CN115902050A - 一种中药复方制剂高效液相指纹图谱的建立方法及应用 - Google Patents
一种中药复方制剂高效液相指纹图谱的建立方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种中药复方制剂的高效液相指纹图谱的建立方法及其应用，所述方法包括：(1)取该中药复方制剂适量，加入溶剂，超声处理，获得供试品溶液；(2)对步骤(1)获得的所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件为：使用C18色谱柱；以乙腈作为流动相A，以0.15％磷酸水溶液作为流动相B进行梯度洗脱；流速0.8‑1.2mL/分钟，柱温28℃‑35℃，进样体积8‑12μL，检测波长：290‑300nm。利用本申请所述方法测定的高效液相指纹图谱可快速、有效指认绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、大黄素6种成分，具有稳定、精密度高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，本发明涉及一种中药复方制剂高效液相指纹图谱的建立方法及应用，更具体地，本发明涉及尿清舒颗粒的高效液相指纹图谱的测定方法及其应用。
背景技术
尿清舒颗粒是由山木通、野菊花、虎杖、地胆草、车前草、重楼6味药组成的复方制剂，具有清热利湿，利水通淋的功效，用于湿热蕴结所致淋症，小便不利，淋沥涩痛，慢性前列腺炎属上述证候。
中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义，它在一定程度上反映了中药的化学物质基础。
尿清舒颗粒现行标准收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准(WS-10988(ZD-0988)-2002-2011Z)，该标准中包括了虎杖、野菊花、车前草的薄层鉴别，虎杖中大黄素的含量测定等质控指标。曾永长等研究了RP-HPLC法测定尿清舒颗粒中的虎杖苷含量。以上均是针对个别成分进行鉴别或含量测定的方法，难以全面表征尿清舒颗粒的质量，因此，建立一种尿清舒颗粒的标准指纹图谱进行质量控制具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种尿清舒颗粒指纹图谱的建立方法，用于对尿清舒颗粒的质量进行控制和评价。
本发明提供了一种尿清舒颗粒指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)取尿清舒颗粒适量，加入溶剂溶解，得到供试品溶液；(2)对步骤(1)获得的所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以获得所述尿清舒颗粒指纹图谱，其中，所述高效液相色谱检测的条件为：使用C18色谱柱；以乙腈作为流动相A，以0.10-0.15％磷酸水溶液作为流动相B进行梯度洗脱；流速0.8-1.2mL/min，柱温28-35℃，进样体积8-12μL，检测波长：290-300nm。根据本发明实施例的方法可以稳定有效的对所述尿清舒颗粒中的6种成分进行检测，获得所述尿清舒颗粒得指纹图谱，且所述方法具有较高的稳定性和精密度。
在一些实施方案中，本发明所述的溶剂为70-80体积％的甲醇溶液。在另一些实施方案中，本发明所述的溶剂为75体积％的甲醇溶液。
在一些实施方案中，本发明所述的尿清舒颗粒与所述溶剂的质量体积比为2g：(20-30)mL。在另一些实施方案中，本发明所述的尿清舒颗粒与所述溶剂的质量体积比为2g：25mL。
在一些实施方案中，所述溶解是通过超声处理10-60分钟进行的。在另一些实施方案中，所述超声处理的时间为10、30或60分钟。在另一些实施方案中，所述超声处理的条件为500W功率，40kHz频率，超声时间10分钟。
在一些实施方案中，对所述超声处理产物进行过滤处理。在另一些实施方案中，超声处理是利用滤膜对所述超声处理产物进行过滤处理。
在一些实施方案中，本发明所述的C18色谱柱尺寸为250mm×4.6mm，5μm。在另一些实施方案中，本发明所述的C18色谱柱C18色谱柱为：1)Waters Xbridge C18，尺寸250mm×4.6mm，5μm；2)Agilent Eclipse Plus C18，尺寸250mm×4.6mm，5μm；3)Agilent ZORBAXSB-CI8，尺寸250mm×4.6mm，5μm；或4)ACE Excel 5Super C18，尺寸250mm×4.6mm，5μm。
在一些实施方案中，流动相B为0.10％或0.15％磷酸水溶液。
在一些实施方案中，本发明所述的梯度为：
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0～20 | 5→10 | 95→90 |
| 20～28 | 10→15 | 90→85 |
| 28～55 | 15→17 | 85→83 |
| 55～80 | 17→40 | 83→60 |
| 80～85 | 40→90 | 60→10 |
| 85～95 | 90 | 10 |
在一些实施方案中，本发明所述的流速为1.0mL/分钟。
在一些实施方案中，本发明所述的柱温为30℃。
在一些实施方案中，本发明所述的进样体积为10μL。
在一些实施方案中，本发明所述的检测波长为295nm。
本发明尿清舒指纹图谱，指认了绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素6个色谱峰。以3号峰虎杖苷为参照峰，绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素的相对保留时间依次为：0.53±10％、0.61±10％、1、1.92±10％、1.99±10％和2.39±10％。
一些实施方案中，绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素的相对保留时间依次为：0.53、0.61、1.00、1.92、1.99和2.39。
采用本发明建立的尿清舒颗粒指纹图谱检测方法对样品进行检测，尿清舒颗粒质量控制合格的标准为：待测样品与所述尿清舒颗粒指纹图谱之间的相似度不低于0.90。
本发明首次构建了尿清舒颗粒高效液相指纹图谱质量控制方法，针对尿清舒颗粒所含有效成分的结构特点及理化性质，对供试品的处理方法、流动相、检测波长、洗脱程序、柱温、流速等分析条件进行了筛选和优化，完成了系统的方法学验证。所得尿清舒颗粒指纹图谱分离度高、峰形好，各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价尿清舒颗粒的质量，适用于对尿清舒颗粒产品质量的控制。
本发明建立的尿清舒颗粒高效液相指纹图谱克服了现有技术检测指标单一、不能反映内在质量的缺点，确定了多个尿清舒颗粒的指纹图谱的共有峰，从共有峰中鉴定出绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花甘、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素6种化学成分，归属到了处方中的4味药材，可对尿清舒颗粒的质量进行全面评价，有效地保证了成品的质量。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的所述对照指纹图谱；
图2是根据本发明实施例的22批尿清舒颗粒供试品采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图的叠加图；
图3是根据本发明实施例的22批尿清舒颗粒供试品采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的指纹图谱的共有峰的结果图；
图4A是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于野菊花的共有峰进行检测的结果图；
图4B是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于虎杖的共有峰进行检测的结果图；
图4C是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于车前草的共有峰进行检测的结果图；
图4D是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于地胆草的共有峰进行检测的结果图；
图4E是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于重楼的共有峰进行检测的结果图；
图4F是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对归属于山木通的共有峰进行检测的结果图；
图5是根据本发明实施例的采用本申请设计、筛选后的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法对绿原酸、隐绿原酸、蒙花苷、虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素进行共有峰指认的结果图；
图6A是根据本发明实施例的以甲醇-水为流动相的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图6B是根据本发明实施例的以乙腈-水为流动相的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图6C是根据本发明实施例的以乙腈-磷酸水溶液为流动相的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图6D是根据本发明实施例的以乙腈-甲酸水溶液为流动相的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图7A是根据本发明实施例的采用梯度1所示的流动相梯度的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图7B是根据本发明实施例的采用梯度2所示的流动相梯度的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图7C是根据本发明实施例的采用梯度3所示的流动相梯度的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图7D是根据本发明实施例的采用梯度4所示的流动相梯度的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图7E是根据本发明实施例的采用梯度5所示的流动相梯度的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图8是根据本发明实施例的采用210nm、230nm、254nm、280nm、295nm、330nm波长的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的叠加色谱图；
图9是根据本发明实施例的采用色谱柱1-4的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的叠加色谱图；
图10是根据本发明实施例的采用25℃、28℃、30℃、35℃色谱柱温的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的叠加色谱图；
图11是根据本发明实施例的采用0.8mL/min、1.0ml/min、1.2ml/min流速的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的叠加色谱图；
图12A是根据本发明实施例的人员1采用Waters高效液相色谱仪的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图12B是根据本发明实施例的人员2采用安捷伦高效液相色谱仪的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法获得的色谱图；
图13是根据本发明实施例的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法的重复性检测的实验结果图；
图14是根据本发明实施例的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法的仪器精密度检测的实验结果图；
图15是根据本发明实施例的尿清舒颗粒指纹图谱建立方法的溶液稳定性检测的实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明所述的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，所述尿清舒颗粒(Niaoqingshu Keli)的制备参照中华人民共和国国家药品监督管理局标准(试行)WS-10988(ZD-0988)-2002-2011Z，其处方如表1所示。具体的制备方法为：取以上六味药材，山木通、虎杖、重楼加水煎煮1小时后，再投入野菊花、地胆草、车前草继续煎煮30分钟，滤过，滤液备用；药渣再加水煎煮二次，第一次1小时，第二次30分钟；煎液滤过，合并，再与上述滤液合并，减压浓缩至相对密度为1.32-1.38(25℃)的稠膏，加入蔗糖及乳糖，混匀，用乙醇适量制成软材，制成颗粒，干燥、整粒，即得。
表1：尿清舒颗粒处方表
| 名称 | 重量(g) |
| 山木通 | 200 |
| 野菊花 | 240 |
| 虎杖 | 280 |
| 地胆草 | 280 |
| 车前草 | 280 |
| 重楼 | 120 |
| 蔗糖 | 520 |
| 乳糖 | 270 |
本发明涉及的仪器、试剂及材料如下：
仪器
电子微量天平(梅特勒-托利多XP6)；电子分析天平(梅特勒-托利多XS105)；恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司HWS24)；纯水机(上海和泰仪器有限公司Masrer-QUT)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司KQ5200DE)；沃特世e2695/2698高效液相色谱仪；安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪(附DAD检测器)；Waters Xbridge C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、ACE Excel 5Super C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、Agilent ZORBAXSB-CI8(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。
试剂
乙腈、磷酸为色谱纯；甲醇为分析纯。
对照品
大黄素对照品(批号：110756-201913，纯度96.0％)、虎杖苷对照品(批号：111575-201603，纯度87.3％)、蒙花苷对照品(批号：111528-201710，纯度96.6％)和绿原酸对照品(批号：110753-202018，纯度96.1％)购自中国食品药品检定研究院；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号：21-08-2302，纯度97.36％)和隐绿原酸对照品(批号：21-08-2304，纯度95.81％)购自SINCO公司。
药材
山木通(批号：201201，购自云南泰华丰功药业有限公司)、野菊花(批号：JZT20210315，购自九州通集团安国中药材有限公司)、虎杖(批号：21050702，购自安徽协和成药业饮片有限公司)、地胆草(批号：20210419001，购自广东药材医药有限公司)、车前草(批号：21051117，购自安徽协和成药业饮片有限公司)和重楼(批号：20210510001，购自广东药材医药有限公司)。
供试品
尿清舒颗粒样品信息见表2。
表2：尿清舒颗粒样品信息表
| 编号 | 批号 | 企业 |
| 1 | 05319003 | 一品红生物医药有限公司 |
| 2 | 05319005 | 一品红生物医药有限公司 |
| 3 | 05319006 | 一品红生物医药有限公司 |
| 4 | 05320003 | 一品红生物医药有限公司 |
| 5 | 05320015 | 一品红生物医药有限公司 |
| 6 | 05320016 | 一品红生物医药有限公司 |
| 7 | 05320019 | 一品红生物医药有限公司 |
| 8 | 05321001 | 一品红生物医药有限公司 |
| 9 | 05321002 | 一品红生物医药有限公司 |
| 10 | 05321003 | 一品红生物医药有限公司 |
| 11 | 05321004 | 一品红生物医药有限公司 |
| 12 | 05321005 | 一品红生物医药有限公司 |
| 13 | 05321006 | 一品红生物医药有限公司 |
| 14 | 05321007 | 一品红生物医药有限公司 |
| 15 | 05321008 | 一品红生物医药有限公司 |
| 16 | 05321009 | 一品红生物医药有限公司 |
| 17 | 05321012 | 一品红生物医药有限公司 |
| 18 | 05321013 | 一品红生物医药有限公司 |
| 19 | 05321016 | 一品红生物医药有限公司 |
| 20 | 05321021 | 一品红生物医药有限公司 |
| 21 | 05322001 | 一品红生物医药有限公司 |
| 22 | 05322002 | 一品红生物医药有限公司 |
阴性样品
按本品标准处方配比，按标准工艺制法自制得到阴性样品。山木通阴性样品(批号：21062901)，野菊花阴性样品(批号：21062901)，虎杖阴性样品(批号：21062901)，地胆草阴性样品(批号：21062901)，车前草阴性样品(批号：21062901)，重楼阴性样品(批号：21062901)。
实施例1尿清舒颗粒高效液相指纹图谱的建立
1.1参照物溶液的制备
取蒙花苷对照品、虎杖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷25μg、含虎杖苷40μg的混合溶液，即得。
1.2供试品溶液的制备
取本品适量，混匀，研细，取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声10分钟，放冷，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.3色谱条件及测定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，0.15％磷酸水溶液为流动相B，按表3的条件进行梯度洗脱；检测波长为295nm；流速1.0mL/分钟；柱温30℃。理论板数按虎杖苷峰计算应不低于3000；进样量为10μL。
表3：流动相梯度表
| 时间/min | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～20 | 5→10 | 95→90 |
| 20～28 | 10→15 | 90→85 |
| 28～55 | 15→17 | 85→83 |
| 55～80 | 17→40 | 83→60 |
| 80～85 | 40→90 | 60→10 |
| 85～95 | 90 | 10 |
1.4参照峰的选择
不同批次样品图谱中峰3(虎杖苷)、峰4(蒙花苷)的专属性强，化学成分明确，保留时间适中，且分离效果良好，故峰3(虎杖苷)、峰4(蒙花苷)均可作为参照峰。在波长295nm下，峰4(蒙花苷)的峰面积占比较其余共有峰的峰面积占比小；峰3(虎杖苷)的峰面积占比较其余共有峰的峰面积占比大，峰面积适中，故确定峰3(虎杖苷)为参照峰(S峰)。
1.5对照图谱的生成
将22批样品的图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，确定共有峰，建立了尿清舒颗粒高效液相指纹图谱，并以中位数法生成对照指纹图谱，对照指纹图谱如图1所示。
1.6相似度限度的制定
22批次样品与对照指纹图谱比较的相似度在0.996-1.000之间，结果如表4所示，计算22批次相似度的平均值为0.998，考虑到药材的来源及大生产带来的影响，将本品与对照指纹图谱的相似度限度制订为：按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90。
实施例2尿清舒颗粒共有峰的确认及归属
2.1共有峰的确认
对上述22个批次尿清舒颗粒样品，按照“1.2”项下制备供试品溶液，在“1.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。对所有样品的色谱图进行统计积分(积分参数：最小峰面积50，峰宽0.02，斜率30)后，将所得图谱以TXT格式导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，以S1色谱图为参照谱图，设置时间窗宽度为0.1分钟，以中位数法生成对照指纹图谱，运用多点校正方法对22批尿清舒颗粒样品的色谱峰进行Mark匹配，得到22批样品指纹图谱的叠加图，确定6个共有峰，如图2、3所示。
2.2共有峰的归属
2.2.1药材的归属
(1)药材提取液的制备
分别取山木通、野菊花、虎杖、地胆草、车前草、重楼药材饮片，粉碎，取药材粉末各约15g，第一次加水150mL，煮沸90分钟，滤过，第二次加水120mL，煮沸60分钟，滤过，分别合并2次滤液，即得山木通、野菊花、虎杖、地胆草、车前草、重楼药材提取液，滤过，即得。
(2)药材供试品溶液的制备
分别取山木通、野菊花、虎杖、地胆草、车前草、重楼药材提取液30mL滤液，蒸发至约2mL，残渣加75％甲醇25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为山木通、野菊花、虎杖、地胆草、车前草、重楼药材供试品溶液。
(3)阴性样品溶液的制备
取尿清舒颗粒的山木通阴性样品、野菊花阴性样品、车前草阴性样品、地胆草阴性样品、虎杖阴性样品、重楼阴性样品适量，按“1.2”项下方法制备，即得各阴性样品溶液。
取上述各药材提取液、药材供试品溶液、阴性样品溶液和“1.2”项下的供试品溶液，按“1.3”项下的色谱条件进行测定，记录295nm色谱图。根据色谱峰的保留时间信息，对指纹图谱的共有峰进行药材归属。
实验结果如图4A-4F所示，结果显示，6个共有峰中，峰1归属于地胆草、野菊花；峰2归属于地胆草、野菊花、车前草；峰3、5、6归属于虎杖；峰4归属于野菊花，未能确认出归属于山木通、重楼药材的共有峰。
2.2.2化学成分的归属
分别精密称定各对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含大黄素80μg、蒙花苷90μg的溶液；加50％甲醇制成每1mL含虎杖苷40μg的溶液；加60％甲醇制成每1mL含绿原酸40μg、隐绿原酸42μg的溶液；加75％甲醇制成每1mL含大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷80μg的溶液。分别取上述对照品溶液和“1.2”项下的供试品溶液，按照“1.3”项下的色谱条件依次进样测定，记录295nm色谱图。根据色谱峰的保留时间信息，对指纹图谱的共有峰进行化学成分归属。
检测结果如图5所示，6个共有峰中，峰1为绿原酸、峰2为隐绿原酸、峰3为虎杖苷、峰4为蒙花苷、峰5为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；峰6为大黄素。
综上所述，对6个共有峰进行了药材归属，并确认了化学成分，具体结果如表5所示。
表5：指纹图谱中各共有峰的药材及化学成分归属情况列表
实施例3尿清舒颗粒高效液相色谱检测方法的研究
在实施例1的基础上进行如下实验：
3.1检测方法考察
3.1.1流动相体系的考察
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，分别采用不同流动相系统(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水)进行试验，按表6中的梯度洗脱程序进样分析，采用DAD检测器，检测波长：254nm；流速：1.0mL/分钟；柱温：30℃；取“1.2”项下的供试品溶液进行检测，进样量为10μL；记录色谱图。
表6：
| 时间/min | A％(甲醇/乙腈) | B％(水/0.1％磷酸水/0.1％甲酸水) |
| 0～80 | 5→30 | 95→70 |
| 80～120 | 30→90 | 70→10 |
| 120～125 | 90→5 | 10→95 |
| 125～140 | 5 | 95 |
实验结果如图6A-6D所示，其中，以乙腈-磷酸水溶液为流动相获得的色谱图中色谱峰信息多，各色谱峰的峰型、分离效果均较好，因此选用乙腈-磷酸水溶液系统作为流动相体系。
3.1.2流动相梯度的考察
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，其中，梯度1-梯度4以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；梯度5以乙腈为流动相A，以0.15％磷酸水溶液为流动相B，采用DAD检测器，检测波长：254nm；流速为1.0mL/分钟；柱温为30℃。取“1.2”项下的供试品溶液进行检测，进样量为10μL，分别按表7所示的不同梯度进行洗脱。
表7：
实验结果如图7A-7E所示，其中，采用梯度5进行检测时，对应的各色谱峰能在梯度程序时间内被洗脱出来并且分离度较好，基线比较平稳，因此选择梯度5作为洗脱梯度。
3.1.3检测波长的考察
取“1.2”项下供试品溶液，按“1.3”项下的色谱条件，柱温为30℃，流速1.0mL/分钟，采用DAD二极管阵列检测器，对样品在200-400nm波长范围内进行扫描。
选取210nm、230nm、254nm、280nm、295nm、330nm波长结果，实验结果如图8所示，显示295nm色谱峰信息丰富，色谱峰分离度较好，峰面积分布均匀，基线平稳，因此选择295nm作为检测波长。
3.1.4提取条件的考察
将供试品溶液的制备方法确定为：取本品适量，混匀，研细，取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40KHz)10分钟，放冷，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.1.4.1提取方法考察
取本品适量，混匀，研细，取2.0g，精密称定，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入75％甲醇25mL，称定重量，一份静置澄清后取上清液直接过滤，其余5份超声处理(功率500w，频率40KHz)或加热回流不同时间，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。将不同的提取方法和提取时间制备的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。
实验结果如表8所示，发现回流和超声处理30分钟的样品检测结构峰面积相当，静置提取的较少。超声处理(功率500w，频率40KHz)不同时间的样品检测结果峰面积相当，超声处理10分钟可提取完全、操作简便，因此选择提取方法为超声处理10分钟。
表8：提取方式的考察(以单位质量的峰面积计)
3.1.4.2提取溶剂的考察
精密称定供试品粉末约2g，共6份，分别精密加入水或不同浓度的甲醇溶液或75％乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率500w，频率40KHz)30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应提取溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。将不同提取溶剂制备的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。
实验结果如表9所示，发现使用75％甲醇提取时所得单位质量峰面积大，因此选择75％甲醇作为提取溶剂。
表9：提取溶剂的考察(以单位质量的峰面积计)
| 峰号 | 水 | 25％甲醇 | 50％甲醇 | 75％甲醇 | 甲醇 | 75％乙醇 |
| 1 | 1767 | 1787 | 1755 | 1699 | 712 | 1819 |
| 2 | 1591 | 1620 | 1600 | 1558 | 791 | 943 |
| 3 | 9514 | 13058 | 19723 | 20701 | 14802 | 21224 |
| 4 | 1514 | 1742 | 2301 | 2416 | 1976 | 2427 |
| 5 | 2732 | 2823 | 5118 | 5391 | 4446 | 5346 |
| 6 | 533 | 133 | 2483 | 2826 | 2435 | 2946 |
3.1.4.3提取溶剂用量的考察
精密称定供试品粉末约2g，共3份，分别精密加入75％甲醇10mL、25mL、50mL，精密称定重量，超声处理(功率500w，频率40KHz)30分钟，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，然后按照“1.3”部分所示的色谱条件进行高效液相色谱检测。
实验结果如表10所示，发现提取溶剂用量为10mL时，溶剂量过少，供试品不溶物较多，峰3不能有效提取。溶剂用量为25mL和50mL时，样品提取比较完全，但提取溶剂用量为50mL时，峰1和峰2的峰面积较小；提取溶剂用量为25mL时，各色谱峰的峰面积适中，因此选择提取溶剂用量为25mL，经济环保有效。
表10：提取溶剂用量的考察(以总体积单位质量的峰面积计)
| 峰号 | 10mL | 25mL | 50mL |
| 1 | 46057 | 42469 | 44332 |
| 2 | 38304 | 38957 | 40486 |
| 3 | 23980 | 517529 | 547872 |
| 4 | 62878 | 60400 | 62143 |
| 5 | 129341 | 134778 | 139981 |
| 6 | 67990 | 70641 | 73655 |
3.1.5色谱柱的考察
本实验对3个品牌4种不同型号的色谱柱进行检测：色谱柱1：Waters Xbridge C18(4.6mm×250mm，5μm)、色谱柱2：Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)、色谱柱3：Agilent ZORBAX SB-CI8(4.6mm×250mm，5μm)、色谱柱4：ACE Excel 5Super C18(4.6mm×250mm，5μm)。
实验结果如表11及图9所示，结果表明，各色谱柱的柱效均较好，峰形对称，分离效果好。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，以对照指纹图谱为参照图谱，四根色谱柱的图谱与对照图谱相似度均大于0.99。
表11：不同色谱柱与对照指纹图谱的相似度
3.1.6柱温的考察
本实验取“1.2项下供试品溶液，针对不同柱温(25℃、28℃、30℃、35℃)对色谱峰分离效果进行检测，其余色谱条件同“1.3”。
实验结果如图10所示，其中，当柱温为25℃时，色谱峰的分离度较差，其余柱温条件下各色谱峰的分离效果均较好。
3.1.7流速的考察
分别考察了不同流速(0.8mL/分钟、1.0mL/分钟、1.2mL/分钟)对色谱峰分离效果的影响，取“1.2”项下供试品溶液，除流速外，其余的色谱条件同“1.3”。
实验结果如图11所示，其中，各流速条件下各色谱峰的分离效果均较好，其中，当流速为1.0mL/分钟时色谱峰的分离效果较优。
3.2中间精密度试验
取“1.2”项所示的供试品溶液，色谱条件同“1.3”所述，考察两个分析人员使用两台不同品牌的高效液相色谱仪：仪器A：安捷伦1260高效液相色谱仪，仪器B：Waters高效液相色谱仪对供试品指纹图谱的检测结果的影响。
实验结果如图12A和12B所示，结果显示两台仪器检测结果差别不大，图谱中指纹峰峰形对称，分离效果好。
3.3重复性试验
取同一批样品(批号为05321007)，约2.0g，精密称定，共6份，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下的色谱条件测定，记录色谱图。选取6个共有色谱峰，以3号峰(虎杖苷)为参照峰S，计算共有峰1-6的相对保留时间和相对峰面积。
具体的实验结果如表12-14及图13所示，结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD≤0.3％，共有峰的相对峰面积RSD≤2.1％；将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件进行处理，6份样品的图谱与对照图谱相似度均为1.000，结果表明方法的重复性良好。
表12重复性试验共有峰的相对保留时间
表13重复性试验共有峰的相对峰面积
表14重复性试验相似度评价结果
| 重复性相似度 | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | 重复性6 | 对照指纹图谱 |
| 重复性1 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性5 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 对照指纹图谱 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
3.4精密度试验
取本品(批号为05321007)1份，约2.0g，精密称定，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下的色谱条件测定，连续进样6针，记录色谱图。选取6个共有色谱峰，以3号峰(虎杖苷)为参照峰S，计算共有峰1-6的相对保留时间和相对峰面积。
实验结果如表15-17及图14所示。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD≤0.9％，共有峰的相对峰面积RSD≤1.7％；将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件进行处理，6次进样的图谱与对照图谱相似度均为1.000，表明精密度良好。
表15：精密度试验共有峰的相对保留时间
表16：精密度试验共有峰的相对峰面积
表17：精密度试验相似度评价结果
3.5稳定性试验
取本品(批号为05321007)，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下的色谱条件，分别于0、6、10、24、40、48小时注入液相色谱仪进行分析，记录色谱图。选取6个共有峰，以3号峰(虎杖苷)为参照峰S，计算共有峰1-6的相对保留时间和相对峰面积。
实验结果如表18-20及图15所示，结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD≤0.2％，共有峰的相对峰面积RSD≤1.2％；将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件进行处理，6次进样的图谱与对照图谱相似度均为1.000，结果表明供试品溶液在48小时内稳定。
表18：溶液稳定性试验共有峰的相对保留时间
表19：溶液稳定性试验共有峰的相对峰面积
表20：溶液稳定性试验相似度评价结果
| 稳定性相似度 | 0h | 6h | 10h | 24h | 40h | 48h | 对照指纹图谱 |
| 0h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 6h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 10h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 24h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 40h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 48h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 对照指纹图谱 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种尿清舒颗粒的高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取尿清舒颗粒适量，加入溶剂溶解，获得供试品溶液；
(2)对步骤(1)获得的所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以获得所述尿清舒颗粒指纹图谱，其中，所述高效液相色谱检测的条件为：
使用C18色谱柱；以乙腈作为流动相A，以0.15％磷酸水溶液作为流动相B进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱条件为：
流速0.8-1.2mL/min，柱温28℃-35℃，进样体积8μL-12μL，检测波长：290-300nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述尿清舒颗粒与所述溶剂的质量体积比为2g：(20-30)mL；
任选地，所述溶剂选自70-80体积％的甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述尿清舒颗粒与所述溶剂的质量体积比为2g：25mL；
任选地，所述溶剂为75体积％的甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解是通过超声处理10-60分钟进行的；
任选地，所述方法进一步包括：将超声处理产物进行过滤处理，以便获得供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C18色谱柱的尺寸为250mm×4.6mm，5μm；
任选地，所述流速为1.0mL/min；
任选地，所述柱温为30℃；
任选地，所述进样体积为10μL；
任选地，所述检测波长为295nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿清舒颗粒指纹图谱包含6个特征峰，分别对应绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素，以虎杖苷对照品色谱峰为参照峰，各个色谱峰的相对保留时间为：0.53±10％、0.61±10％、1.00、1.92±10％、1.99±10％和2.39±10％；
任选地，所述尿清舒颗粒指纹图谱中绿原酸、隐绿原酸、虎杖苷、蒙花苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素的相对保留时间为：0.53、0.61、1.00、1.92、1.99和2.39。
7.根据权利要求1-6中任一项所述方法得到的指纹图谱在尿清舒颗粒质量控制中的用途。
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Cited By (2)
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