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，所述符合要求包括以下的一种或多种：
(1)所述中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出15个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)以15号峰汉黄芩苷峰为S峰，中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，所述中药组合物待测样品指纹图谱与所述中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的测定方法或根据权利要求5至7中任一项所述的构建方法或根据权利要求8或9所述的质量控制方法在包含当归的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
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