CN117250273B - 一种包含大黄和附子的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含大黄和附子的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中，该中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子，该对照品为甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6‑姜辣素和甘草次酸，该检测的色谱条件为：采用填料为T3的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，检测波长为200～400nm；根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。本发明对包含大黄和附子的中药复方的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含大黄和附子的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用。
背景技术
根据《中华人民共和国中医药法》，古代经典名方是指“至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂”。古代经典名方在我国有着历史悠久、丰富的人用历史并应用至今，是历代医家临床实践精华的总结，承载着数千年来中医药灿烂文明的深厚积淀，是中医药理论经过几千年的锤炼，是历代临床经验的总结，是中医药伟大宝库中最精华的部分。对中药经典名方进行深入的研究与开发，是挖掘传统中医药宝库的一把金钥匙。
中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的最常用的剂型，具有组方合理、起效迅速、疗效显著、易于吸收等优点，深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大，以及标准难以统一，严重影响其临床疗效等缺点，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势，克服汤剂的种种不足，国家药品监督管理局药品审评中心于2021年08月31日发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中明确指出按古代经典名方目录管理的中药复方制剂的质量应与经典名方基准样品的质量基本一致。基准样品代表了制剂的整体内在质量，除了成型工艺外，基准样品与制剂的其余质量控制指标均基本一致。因此基准样品是制剂内在质量的实物对照，是大生产工艺优化及其质量标准制定的参照物。基准样品是经典名方乃至所有中药研发的基准，是保证药物的安全性和有效性的对照物。经典名方复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定要以经典名方基准样品为参照。基准样品是沟通临床-企业-科研的纽带，是传承、应用和发扬传统中医药的基准。
指纹图谱是基于中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药指纹图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下，对中药材及中药产品进行质量控制。中药指纹图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素，以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣，更可用于中药生产过程的质量控制：追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
目前，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含大黄和附子的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究，现有技术中，仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效，故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的指纹图谱的质控方法控制其关键质量。
发明内容
基于此，本发明提供了一种包含大黄和附子的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中，该中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子，该对照品为甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸，
该检测的色谱条件为：采用填料为T3的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸。
进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括以下步骤：称取适量的中药复方粉末，添加水或醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过固相萃取小柱，使用醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到该中药复方供试品溶液。
进一步地，该中药复方粉末的制备方法包括以下步骤：称取适量的大黄、人参、甘草、干姜和附子，得到饮片混合物，加水浸泡一段时间之后，武火加热至沸腾后文火煎煮一段时间，过滤，滤液浓缩成流膏，取出，干燥，研磨成粉，得到该中药复方粉末。
进一步地，该饮片混合物与该水的质量/体积之比为1:4～50，例如约1:44。
进一步地，该加水浸泡的时间为0.2～1h，例如约0.5h。
进一步地，该文火煎煮的时间为0.5～1.5h，例如约1h。
进一步地，该过滤为100～300目尼龙滤布过滤。
进一步地，该浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
进一步地，该流膏为在20℃下相对密度为1.10～1.15的流膏。
进一步地，该干燥为真空干燥或冷冻干燥。
进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液例如约75％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的该对照品溶液。
进一步地，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约0.9ml/min。
进一步地，该柱温为35～45℃，例如约40℃。
进一步地，该检测波长为250～320nm，例如约280nm。
进一步地，该进样量为5～20μl，例如8～15μl，例如约10μl。
进一步地，该大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地，该色谱柱为CORTECS T3色谱柱。
进一步地，该CORTECS T3色谱柱为CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
进一步地，该检测方法进一步包括缺各单味饮片阴性对照溶液的制备与检测：该缺各单味饮片的中药复方阴性对照溶液的制备方法与该中药复方供试品溶液的制备方法相同。
进一步地，在该中药复方供试品溶液的制备方法中，该醇为甲醇。
进一步地，该甲醇的体积浓度百分比为50％～100％，例如约50％或约75％。
进一步地，该超声提取的功率为300～700W，例如约500W。
进一步地，该超声提取的频率为30～50kHz，例如约40kHz。
进一步地，该中药复方与该醇的质量/体积(g/ml)之比为1:20～1:60，例如约1:25或约1:50。
进一步地，该固相萃取小柱为PEP或C18固相萃取小柱。
进一步地，该固相萃取小柱的规格为200mg、300mg或500mg。
进一步地，该浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
进一步地，该酸为盐酸和/或硫酸。
进一步地，该酸水解为先加入酸进行超声处理，再加入有机溶剂进行两相加热回流酸水解。
进一步地，该有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷和/或乙醚。
进一步地，该萃取为振摇萃取。
进一步地，该干燥为真空干燥或冷冻干燥。
进一步地，该过滤是采用微孔滤膜过滤。
进一步地，该流动相A为甲醇-乙腈(28:72)。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～0.1％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为约0.03％的三氟乙酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的pH值不大于7.0。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5)。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
进一步地，该对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
进一步地，该对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含大黄和附子的中药复方的指纹图谱构建方法，其包括如下步骤：
中药复方供试品溶液的制备：称取适量的中药复方粉末，添加水或醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过固相萃取小柱，使用醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到该中药复方供试品溶液，其中，该中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子；
对照品溶液的制备：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液例如约75％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该中药复方供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为T3的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm。
进一步地，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约0.9ml/min。
进一步地，该柱温为35～45℃，例如约40℃。
进一步地，该检测波长为250～320nm，例如约280nm。
进一步地，该进样量为5～20μl，例如8～15μl，例如约10μl。
进一步地，该大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地，在该检测波长为280nm时，该指纹图谱包括1-12号峰，其中，9号峰为大黄酚作为参照峰，1号峰为甘草素，3号峰为异甘草素，5号峰为芦荟大黄素，6号峰为大黄酸，7号峰为6-姜辣素，8号为大黄素，10号为大黄素甲醚，12号峰为甘草次酸，其保留时间分别对应为10.0～10.2min、2.5～2.7min、4.9～5.1min、5.8～6.0min、6.4～6.6min、6.6～6.8min、8.5～8.7min、11.5～11.7min、14.8～15.0min。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5)。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
进一步地，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
进一步地，该对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
进一步地，该对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
进一步地，该流动相A为甲醇-乙腈(28:72)。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～0.1％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为约0.03％的三氟乙酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的pH值不大于7.0。
进一步地，该色谱柱为CORTECS T3色谱柱。
进一步地，该CORTECS T3色谱柱为CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
进一步地，在该检测波长为280nm时，1号峰、3号峰和12号峰来自药材甘草，2号峰、4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰、10号峰和11号峰来自药材大黄，7号峰来自药材干姜。
进一步地，在该检测波长为280nm时，包括12个共有峰，以大黄酚9号色谱峰为参比峰，其他11个共有峰的相对保留时间的RSD％依次为1号色谱峰0.59％、2号色谱峰0.19％、3号色谱峰0.32％、4号色谱峰0.47％、5号色谱峰0.05％、6号色谱峰0.21％、7号色谱峰0.42％、8号色谱峰0.06％、10号色谱峰0.16％、11号色谱峰0.17％和12号色谱峰0.29％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含大黄和附子的中药复方的质量控制方法，该方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合则为合格产品，不符合则为不合格产品。
进一步地，该符合的要求包括以下的一种或多种：
(1)该中药复方待测样品指纹图谱中呈现出12个特征色谱峰，其中9个色谱峰分别与该中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰保留时间值的±10％之内；
(2)以大黄酚对照品所对应的峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药复方待测样品指纹图谱与该中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述指纹图谱构建方法或上述质量控制方法在包含大黄和附子的中药复方的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
本发明的有益效果：
简而言之，本发明提供了一种包含大黄和附子的中药复方基准样品的指纹图谱测定和质量控制方法，该方法确认了12个共有特征峰，条件简单，分析时间短，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据，确保产品的质量稳定，保障中药复方的疗效，让该中药复方更好地为人类生命健康服务。
具体而言，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量，保证了药物的疗效，利用现代药物研究的主要手段，实现精品传承经典，使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(2)本发明中药复方基准样品中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明在建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱过程中，确认了12个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续真武汤复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照。
(4)以本发明中药复方基准样品中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段。
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为实施例1中200-400nm全波长扫描图。
图2为实施例1中不同波长HPLC对比图谱。
图3为实施例1中不同流动相系统HPLC对比图谱。
图4为实施例1中不同流动相系统中甲醇与乙腈比例HPLC对比图谱。
图5为实施例1中不同梯度HPLC对比图谱。
图6为实施例1中不同流动相系统中添加成分HPLC对比图谱。
图7为实施例1中不同流动相系统中三氟乙酸比例HPLC对比图谱。
图8为实施例1中不同厂家色谱柱HPLC对比图谱。
图9为实施例1中不同柱温HPLC对比图谱。
图10为实施例1中不同流速HPLC对比图谱。
图11为实施例1中20批基准样品HPLC匹配指纹图谱。
图12为实施例1中20批基准样品共有模式图谱。
图13为实施例1中混合对照品和全方HPLC对比图谱。
图14为实施例1中全方与单味饮片阴性对照指纹图谱比较图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
正如背景技术部分所描述的，当前尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含大黄和附子的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究，现有技术中，仅对单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效。为了解决上述问题，本发明提供了一种包含大黄和附子的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中，该中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子，该对照品为甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸，
该检测的色谱条件为：采用填料为T3的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
在一种优选的实施方式中，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸。
在一种优选的实施方式中，该中药复方供试品溶液的制备方法包括以下步骤：称取适量的中药复方粉末，添加水或醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过固相萃取小柱，使用醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到该中药复方供试品溶液。
在一种优选的实施方式中，该中药复方粉末的制备方法包括以下步骤：称取适量的大黄、人参、甘草、干姜和附子，得到饮片混合物，加水浸泡一段时间之后，武火加热至沸腾后文火煎煮一段时间，过滤，滤液浓缩成流膏，取出，干燥，研磨成粉，得到该中药复方粉末。
在一种优选的实施方式中，该饮片混合物与该水的质量/体积之比为1:4～1:50，例如约1:44。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:44”包括1:44的±5％，或从1:41.8到1:46.2。
在一种优选的实施方式中，该加水浸泡的时间为0.2～1h，例如约0.5h。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。
在一种优选的实施方式中，该文火煎煮的时间为0.5～1.5h，例如约1h。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05。
在一种优选的实施方式中，该过滤为100～300目尼龙滤布过滤。
在一种优选的实施方式中，该浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
在一种优选的实施方式中，该流膏为在20℃下相对密度为1.10～1.15的流膏。
在一种优选的实施方式中，该干燥为真空干燥或冷冻干燥。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液例如约75％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的该对照品溶液。
在一种优选的实施方式中，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约0.9ml/min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.9”包括0.9的±5％，或从0.855到0.945。
在一种优选的实施方式中，该柱温为35～45℃，例如约40℃。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约40”包括40的±5％，或从38到42。
在一种优选的实施方式中，该检测波长为250～320nm，例如约280nm。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约280”包括280的±5％，或从266到294。
在一种优选的实施方式中，该进样量为5～20μl，例如8～15μl，例如约10μl。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。
在一种优选的实施方式中，该大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱为CORTECS T3色谱柱。
在一种优选的实施方式中，该CORTECS T3色谱柱为CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
在一种优选的实施方式中，该检测方法进一步包括单味饮片阴性对照溶液的制备与检测：该缺各单味饮片的中药复方阴性对照溶液的制备方法与该中药复方供试品溶液的制备方法相同。
在一种优选的实施方式中，在该中药复方供试品溶液的制备方法中，该醇为甲醇。
在一种优选的实施方式中，该甲醇的体积浓度百分比为50％～100％，例如约50％或约75％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5；“约75”包括75的±5％，或从71.25到78.75。
在一种优选的实施方式中，该超声提取的功率为300～700W，例如约500W。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约500”包括500的±5％，或从475到525。
在一种优选的实施方式中，该超声提取的频率为30～50kHz，例如约40kHz。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约40”包括40的±5％，或从38到42。
在一种优选的实施方式中，该中药复方与该醇的质量/体积(g/ml)之比为1:20～1:60，例如约1:25或约1:50。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:25”包括1:25的±5％，或从1:23.75到1:26.25；“约1:50”包括1:50的±5％，或从1:47.5到1:52.5。
在一种优选的实施方式中，该固相萃取小柱为PEP或C18固相萃取小柱。
在一种优选的实施方式中，该固相萃取小柱的规格为200mg、300mg或500mg。
在一种优选的实施方式中，该浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
在一种优选的实施方式中，该酸为盐酸和/或硫酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水解为先加入酸进行超声处理，再加入有机溶剂进行两相加热回流酸水解。
在一种优选的实施方式中，该有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷和/或乙醚。
在一种优选的实施方式中，该萃取为振摇萃取。
在一种优选的实施方式中，该干燥为真空干燥或冷冻干燥。
在一种优选的实施方式中，该过滤是采用微孔滤膜过滤。
在一种优选的实施方式中，该流动相A为甲醇-乙腈(28:72)。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～0.1％的酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为约0.03％的三氟乙酸水溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.03”包括0.03的±5％，或从0.0285到0.0315。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的pH值不大于7.0。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(1～5):(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约4”包括4的±5％，或从3.8到4.2；“约3”包括3的±5％，或从2.85到3.15；“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05；“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约66”包括66的±5％，或从62.7到69.3；“约7”包括7的±5％，或从6.65到7.35；“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1；“约6”包括6的±5％，或从5.7到6.3；“约12”包括12的±5％，或从11.4到12.6；“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1；“约51”包括51的±5％，或从48.45到53.55。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含大黄和附子的中药复方的指纹图谱构建方法，其包括如下步骤：
中药复方供试品溶液的制备：称取适量的中药复方粉末，添加水或醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过固相萃取小柱，使用醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到该中药复方供试品溶液，其中，该中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子；
对照品溶液的制备：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液例如约75％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该中药复方供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为T3的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.4～1.5ml/min，柱温为30～50℃，检测波长为200～400nm。
在一种优选的实施方式中，该高效液相检测的该流速为0.6～1.2ml/min，例如约0.9ml/min。
在一种优选的实施方式中，该柱温为35～45℃，例如约40℃。
在一种优选的实施方式中，该检测波长为250～320nm，例如约280nm。
在一种优选的实施方式中，该进样量为5～20μl，例如8～15μl，例如约10μl。
在一种优选的实施方式中，该大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为280nm时，该指纹图谱包括1-12号峰，其中，9号峰为大黄酚作为参照峰，1号峰为甘草素，3号峰为异甘草素，5号峰为芦荟大黄素，6号峰为大黄酸，7号峰为6-姜辣素，8号为大黄素，10号为大黄素甲醚，12号峰为甘草次酸，其保留时间分别对应为10.0～10.2min、2.5～2.7min、4.9～5.1min、5.8～6.0min、6.4～6.6min、6.6～6.8min、8.5～8.7min、11.5～11.7min、14.8～15.0min。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(1～5):(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
在一种优选的实施方式中，该中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
在一种优选的实施方式中，该流动相A为甲醇-乙腈(28:72)。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～0.1％的酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为约0.03％的三氟乙酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的pH值不大于7.0。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱为CORTECS T3色谱柱。
在一种优选的实施方式中，该CORTECS T3色谱柱为CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为280nm时，1号峰、3号峰和12号峰来自药材甘草，2号峰、4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰、10号峰和11号峰来自药材大黄，7号峰来自药材干姜。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为280nm时，包括12个共有峰，以大黄酚9号色谱峰为参比峰，其他11个共有峰的相对保留时间的RSD％依次为1号色谱峰0.59％、2号色谱峰0.19％、3号色谱峰0.32％、4号色谱峰0.47％、5号色谱峰0.05％、6号色谱峰0.21％、7号色谱峰0.42％、8号色谱峰0.06％、10号色谱峰0.16％、11号色谱峰0.17％和12号色谱峰0.29％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含大黄和附子的中药复方的质量控制方法，该方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合则为合格产品，不符合则为不合格产品。
在一种优选的实施方式中，该符合的要求包括以下的一种或多种：
(1)该中药复方待测样品指纹图谱中呈现出12个特征色谱峰，其中9个色谱峰分别与该中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰保留时间值的±10％之内；
(2)以大黄酚对照品所对应的峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药复方待测样品指纹图谱与该中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述指纹图谱构建方法或上述质量控制方法在包含大黄和附子的中药复方的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
实施例1中药复方基准样品的指纹图谱测定方法
1.1仪器和试药
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；SHIMADZU(岛津)AUW120D十万分之一电子天平(日本岛津公司)、BSA124S万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。
试药：芦荟大黄素(批号：110795-201710，含量以98.3％计，中国食品药品检定研究院)，大黄酸(批号：110757-201607，含量以99.3％计，中国食品药品检定研究院)，大黄素(批号：110756-201913，含量以96.0％计，中国食品药品检定研究院)，大黄酚(批号：110796-201922，含量以99.4％计，中国食品药品检定研究院)，大黄素甲醚(批号：110758-201817，含量以99.2％计，中国食品药品检定研究院)，6-姜辣素(批号：111833-201806，含量以99.9％计，中国食品药品检定研究院)，甘草素(批号：AF8052202，纯度为98％，成都埃法生物科技有限公司)，异甘草素(批号：10256，纯度为98％，江苏永健医药科技有限公司)，甘草次酸(批号：100723-201715，含量以99.6％计，中国食品药品检定研究院)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；磷酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
1.2样品制备：
(1)样品的制备：按照处方比例称取1日处方量五味药材饮片(36g，其中大黄、人参、甘草、干姜和附子的质量比为2:1:1:1:1)，加水1600毫升，浸泡30分钟后，武火加热至沸腾后文火煎煮60分钟，用100目尼龙滤布滤过，煎煮液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(20℃)的流膏，取出，冷冻干燥，研磨成粉，即得中药复方基准样品冻干粉，根据此方法制备得20批不同批次的基准样品冻干粉，备用。
(2)供试品溶液的制备：分别取20批基准样品冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液备用。精密量取续滤液2ml通过PEP固相萃取小柱(200mg，用甲醇10ml预洗、75％甲醇(含0.1％甲酸)15ml平衡)，用75％甲醇(含0.1％甲酸)25ml洗脱，收集流出液和洗脱液，减压浓缩至近干，加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流45分钟，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加75％甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加75％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)混合对照品溶液的制备：取甘草素对照品、异甘草素对照品、芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品、6-姜辣素对照品和甘草次酸对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每1ml各含甘草素66μg、异甘草素7μg、芦荟大黄素7μg、大黄酸2μg、大黄素6μg、大黄酚12μg、大黄素甲醚2μg、6-姜辣素4μg和甘草次酸51μg的溶液，即得。
(4)缺各单味饮片阴性对照的制备：按照处方比例称取1日处方量缺各单味饮片的阴性基准样品处方，加水1600毫升，浸泡30分钟后，武火加热至沸腾后文火煎煮60分钟，用100目尼龙滤布滤过，煎煮液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(20℃)的流膏，取出，冷冻干燥，研磨成粉，即得缺各单味饮片的基准样品阴性冻干粉，备用。
(5)缺单味饮片阴性对照溶液的制备：分别取缺各单味饮片的基准样品阴性冻干粉约0.5g，精密称定，同“(2)供试品溶液的制备”制备得缺单味饮片阴性对照溶液，备用。
1.3色谱条件
色谱柱：CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm；
流动相：以甲醇-乙腈(28:72)为流动相A，以0.03％三氟乙酸溶液为流动相B；
流速：0.9ml/min；
波长：280nm；
进样量：10μl；
柱温：40℃；
理论板数按大黄酚峰计算不低于10000；
梯度洗脱程序如表1所示。
表1指纹图谱梯度洗脱程序
/>
1.3.1检测波长的选择
采用DAD检测器对供试品进行200-800nm范围内全波长扫描，对254、280、430nm波长下的色谱图进行比较，结果如图1和图2所示。(A：波长254nm B：波长280nm C：波长430nm)
从图1、图2可知：三个波长下色谱峰的数目、吸收强度、分离度存在差异，由于中药复方中大黄为君药，干姜为臣药，甘草为佐使药，根据组方原则以及相关法规要求，优先体现君、臣药的特征成分，故此检测波长不合适；当检测波长为430nm时，色谱峰信息较少；当检测波长为280nm时，色谱峰信息较多，基线平稳，君药大黄(芦荟大黄素(峰5)、大黄酸(峰6)、大黄素(峰8)、大黄酚(峰9)和大黄素甲醚(峰10))和臣药干姜(6-姜辣素(峰7))及佐使药甘草(甘草素(峰1)、异甘草素(峰3)、甘草次酸(峰12))中成分均有较好的吸收综合考虑，当波长280nm时，色谱峰数目最多，各个色谱峰吸收强度较平均，且分离度良好，因此最终选用280nm波长为最佳检测波长。
1.3.2流动相的选择
对流动相系统0.1％磷酸溶液-乙腈、0.1％磷酸溶液-甲醇、0.1％磷酸溶液-(甲醇-乙腈(28:72))进行筛选，结果如图3所示。
结果表明，0.1％磷酸溶液-(甲醇-乙腈(28:72))色谱峰出峰时间较适宜，对称性佳，分离度良好，特征峰明显，最终确定0.1％磷酸溶液-(甲醇-乙腈(28:72))为流动相系统。
其次，又对比了甲醇-乙腈(32:68)(比例1)、甲醇-乙腈(28:72)(比例2)和甲醇-乙腈(25:75)(比例3)3个甲醇与乙腈混合有机相不同比例，从图4可知：当流动相中有机相甲醇-乙腈为比例1时，峰2起峰位置有小杂峰包裹，由比例2和比例3中图谱对比可求证，大黄素(峰6)和6-姜辣素(峰7)未到达基线分离；当其为比例2时，即降低甲醇比例，峰2、大黄素(峰6)和6-姜辣素(峰7)分离均得到了较好的改善，各特征峰相对有较好的分离；当进一步降低甲醇比例，即比例3时，峰10与杂峰完全交叉重叠，分离变差；故综合确定甲醇-乙腈(28:72)(比例2)进行后续的研究，结果如图4所示。
1.3.3流动相梯度的选择
为使各特征峰峰均有较好的分离参数，呈现较优的色谱行为，对流动相梯度进行优化，结果如图5所示(A：梯度1B：梯度2C：梯度3)。
表2中药复方基准样品HPLC指纹图谱梯度1洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 35→63 | 65→37 |
| 8～13 | 63→67 | 37→23 |
表3中药复方基准样品HPLC指纹图谱梯度2洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 32→63 | 68→37 |
| 8～13 | 63→67 | 37→33 |
| 13～14 | 67→95 | 33→5 |
表4中药复方基准样品HPLC指纹图谱梯度3洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～1 | 30→32 | 70→68 |
| 1～8 | 32→63 | 68→37 |
| 8～13 | 63→67 | 37→33 |
| 13～14 | 67→95 | 33→5 |
从图5可知：洗脱梯度3条件下，各特征峰的分离情况好，保留时间适宜，对称性佳，理论板数较高，因此最终选择梯度3作为最佳洗脱梯度。
1.3.4流动相添加成分的选择
比较(甲醇-乙腈(28:72))-水(系统1)、(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％甲酸溶液(系统2)、(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％冰醋酸溶液(系统3)、(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％磷酸溶液(系统4)和(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％三氟乙酸溶液(系统5)对中药复方物质基准对应实物(冻干粉)供试品的分离效果，结果如图6所示。(A：系统1B：系统2C：系统3C：系统4C：系统5)
结果表明，不同流动相添加成分对特征峰的分离影响较大，尤其是大黄酸(峰6)；当流动相水相为水时，特征峰信息少，峰2、峰4、峰6(大黄酸)和峰12(甘草次酸)在此流动相系统下无色谱保留行为；当流动相水相为0.1％甲酸溶液时，峰4与杂峰完全重叠；当流动相水相为0.1％冰醋酸溶液时，峰4和峰6(大黄酸)分离情况较差；当流动相水相为0.1％磷酸溶液和0.1％三氟乙酸溶液时，各色谱峰的分离均较好，但其为0.1％三氟乙酸溶液时，特征峰对称性最佳，鉴于三氟乙酸为挥发性酸，对色谱柱寿命和仪器保护方面优于非挥发性酸(磷酸)，故综合选择(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％三氟乙酸溶液流动相系统作为流动相系统。
1.3.5不同三氟乙酸浓度流动相系统的选择
比较(甲醇-乙腈(28:72))-0.1％三氟乙酸溶液、(甲醇-乙腈(28:72))-0.05％三氟乙酸溶液、(甲醇-乙腈(28:72))-0.03％三氟乙酸溶液对中药复方物质基准对应实物(冻干粉)供试品的分离效果，结果如图7所示。(A：0.03％三氟乙酸溶液B：0.05％三氟乙酸溶液C：0.1％三氟乙酸溶液)
结果表明，当三氟乙酸浓度为0.03％时，峰6(大黄酸)和峰7(6-姜辣素)分离情况最佳，其次鉴于三氟乙酸为强酸，兼顾色谱柱的pH耐受范围，其较小的添加浓度有利于延长色谱柱寿命，故综合选择(甲醇-乙腈(28:72))-0.03％三氟乙酸溶液作为流动相系统。
1.3.6色谱柱的选择
考察不同色谱柱柱1：CORTECS T3(3.0×150mm，2.7μm)、柱2：HALO AQ C18(4.6mm×150mm，2.7μm)和柱3：CAPCELL PAK ADME(4.6mm×150mm，3μm)对中药复方基准样品(冻干粉)供试品的分离效果，结果如图8所示。(A：CORTECS T3色谱柱B：HALO AQ C18色谱柱C：CAPCELL PAK ADME色谱柱)
从图8可知：结果表明，当使用HALO AQ C18色谱柱时，相同梯度洗脱程序下，增强了对各特征峰的保留，导致出峰时间延长，峰1(甘草素)、峰2、峰4和峰12(甘草次酸)分离较差，与杂峰交叉；当使用CAPCELL PAK ADME色谱柱时，峰4、峰6(大黄酸)、峰7(6-姜辣素)、峰8(大黄素)和峰11分离差；当使用CORTECS T3色谱柱时，各特征峰的出峰时间较适宜，色谱峰分布均匀，分离好，系统适用性参数佳，因此最终选择CORTECS T3色谱柱作为HPLC指纹图谱的色谱柱。
1.3.7柱温的选择
分别对30℃、35℃和40℃的柱温条件进行筛选和优化，结果如图9所示。(A：30℃B：35℃C：40℃)
从图9可知：柱温30℃时，峰6(大黄酸)与峰7(6-姜辣素)完全重叠，分离情况差；升高柱温，有利于改善，峰6(大黄酸)与峰7(6-姜辣素)的分离；当柱温升高为40℃时，峰6(大黄酸)与峰7(6-姜辣素)达到基线分离，各特征峰分离相对较好，对称性佳，受干扰因素影响小，因此最终选择柱温40℃作为HPLC指纹图谱的最佳柱温条件。
1.3.8流速的选择
分别对0.7ml/min、0.8ml/min和0.9ml/min的流速条件进行筛选和优化，结果如图10所示。(A：0.7ml/min B：0.8ml/min C：0.9ml/min)从图10可知：当流速为0.9ml/min时，峰10(大黄素甲醚)与杂峰达到基线分离，各特征峰分离度良好，受干扰因素影响小，因此最终选择流速0.9ml/min作为HPLC指纹图谱的最佳流速条件。
1.4方法学考察
1.4.1仪器精密度试验
取1.2.1(2)项下方法制备的供试品溶液，按1.3项下的色谱条件，连续进样6次，每次进样10μl，以大黄酚色谱峰(9号峰)的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％值，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD％均小于2.0％，表明本仪器精密度良好。
1.4.2稳定性试验
取1.2.1(2)项下方法制备的供试品溶液，按1.3项下的色谱条件，分别在0、2、6、12、24、36、48h进样1次，每次进样10μl，以大黄酚色谱峰(9号峰)的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％值，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD％均小于4.0％，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。
1.4.3重复性试验
按1.2.1(2)项下方法制备供试品溶液6份，按1.3项下的色谱条件，按1.3项下的色谱条件，每次进样10μl，以大黄酚色谱峰(9号峰)的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％值，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD％均小于2.0％，表明本方法重复性良好。
1.5HPLC指纹图谱的建立及技术参数分析
1.5.1图谱采集
取1.2.1(1)项下方法制备的20批基准样品，按1.2.1(2)项下方法制备供试品溶液，按1.3项下的色谱条件进行测定，进样量10μl，记录HPLC指纹图谱。
1.5.2参照峰的选择
首先大黄酚为君药大黄的主要活性成分，其次从供试品溶液指纹图谱可知，大黄酚为已知化学成分，且化学性质稳定，其色谱峰在各色谱峰中，分离度较好和峰面积较大的，故选取9号峰(大黄酚)作为指纹图谱的参照峰。
1.5.3共有峰的标定和共有峰的相对保留时间和相对峰面积的计算
采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，对20批基准样品图谱进行数据匹配，结果如图11所示。由图11可见，其中12个峰为20批基准样品所共有，因此确定12个峰为共有色谱峰，以中位数法确定共有模式，结果如图12所示，以大黄酚峰(9号峰)的保留时间和色谱峰面积为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表5和表6所示。
表5中药复方基准样品共有峰相对保留时间
表6中药复方基准样品共有峰相对峰面积
从表5和表6可见：20批中药复方基准样品的共有峰的相对保留时间RSD％≤0.59％，小于2.0％，相对峰面积RSD％波动较大，由不同来源的药材饮片所导致，故在标准中不对相对峰面积值作规定，仅对特征峰的数目和相对保留时间和相似度作规定，因此该方法可用于中药复方基准样品的HPLC指纹图谱测定。
1.5.4特征峰的指认
首先采用混合对照品比较法进行特征峰指认，分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如图13所示。(A：混合对照品(1：甘草素3：异甘草素5：芦荟大黄素6：大黄酸7：6-姜辣素8：大黄素9：大黄酚10：大黄素甲醚12：甘草次酸)B：供试品)
从图13可见，确定1号峰为甘草素，3号峰为异甘草素，5号峰为芦荟大黄素，6号峰为大黄酸，7号峰为6-姜辣素，8号为大黄素，9号为大黄酚，10号峰为大黄素甲醚，12号为甘草次酸。
1.5.5特征峰归属分析
取1.2.1(2)项下的中药复方基准样品供试品溶液和1.2.1(3)项下方法制备的单味饮片阴性对照溶液各10μl，按照1.3项下的色谱条件进行测定，得到全方和方中缺各单味饮片阴性对照溶液的HPLC图谱，结果如图14所示。(A：全方B：大黄阴性对照C：干姜阴性对照D：甘草阴性对照E：附子阴性对照)
从图14可见：通过对比相对保留时间，对中药复方基准样品中共有峰的来源进行追溯，得出峰1、3、12来自甘草，峰2、4、5、6、8、9、10、11来自大黄，峰7来自干姜。
1.5.6 20批中药复方基准样品相似度评价
采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以对照谱图上标示的色谱峰作为匹配点，进行多点校正，并计算结果相似度，结果如表7所示。
表7 20批中药复方基准样品相似度计算结果
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从表7可见：20批中药复方基准样品指纹图谱的相似度在0.975～0.999之间，平均值为0.993，结果表明：20批中药复方基准样品质量一致性较高。
实施例2中药复方标准颗粒的质量控制方法
(1)按照实施例1中1.2.1(1)中的方法制备中药复方基准样品，采用实施例1中的测定方法建立中药复方基准样品的标准指纹图谱；
(2)取中药复方标准颗粒供试品溶液，按照实施例1中的测定方法得到指纹图谱；
(3)将步骤(2)得到的指纹图谱与步骤(1)得到的标准指纹图谱进行对比，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
所述符合的要求包括：供试品指纹图谱中应呈现12个特征峰，其中9个峰应分别与标准指纹图谱中相应的参照物峰保留时间相同；与大黄酚参照物相应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间应在标准指纹图谱保留时间值的±10％之内；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
所述中药复方标准颗粒供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取装量差异项下的中药复方标准颗粒，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液备用。精密量取续滤液2ml通过PEP固相萃取小柱(200mg，用甲醇10ml预洗、75％甲醇(含0.1％甲酸)15ml平衡)，用75％甲醇(含0.1％甲酸)25ml洗脱，收集流出液和洗脱液，减压浓缩至近干，加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流45分钟，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加75％甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加75％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (59)
1.一种包含大黄和附子的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中，所述中药复方包括大黄、人参、甘草、干姜和附子，所述对照品为甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸，
其中所述中药复方供试品溶液的制备方法包括以下步骤：称取适量的中药复方粉末，添加约75％甲醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过PEP固相萃取小柱，使用含0.1％甲酸的约75％甲醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加约75％甲醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到所述中药复方供试品溶液；
其中所述中药复方粉末的制备方法包括以下步骤：称取适量的大黄、人参、甘草、干姜和附子，得到饮片混合物，加水浸泡一段时间之后，武火加热至沸腾后文火煎煮一段时间，过滤，滤液浓缩成流膏，取出，干燥，研磨成粉，得到所述中药复方粉末；
所述检测的色谱条件为：采用CORTECS T3色谱柱，流动相A为甲醇和乙腈，其中甲醇与乙腈之间的比例为28:72，流动相B为0.1％磷酸溶液或0.01％～0.1％三氟乙酸溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.9ml/min，柱温为40℃，检测波长为280nm；
根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息和含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信息为根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分中一种或多种的含量：甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述饮片混合物与所述水的质量/体积之比为1:4～1:50。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述饮片混合物与所述水的质量/体积之比为约1:44。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述加水浸泡的时间为0.2～1h。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述加水浸泡的时间约0.5h。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述文火煎煮的时间为0.5～1.5h。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述文火煎煮的时间约1h。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述过滤为100～300目尼龙滤布过滤。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述流膏为在20℃下相对密度为1.10～1.15的流膏。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方粉末的制备方法中，所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的所述对照品溶液。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为约75％。
15.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进样量为5～20μl。
16.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述进样量为8～15μl。
17.根据权利要求16所述的检测方法，其特征在于，所述进样量为约10μl。
18.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
19.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
20.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述CORTECST3色谱柱为CORTECS T3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
21.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法进一步包括缺各单味饮片阴性对照溶液的制备与检测：该缺各单味饮片的中药复方阴性对照溶液的制备方法与该中药复方供试品溶液的制备方法相同。
22.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述超声提取的功率为300～700W。
23.根据权利要求22所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述超声提取的功率约500W。
24.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述超声提取的频率为30～50kHz。
25.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述超声提取的频率约40kHz。
26.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述中药复方与所述约75％甲醇的质量/体积之比为1:20～1:60。
27.根据权利要求26所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述中药复方与所述约75％甲醇的质量/体积之比为约1:25或约1:50。
28.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述固相萃取小柱的规格为200mg、300mg或500mg。
29.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述浓缩为减压浓缩或蒸干浓缩。
30.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述酸为盐酸和/或硫酸。
31.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述酸水解为先加入酸进行超声处理，再加入有机溶剂进行两相加热回流酸水解。
32.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷和/或乙醚。
33.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述萃取为振摇萃取。
34.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。
35.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述中药复方供试品溶液的制备方法中，所述过滤是采用微孔滤膜过滤。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5)。
37.根据权利要求36所述的检测方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
38.根据权利要求37所述的检测方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
39.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
40.根据权利要求39所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
41.一种包含大黄和附子的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
中药复方供试品溶液的制备：称取适量的中药复方粉末，添加约75％甲醇，经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后，放冷、补足重量、摇匀、过滤，取第一续滤液通过PEP固相萃取小柱，使用含0.1％甲酸的约75％甲醇进行洗脱，收集流出液和洗脱液，浓缩至接近干燥，加酸进行酸水解，有机溶剂萃取之后合并有机溶剂层，回收溶剂至干燥，残渣加约75％甲醇溶解，过滤，取第二续滤液，得到所述中药复方供试品溶液；
其中所述中药复方粉末的制备方法包括以下步骤：称取适量的大黄、人参、甘草、干姜和附子，得到饮片混合物，加水浸泡一段时间之后，武火加热至沸腾后文火煎煮一段时间，过滤，滤液浓缩成流膏，取出，干燥，研磨成粉，得到所述中药复方粉末；
对照品溶液的制备：称取适量的甘草素、异甘草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、6-姜辣素和甘草次酸；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为1～200μg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述中药复方供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
所述高效液相检测的色谱条件为：采用CORTECS T3色谱柱，流动相A为甲醇和乙腈，其中甲醇与乙腈之间的比例为28:72，流动相B为0.1％磷酸溶液或0.01％～0.1％三氟乙酸溶液，梯度洗脱程序为：0～1min，30％～32％A；1～8min，32％～63％A；8～13min，63％～67％A；13～14min，67％～95％A，流速为0.9ml/min，柱温为40℃，检测波长为280nm。
42.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为约75％。
43.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，进样量为5～20μl。
44.根据权利要求43所述的构建方法，其特征在于，所述进样量为8～15μl。
45.根据权利要求44所述的构建方法，其特征在于，所述进样量为约10μl。
46.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述大黄酚对应的色谱峰的理论塔板数不低于10000。
47.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
48.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，在所述检测波长为280nm时，所述指纹图谱包括1-12号峰，其中，9号峰为大黄酚作为参照峰，1号峰为甘草素，3号峰为异甘草素，5号峰为芦荟大黄素，6号峰为大黄酸，7号峰为6-姜辣素，8号为大黄素，10号为大黄素甲醚，12号峰为甘草次酸，其保留时间分别对应为10.0～10.2min、2.5～2.7min、4.9～5.1min、5.8～6.0min、6.4～6.6min、6.6～6.8min、8.5～8.7min、11.5～11.7min、14.8～15.0min。
49.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5):(0.5～5)。
50.根据权利要求49所述的构建方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5):(0.5～2.5)。
51.根据权利要求50所述的构建方法，其特征在于，所述中药复方中大黄、人参、甘草、干姜和附子的重量比为约2:约1:约1:约1:约1。
52.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液为甘草素浓度为60～70μg/ml、异甘草素浓度为5～10μg/ml、芦荟大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酸浓度为0.5～5μg/ml、大黄素浓度为5～10μg/ml、大黄酚浓度为10～20μg/ml、大黄素甲醚浓度为0.5～5μg/ml、6-姜辣素浓度为1～10μg/ml和甘草次酸浓度为40～100μg/ml的混合溶液。
53.根据权利要求52所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液为甘草素浓度为约66μg/ml、异甘草素浓度为约7μg/ml、芦荟大黄素浓度为约7μg/ml、大黄酸浓度为约2μg/ml、大黄素浓度为约6μg/ml、大黄酚浓度为约12μg/ml、大黄素甲醚浓度为约2μg/ml、6-姜辣素浓度为约4μg/ml和甘草次酸浓度为约51μg/ml的混合溶液。
54.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，所述CORTECST3色谱柱为CORTECST3色谱柱，3.0mm×150mm，2.7μm。
55.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，在所述检测波长为280nm时，1号峰、3号峰和12号峰来自药材甘草，2号峰、4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰、10号峰和11号峰来自药材大黄，7号峰来自药材干姜。
56.根据权利要求41所述的构建方法，其特征在于，在所述检测波长为280nm时，包括12个共有峰，以大黄酚9号色谱峰为参比峰，其他11个共有峰的相对保留时间的RSD％依次为1号色谱峰0.59％、2号色谱峰0.19％、3号色谱峰0.32％、4号色谱峰0.47％、5号色谱峰0.05％、6号色谱峰0.21％、7号色谱峰0.42％、8号色谱峰0.06％、10号色谱峰0.16％、11号色谱峰0.17％和12号色谱峰0.29％。
57.一种包含大黄和附子的中药复方的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)根据权利要求41至56中任一项所述的指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据权利要求41至56中任一项所述的指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的所述中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的所述中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合则为合格产品，不符合则为不合格产品。
58.根据权利要求57所述的质量控制方法，其特征在于，所述符合的要求包括以下的一种或多种：
(1)所述中药复方待测样品指纹图谱中呈现出12个特征色谱峰，其中9个色谱峰分别与所述中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰保留时间值的±10％之内；
(2)以大黄酚对照品所对应的峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在所述中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，所述中药复方待测样品指纹图谱与所述中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
59.根据权利要求1至40中任一项所述的检测方法或根据权利要求41至56中任一项所述的指纹图谱构建方法或根据权利要求57或58所述的质量控制方法在包含大黄和附子的中药复方的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
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| EP1336602A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-08-20 | Giovanni Scaramuzzino | Nitrate prodrugs able to release nitric oxide in a controlled and selective way and their use for prevention and treatment of inflammatory, ischemic and proliferative diseases |
| CN101897942A (zh) * | 2009-05-31 | 2010-12-01 | 北京四环科宝制药有限公司 | 温脾益肾,泄浊祛瘀的药物组合物的检测方法 |
| CN108896681A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-11-27 | 山东省分析测试中心 | 一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用 |
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