CN111948330B - 仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，仁术健胃颗粒指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、仁术健胃颗粒供试品溶液的制备；步骤2、混合标准品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合标准品溶液注入液相色谱仪，记录标准品色谱图；步骤4，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录样品色谱图。本发明所提供的仁术健胃颗粒指纹图谱，能全面，客观地表征仁术健胃颗粒的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

仁术健胃颗粒由全国名中医、江苏省中医院(国家中医脾胃病临床研究基地)脾胃病科学术带头人单兆伟教授研究开发，四十余年来单兆伟教授通过系列临床及基础研究总结提出萎缩性胃炎胃黏膜癌前病变的主要病机特点是“气虚血瘀热郁”，制定“益气活血清热”为主要治疗法则，研究开发仁术健胃颗粒，该院内制剂由中药黄芪、白术、薏苡仁、黄芩、仙鹤草、莪术、半边莲、白花蛇舌草制成。多项研究表明，仁术健胃颗粒具有良好的治疗萎缩性胃炎胃黏膜癌前期病变的疗效，该药作为江苏省中医院院内制剂已有二十余年的应用基础，2004年9月以来累计约使用100万盒；其中2019年使用量约为20万盒。但是该制剂还未有全面、客观、多指标的质量评价方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种仁术健胃颗粒的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价仁术健胃颗粒的质量，对控制仁术健胃颗粒的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

步骤1、仁术健胃颗粒供试品溶液的制备：

取不同批次的仁术健胃颗粒，分别精密称取仁术健胃颗粒样品，置锥形瓶中，加甲醇，超声处理，静置，取上清液，过微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合标准品溶液的制备：

精密称定绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准品溶液；

步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录混合标准品色谱图；

步骤4，分别精密吸取步骤1的各批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录样品色谱图；

步骤5，将步骤4中获得的仁术健胃颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次仁术健胃颗粒供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成仁术健胃颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，步骤1仁术健胃颗粒供试品溶液制备方法为：取10批次的仁术健胃颗粒，精密称取仁术健胃颗粒样品2g(内容物重量)置100mL锥形瓶中，加甲醇30mL，超声处理30min，静置，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，步骤2混合标准品溶液的制备：取精密称定绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.067mg/mL的绿原酸、0.114mg/mL毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.072mg/mL木樨草苷、0.086mg/mL黄芩苷、0.094mg/mL黄芩素混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈(A)和0.1％乙酸水(B)，紫外检测器，检测波长：260nm，柱温35℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

。

作为优选方案，以上所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰18个。其中绿原酸保留时间为13.46min，为2号峰；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的保留时间为21.69min，为5号峰；木樨草苷的保留时间为23.29min，为6号峰；黄芩苷的保留时间为40.19min，为12号峰；黄芩素的保留时间为42.43min，为13号峰。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)、进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图差异较小，且超声提取效率高，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取260nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为260nm时，色谱峰响应值比较高，被检测出来的成分最多，故选260nm为检测波长；

对流速(1mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min)进行筛选，因仁术健胃颗粒中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为1mL/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。

本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％乙酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1％乙酸水，为流动相时，仁术健胃颗粒中各成分能达到很好的分离效果，故最终选定以乙腈和0.1％乙酸水，为流动相。

在优选出最佳的流动相组成后，由于仁术健胃颗粒含有酚酸、萜类、黄酮、皂苷等多类成分。大等度洗脱方式不能很好的实现各成分的良好分离，因此本发明继续筛选了梯度洗脱方式，筛选得到最佳的梯度洗脱方式为：0.01～5分钟，乙腈体积百分含量为10～10％；5～40分钟，乙腈体积百分含量为10～40％；40～60分钟，乙腈体积百分含量为40～60％。

有益效果：

1、本发明根据仁术健胃颗粒中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的仁术健胃颗粒指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价仁术健胃颗粒的质量，为保证临床仁术健胃颗粒疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的仁术健胃颗粒指纹图谱，能有效地表征仁术健胃颗粒的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定仁术健胃颗粒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明的混合标准品的指纹图谱。

图2为本发明仁术健胃颗粒样品的供试品对照指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司双波长扫描高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统SIL-20A，紫外检测器SPD-20A和自动温控柱温箱CTD-20AC，KH-500E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，ML104/02电子分析天平(Mettler Toledo)。

1.2药品与试剂

10个批次(190101；190201；190301；190302；190303；190501；190502；190503；190801；191201)仁术健胃颗粒样品由江苏省中医院提供(由黄芪、麸炒白术、薏苡仁、酒炒黄芩、仙鹤草、莪术、半边莲、白花蛇舌蛇草八味药制)；绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品购自于中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯)；乙腈(色谱纯)；水(娃哈哈纯净水)。

实施例1一种仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、仁术健胃颗粒供试品溶液的制备：

取以上10个批次的仁术健胃颗粒，然后精密称取仁术健胃颗粒样品0.5g(内容物重量)置100mL锥形瓶中，加甲醇30mL，超声处理30min，静置，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得10批次的供试品溶液。

步骤2、混合标准品溶液的制备：

取精密称定绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成0.067mg/mL的绿原酸、0.114mg/mL毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.072mg/mL木樨草苷、0.086mg/mL黄芩苷、0.094mg/mL黄芩素混合对照品溶液。混合对照品色谱图如图1所示。

步骤3、分别精密吸取步骤1的10批仁术健胃颗粒供试品溶液和步骤2的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈(A)和0.1％乙酸水(B)，紫外检测器，检测波长：260nm，柱温35℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

程序	时间(min)	乙腈浓度(％)
			1	0.01	10
2	5.00	10
			3	40.00	40
4	60.00	60

。

步骤4、将步骤3中获得的10批仁术健胃颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，结果仁术健胃颗粒中有18个共有峰，对照指纹图谱见图2。根据混合对照品确定绿原酸保留时间为13.46min，图中2号峰；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的保留时间为21.69min，图中5号峰；木樨草苷的保留时间为23.29min，图中6号峰；黄芩苷的保留时间为40.19min图中12号峰；黄芩素的保留时间为42.43min图中13号峰。

指纹图谱检测方法的法学研究：

1、精密度研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，进样量为10μL，以绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间，并计算RSD值，采用“中药色谱相似度评价软件2004A”进行指纹图谱比对及数据分析，结果相似度为0.96，结果表明该设备的平行进样精密度良好。

2、稳定性研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析，进样量为10μL，以绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，相似度为0.95，表明仁术健胃颗粒供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性非常好。

3、重复性研究

平行精密称取编号为S1样品六份，每份仁术健胃颗粒中药的重量为1g，按照实施例1的方法制成6份同样的供试品溶液，参照实施例1的色谱条件，进样量为10μL，以绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，相似度为0.99，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。

以上实验结果表明，本发明提供的仁术健胃颗粒指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价仁术健胃颗粒的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、仁术健胃颗粒供试品溶液的制备：

取不同批次的仁术健胃颗粒，分别精密称取仁术健胃颗粒样品，置锥形瓶中，加甲醇，超声处理，静置，取上清液，过微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合标准品溶液的制备：

精密称定绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准品溶液；

步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录混合标准品色谱图；

步骤4，分别精密吸取步骤1的各批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录样品色谱图；

步骤5，将步骤4中获得的仁术健胃颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次仁术健胃颗粒供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成仁术健胃颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

步骤3和步骤4中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈为A相，0.1%乙酸水为B相，紫外检测器，检测波长：260nm，柱温35℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序为：0.01min，10%乙腈、5min，10%乙腈、40min，40%乙腈、60min，60%乙腈。

2.根据权利要求1所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1仁术健胃颗粒供试品溶液制备方法为：取10批次的仁术健胃颗粒，精密称取仁术健胃颗粒样品2g置100mL锥形瓶中，加甲醇30mL，超声处理30min，静置，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合标准品溶液的制备：取精密称定绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、木樨草苷、黄芩苷、黄芩素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.067mg/mL的绿原酸、0.114mg/mL毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.072mg/mL木樨草苷、0.086mg/mL黄芩苷、0.094mg/mL黄芩素混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的仁术健胃颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰18个；其中绿原酸保留时间为13.46min，为2号峰；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的保留时间为21.69min，为5号峰；木樨草苷的保留时间为23.29min，为6号峰；黄芩苷的保留时间为40.19min，为12号峰；黄芩素的保留时间为42.43min，为13号峰。

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