CN116165320A - 养血安神片的中药指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种养血安神片的中药指纹图谱检测方法，通过液相色谱法建立其指纹图谱；以2，3，5，4＇‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸作为对照品；选用C18色谱柱，流动相为乙腈（A）‑0.1%甲酸溶液（B），流速为0.8‑1.5ml·min^‑1，柱温20‑40℃，紫外检测波长为280nm‑320nm；采用梯度洗脱的方式分离待测样品；将待测样品测得的色谱图经相似度评价系统计算其与对照指纹图谱的相似度，相似度大于0.90，即判断为质量合格。本发明的优势在于：可较为全面的评价养血安神片的整体质量；评价结果较为客观、准确，填补了养血安神片整体质量鉴定方面的空白。

Description

养血安神片的中药指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于测试分析领域，尤其涉及一种养血安神片的中药指纹图谱检测方法。

背景技术

养血安神片由首乌藤、仙鹤草、熟地黄、墨早莲等组方，具有滋阴养血、宁心安神之功效，临床用于治疗阴虚血少、头眩心悸、失眠健忘。该药收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第六册）》。

《卫生部药品标准·中药成方制剂（第六册）》一九九二年颁布，其中对于养血安神片检验指标较为落后，仅有【性状】和【检查】，不能对其真实性、安全性和有效性等进行科学控制，存在着严重的缺陷。现有的文献报道中，有对养血安神片中某些组分的薄层鉴别、一种或几种成分含量测定的相关研究，但能够综合评判药物整体质量的指纹图谱未见报道。

例如：封玉英等人在《高效液相色谱法测定养血安神片的含量》中提供了一种采用高效液相色谱法测定养血安神片中首乌藤组分的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的方法，以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为对照品，测定养血安神片中其含量，以实现控制该药品质量的目的。

但中药成分复杂，用药讲究配伍，全方药味协同作用治疗某种疾病，与西药有很大的不同，因此仅从单一成分的含量测定评价药物质量具有一定的局限性。

而养血安神片中整体处方成分异常复杂，各成分峰在色谱中相互干扰严重，在确定一种有效的分离、分析方法，尽可能多的将多药味特征峰同时呈现，并对特征峰进行归属确认，在定性及定量方面均能较好检测药品质量，达到多药味综合控制整体质量方面，存在较大的技术障碍。

发明内容

针对现有技术中能够有效分离，尽可能多的将养血安神片中多药味特征峰同时呈现，并对特征峰进行归属确认，在定性及定量方面均能较好检测养血安神片的质量的测试分析方法尚未出现的问题，本发明提供一种养血安神片的中药指纹图谱检测方法；该方法仅需一次测定，即可达到综合评估药物整体质量的目的。

本发明的技术方案如下：一种养血安神片的中药指纹图谱检测方法，包括如下步骤：

S1、取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸作为对照品，甲醇溶解制得混合对照品溶液；

S2、将不同批次养血安神片样品分别除去糖衣，研细，精密称取后加入甲醇超声提取、过滤得到供试品溶液；

S3、吸取步骤S1、S2中的混合对照品溶液与各供试品溶液，依次注入高效液相色谱仪进行检测，得到各样品的色谱图；

S4、采用中药指纹图谱相似度评价系统对各样品色谱图进行分析，生成对照指纹图谱；

S5、将待测样品按步骤S2得到的色谱图在中药指纹图谱相似度评价系统中计算其与对照指纹图谱的相似度，当相似度不低于0.90，即判断为质量合格的养血安神片制剂；

所述步骤S3中色谱条件为：选用C18色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），流速为0.8-1.5ml·min^-1，柱温20-40℃，紫外检测波长为280nm-320nm；梯度洗脱条件0～10min，2% A；10～33 min，2%A→19%A；33～50min，19%A→26%A；50～60min，26%A→40%A；60～65min，40%A；65～67min，40%A→2%A；67～75min，2%A。

进一步的，所述步骤S1、S2中甲醇为纯甲醇、50%甲醇、80%甲醇中任一种。

优选的，所述步骤S1、S2中甲醇为80%甲醇。

优选的，步骤S3中紫外检测波长为0～28min、280nm，28～52min、320nm，52～75min、280nm。

优选的，步骤S3中色谱柱C18规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm；流动相流速为1ml·min^-1，色谱柱柱温30℃。

进一步的，所述步骤S4的对照指纹图谱中包含13个共有峰，其中1-3号峰为地黄及熟地黄的特征峰，2为没食子酸；4-7号峰为首乌藤、鸡血藤、墨旱莲的共有成分峰，4为原儿茶酸、5为绿原酸；9号峰为首乌藤特征峰2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷；13、14号峰主要来源于仙鹤草。

进一步的，所述步骤S1中分别取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸对照品各2.5mg，置同一10ml容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml各含0.25mg的混合对照品溶液。

进一步的，所述步骤S1中还包括步骤S11：分别取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸对照品各2.5mg加80%甲醇10ml溶解，制成每1ml各含0.25mg的单一对照品溶液；

所述步骤S3中还包括将步骤S11中的各单一对照品溶液依次进样，用以定位各对照品的色谱峰。

进一步的，步骤S2中养血安神片样品除去糖衣，精密称定，研细，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声（功率250W，频率40kHz）提取30min，放至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

进一步地，所述步骤S2中养血安神片样品包括片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液、软胶囊、散剂或滴丸剂。

本发明的优势在于：系统的选择了对照品，流动相、线性梯度洗脱条件、紫外检测波长等参数，实现了尽可能多的将养血安神片处方中多药味成分综合展现在一张谱图上，通过特征色谱峰的个数、保留时间、峰高、峰面积大小等多种因素与对照指纹谱图对比相似度高低，可较为全面的评价养血安神片的整体质量。评价结果较为客观、准确，填补了养血安神片整体质量鉴定方面的空白。

附图说明

图1为混合对照品色谱图；

图2为养血安神片供试品色谱图；

图3为中药指纹图谱相似度评价系统生成的对照指纹图谱；

图4为1-8号样品图谱与对照指纹图谱Mark峰匹配图；

图5为9-16号样品图谱与对照指纹图谱Mark峰匹配图；

图6为所测样品与对照指纹图谱的相似度聚类分析图；

图7为纯甲醇提取的养血安神片样品色谱图；

图8为50%甲醇提取的养血安神片样品色谱图；

图9为80%甲醇提取的养血安神片样品色谱图；

图10为稀乙醇、80%甲醇、50%甲醇分别提取的样品色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过液相色谱建立的养血安神片的指纹图谱，对测定结果采用与标准谱图比较相似度的方法进行判定，可从定性定量两方面综合考量，不局限于某味药某种成分的单独测定。本发明建立的指纹图谱从养血安神片的众多复杂有效组分中选用2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸作为混合对照品，系统的选择了流动相、线性梯度洗脱条件、紫外检测波长等参数，可有效指认养血安神片的主要色谱峰，在该测定条件下，所测得的养血安神片指纹图谱能够反映其处方中主要组分的主要有效成分。

实施例1

养血安神片的指纹图谱检测方法，采用Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，具体色谱条件如下：

色谱柱：资生堂 SHISEIDO CAPCELL PAK C18，4.6×250mm，5μm

流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）

梯度洗脱条件：0～10 min，2% A；10～33 min，2%A→19%A；33～50min，19%A→26%A；50～60min，26%A→40%A；60～65min，40%A；65～67min，40%A→2%A；67～75min，2%A。

流速: 1.0ml·min^-1；

紫外检测波长：0～28min：280nm；28～52min：320nm；52～75min：280nm。

柱温：30℃。

对照品溶液的制备：分别取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸对照品各2.5mg，加80%甲醇10ml溶解，制成每1ml各含0.25mg的单一对照品溶液（定位用）；再各取2.5mg，置同一10ml容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml各含0.25mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：选取10家生产单位共16个批次的养血安神片，每个批次取养血安神片样品10片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声（功率250W，频率40kHz）提取30 min，放至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得到16份供试品溶液。

测定方法：分别精密吸取混合对照品溶液与各供试品溶液各10μl，依次注入液相色谱仪，测得16批次的养血安神片样品指纹图谱。（单一对照品溶液可先于混合对照品溶液进样，实现对色谱峰进行定位）

依据上述方法测定混合对照品溶液及供试品溶液，得到色谱图如图1、图2所示，图1混合对照品溶液色谱图中2为没食子酸、4为原儿茶酸、5为绿原酸、9为2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷；图2为11号样品（代表样品）养血安神片供试品色谱图，色谱中前5min色谱峰成分复杂，干扰严重，弃去；选取保留时间5min以后、色谱峰形对称、峰高明显、分离度不小于1.5的峰进行标注，得到16个色谱峰；其中1-3号峰为地黄及熟地黄的特征峰，峰9为首乌藤特征峰，峰13、14主要来源于仙鹤草，峰4-8为多药味的共有成分，如首乌藤、鸡血藤、墨旱莲等。

样品图谱评价：

继续采用国家药典委员会主持开发的中药指纹图谱相似度评价系统（2010版）对16批次样品色谱图进行分析，在软件中依样品情况生成对照指纹图谱，如图3所示，共包括13个共有峰，对于图2中16个特征峰，峰8、10、12因有的样品中峰高和峰面积太小而未算在共有峰内。将各样品分别与对照指纹图谱进行多点校正，Mark峰匹配，并计算相似度。匹配谱图见图4、5，1~16号样品的相似度计算结果见表1。

表1 1~16号样品相似度分析结果

样品编号	相似度结果	样品编号	相似度结果
				1	0.880	9	0.896
2	0.857	10	0.965
				3	0.922	11	0.985
4	0.949	12	0.944
				5	0.921	13	0.847
6	0.779	14	0.771
				7	0.894	15	0.865
8	0.926	16	0.943

采用SPSS 18.0统计学软件中系统聚类法的Ward 法，选取平方Euclidean 距离为度量标准，对所测样品与对照指纹谱图的相似度进行系统聚类分析，测试结果如图6所示，按相似度大小可将16组样品分为五小类；相似度0.90以上及以下的分别聚为两大类，组间距离最大；通过聚类分析可以看出样品6及14单独聚为一小类，离群明显。

样品测定结果显示：

（1）16批次的样品相似度在0.771～0.985之间，发现某些企业样品离散较远。通过色谱图对比，发现这些企业色谱图差异性较大，如6、14号样品，相似度在0.80以下，聚类分析也将其聚为一类，指纹图谱显示其在18～50min范围内色谱峰个数和峰面积与对照指纹谱图均有较大差异，尤其是9号峰及13号峰，表明样品的化学成分组成有较大差异；峰面积小或者缺失，提示存在多药味少投或用不合格品替代投料等嫌疑，质量较差。

（2）相似度在0.80～0.90之间的样品，查看色谱图发现，色谱峰峰9和峰13对相似度的贡献较大，其次峰1～3，该区间的样品地黄、熟地黄特征峰与首乌藤特征峰的大小呈现不规律变化，任何药味特征峰明显低于标准谱图均能降低相似度，提示地黄、熟地黄或首乌藤可能存在少投或用不合格品替代投料等嫌疑，质量一般。

（3）相似度高于0.90以上，色谱峰离散小，表明样品质量较好。

（4）供试品制备时样品溶液颜色与色谱图也具有一定的相关性，颜色浅的样品在图中1～3号色谱峰峰面积均较小，指纹图谱相似度低，提示地黄及熟地黄存在不按规定投料的嫌疑。本发明研究时同时按处方工艺自制一份样品平行测定进行验证，溶液颜色较深，指纹图谱与参照图谱相似度为0.966，与样品预期测定结果基本一致。

本发明收集的养血安神片依据现有的质量标准均为合格样品，但指纹图谱上的体现的差异性说明所建立的指纹图谱更能反映样品的真实性，为养血安神片的质量控制提供了更有效的技术方法。

本发明的方法验证试验：

精密度试验：取同一批号的供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，以9号峰（2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰）为参照峰，色谱图中1-16号峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批号供试品溶液，按上述色谱条件分别于0h、2.5h、5h、7.5h、10h、15h、20h、24h进行测定，共计进样8次，以9号峰(2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰)为参照峰，测定其稳定性。测试结果表明色谱图中1-16号峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明供试品溶液在24小时内稳定。

重复性试验：取同一批号的样品6份，按供试品溶液制备方法制备并依法测定。以9号峰（2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰）为参照峰，色谱图中1-16号峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明本发明的指纹图谱检测方法重复性良好。

共有峰及主要色谱峰指认分析过程：

按供试品溶液制备方法和色谱条件对收集的10家共16个批次的养血安神片的指纹图谱进行测定。依据测定结果，确定13个共有峰作为养血安神片的特征峰（峰8、10、12因在某些样品中峰高及峰面积都太小，因此未算作共有峰）。

采用HPLC-DAD法对养血安神片指纹图谱中特征峰进行指认。通过查阅文献，了解该制剂中各处方药味可能含有的化学成分，分别配制单一对照品溶液进行保留时间及紫外吸收光谱的比对，最终确定2、4、5和9号峰分别为没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷；也即本发明选取的对照品物质；结合单一药材在相同条件下的测定图谱及色谱峰的紫外吸收光谱，可以判断1-3号峰为地黄及熟地黄的特征峰，峰9为首乌藤特征峰，峰13、14主要来源于仙鹤草，峰4-8为多药味的共有成分，如首乌藤、鸡血藤、墨旱莲等。

对比例1

本次试验对比了同一色谱仪、色谱柱、流动相条件下、以13号样品为例，测定其在提取溶剂分别为甲醇、50%甲醇、80%甲醇、稀乙醇时的高效液相色谱图。

图7为纯甲醇提取的养血安神片样品色谱图，结果表明该条件提取的样品溶液颜色浅，色谱图前半段出峰时间的3D光谱图色谱峰小而且杂乱，在280nm紫外检测波长下相对较好，后半段出峰时间在320nm检测波长下色谱峰个数、峰高相对理想。320nm是处方中君药首乌藤特征性成分2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的紫外最大吸收波长，因此除了3D扫描寻找最佳波长（280nm）外，本发明也将320nm的波长作为重点考虑参数。

图8为50%甲醇提取的养血安神片样品色谱图，可以看出该提取条件下全图色谱峰个数及峰高都有所改善；效果优于纯甲醇作为溶剂提取的色谱图。

图9为80%甲醇提取的养血安神片样品色谱图，该条件下全图色谱峰与50%甲醇提取的类似。

图10为稀乙醇、80%甲醇、50%甲醇分别提取的样品在280nm测定的色谱图，显示各图峰的个数基本一致，但80%甲醇在峰形、峰高优于其他。另因为50%甲醇、稀乙醇不易过滤，综合各方面因素，因而本发明最终选择80%甲醇作为提取试剂，同时采用波长切换法测定指纹图谱。

地黄、合欢皮、墨旱莲等药材标准（《中国药典》2020年版）均采用低波长测定相关成分含量，然而养血安神片在低波长处色谱图基线漂移严重、采用二极管阵列检测器进行全波长扫描发现低波长附近成分异常复杂，无法实现理想分离，且含量低的成分采集效果很差。3D光谱图显示在280nm及320nm附近均有较理想的紫外吸收峰，因此本发明在进行提取溶剂选择时，也重点呈现了这两个波长处色谱图的情况，为使指纹图谱中呈现较多色谱信息且响应值适宜，最终决定采用不同时间280nm、320nm切换波长法测定，最终结果无需拟合，可直接得到色谱信息最大化的色谱图。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸作为对照品，甲醇溶解制得混合对照品溶液；

S2、将不同批次养血安神片样品分别除去糖衣，研细，精密称取后加入甲醇超声提取、过滤得到供试品溶液；

S3、吸取步骤S1、S2中的混合对照品溶液与各供试品溶液，依次注入高效液相色谱仪进行检测，得到各样品的色谱图；

S4、采用中药指纹图谱相似度评价系统对各样品色谱图进行分析，生成对照指纹图谱；

S5、将待测样品按步骤S2得到的色谱图在中药指纹图谱相似度评价系统中计算其与对照指纹图谱的相似度，当相似度不低于0.90，即判断为质量合格的养血安神片制剂；

所述步骤S3中色谱条件为：选用C18色谱柱，流动相A为乙腈、流动相B为0.1%甲酸溶液，流速为0.8-1.5ml·min^-1，柱温20-40℃，紫外检测波长为280nm-320nm；梯度洗脱条件0～10min，2% A；10～33 min，2%A→19%A；33～50min，19%A→26%A；50～60min，26%A→40%A；60～65min，40%A；65～67min，40%A→2%A；67～75min，2%A。

2.根据权利要求1所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S1、S2中甲醇为纯甲醇、50%甲醇、80%甲醇中任一种。

3.根据权利要求2所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S1、S2中甲醇为80%甲醇。

4.根据权利要求1所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤S3中紫外检测波长为0～28min、280nm，28～52min、320nm，52～75min、280nm。

5.根据权利要求1至4任一所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤S3中色谱柱C18规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm；流动相流速为1ml·min^-1，色谱柱柱温30℃。

6.根据权利要求1所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S4的对照指纹图谱中包含13个共有峰，其中1-3号峰为地黄及熟地黄的特征峰，2为没食子酸；4-7号峰为首乌藤、鸡血藤、墨旱莲的共有成分峰，4为原儿茶酸、5为绿原酸；9号峰为首乌藤特征峰2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷；13、14号峰主要来源于仙鹤草。

7.根据权利要求1或3所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤S1中分别取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸对照品各2.5mg，置同一10ml容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml各含0.25mg的混合对照品溶液。

8.根据权利要求7所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括步骤S11：

分别取2，3，5，4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸对照品各2.5mg加80%甲醇10ml溶解，制成每1ml各含0.25mg的单一对照品溶液；

所述步骤S3中还包括将步骤S11中的各单一对照品溶液依次进样，用以定位各对照品的色谱峰。

9.根据权利要求8所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤S2中养血安神片样品除去糖衣，精密称定，研细，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声提取30min，放至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

10.根据权利要求1所述的养血安神片的中药指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S2中养血安神片样品包括片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液、软胶囊、散剂或滴丸剂。

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