CN114113436B - 基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，所述方法为采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法测定待测黄芩样品溶液，得到黄芩样品指纹图谱，收集所述指纹图谱的2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号和10号色谱峰的峰面积；峰面积求和，再根据峰面积‑总黄酮含量的数学模型，即得所述待测黄芩样品的总黄酮含量。本发明的黄芩总黄酮含量的测定方法，根据黄芩指纹图谱中与总黄酮含量显著相关的色谱峰的峰面积来计算总黄酮含量，从而实现“一张指纹图谱既可整体定性又可整体定量”的双重质量控制效果，为黄芩整体质量控制提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明属于成分分析技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，及其在黄芩药材质量控制中的应用。
背景技术
黄酮类成分是黄芩的主要化学成分和特征性成分，其种类繁多，主要包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素以及千层纸素A等，具有抗流感、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药效活性，是黄芩的主要药效部位。
关于黄芩总黄酮含量测定已有大量的研究报道。目前常用的方法有紫外分光光度法和高效液相指纹图谱法。如王磊等以芦丁为对照品采用紫外分光光度法(415nm)测定了不同产地黄芩中总黄酮的含量，含量为10.20％～12.57％；阿木古楞等以芦丁为对照品采用紫外分光光度法(510nm)测定了不同超声提取条件下黄芩提取液中总黄酮的含量，宋国虎等采用紫外分光光度法研究了承德地区二年生黄芩生长发育过程中总黄酮含量的动态积累变化规律，最高含量为42.92％；李玉兰等以黄芩苷为对照品采用紫外分光光度法(278nm)测定了从黄芩中提取和纯化的总黄酮含量，粗提物中含量为15.8％。田海丽等以芸香苷为对照品采用紫外分光光度法(510nm)测定了黄芩不定根中的总黄酮含量。紫外分光光度法，方法较成熟，应用较多，但仅通过一个含量数据进行质量优劣判别，无法呈现出总黄酮多成分特点的内在质量概貌。
关于黄芩高效液相指纹图谱的研究报道也很多，田甜等开展了不同产地和不同年限黄芩HPLC指纹图谱的研究，共检出13个共有峰，并通过对照品指认出黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A；管仁伟等建立了不同种质黄芩高效液相色谱指纹图谱，共检出11个共有峰，并通过对照品指认出黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素；郑如文等开展黄芩UPLC指纹图谱的研究，通过对照品指认出野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A，并测定了黄芩苷和汉黄芩苷的含量；苏建春等建立了黄芩UPLC指纹图谱，通过对照品指认出黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A；王丹等建立了黄芩UPLC指纹图谱，共检出29个共有峰，利用对照品和LC-MS技术对其中的27个化合物进行了指认和鉴定；张雪梅等基于HPLC指纹图谱和多指标定量研究了黄芩趁鲜加工的质量变化规律，共检出22个共有峰，通过对照品指认并测定了黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等四种成分的含量。通过上述研究报道可知，黄芩高效液相指纹图谱测定方法较成熟，色谱峰以黄酮类成分为主。指纹图谱为黄芩整体质量控制的常用方法，研究较多，技术成熟，其主要优点在于能呈现出较多的成分(特别是黄酮类成分)信息，质量概貌较全，可对样品的整体质量进行定性判别，但不能准确定量。
由上述两种测定方法可知，两种方法在整体质量控制方面各具优势，也存在各自不足，但又具有相关性与互补性，若能通过探索将两者进行适当结合，建立一种基于黄芩指纹图谱的总黄酮含量的测定方法，将可实现“通过一张指纹图谱既可整体定性又可整体定量”的双重质量控制效果。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，该方法基于黄芩指纹图谱及建立的峰面积-总黄酮含量数学模型，即可定性又可定量分析黄芩中的黄芩总黄酮含量。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)、采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法测定待测黄芩样品溶液，得到黄芩样品指纹图谱，收集所述指纹图谱的2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号和10号色谱峰的峰面积数据；
(2)、将步骤(1)中所述8个色谱峰的峰面积求和，根据峰面积-总黄酮含量的数学模型，即得所述待测黄芩样品的总黄酮含量；
所述峰面积-总黄酮含量的数学模型为：Y＝aX+b，其中，X为峰面积，Y为总黄酮含量，1.10*e-10≤a≤1.20*e-10，0.090≤b≤0.100。
在其中一些实施例中，所述峰面积-总黄酮含量的数学模型中，1.10*e-10≤a≤1.15*e-10，0.095≤b≤0.098。
在其中一些实施例中，所述峰面积-总黄酮含量的数学模型为Y＝0.096+1.128*e-10X。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：BEH C18；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～0.5min，15％B；0.5～2min，15％～20％B；2～6min，20％～23％B；6～10min，23％～30％B；10～12min，30％～60％B；12～14min，60％B，运行5±1min；检测波长：280±2nm；流速：0.4±0.1mL/min；柱温：40±1℃；进样量：2μL。
在其中一些实施例中，所述待测黄芩样品溶液是通过以下方法制备而得：精密移取50ml 65％～75％甲醇，加至0.25g～0.35g过60目～70目筛的待测黄芩样品粉末中，称重，超声10min～60min，冷却至室温后补足重量，摇匀过滤，取1ml滤液，加65％～75％甲醇定容至10ml，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述峰面积-总黄酮含量的数学模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)、采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法分别对黄芩样品集的黄芩样品进行测定，得到黄芩样品指纹图谱的共有峰峰面积数据集；
(2)、采用紫外分光光度法对步骤(1)所述黄芩样品集中的黄芩样品进行测定，得到总黄酮含量数据集；
(3)、对步骤(1)所述共有峰峰面积数据集的每一个色谱峰峰面积，分别和步骤(2)所述总黄酮含量数据集对应的总黄酮含量进行相关性分析，得到8个显著相关的优选峰峰面积数据集，即为2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号和10号色谱峰；
(4)、将每个黄芩样品的所述8个优选峰的峰面积求和组成峰面积数据集，再与每个黄芩样品的所述总黄酮含量数据集，组成对应的峰面积-总黄酮含量数据集；运用统计学方法对所述峰面积-总黄酮含量数据集进行分析，即得峰面积-黄芩总黄酮含量的数学模型。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述优选峰是依据相关系数大小和显著性程度筛选获得的。所述相关系数大于0.3，所述显著性检验P值小于0.05。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述统计学方法为相关性分析、变化趋势分析和回归分析。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述黄芩样品集包括15个或15个以上黄芩样品，所述26个黄芩样品为：分别于春秋两季、5个产地采挖的1年～3年生的黄芩根。
本发明还提供了上述基于指纹图谱的黄芩总黄酮的含量测定方法在黄芩药材质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
1、本发明基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，仅需要获得黄芩样品的指纹图谱，即可根据指纹图谱中优选峰的峰面积，以及构建的峰面积-总黄酮含量数学模型，测得黄芩总黄酮的含量，实现了“一张指纹图谱”既可整体定性又可整体定量(总黄酮含量)的整体质量控制效果，为黄芩整体质量控制提供了一种行之有效的新方法，该方法应用性强、质量控制效率高。
2、本发明的峰面积-黄芩总黄酮含量数学模型，其是首先通过对黄芩样品集(选用较强代表性的黄芩样品)指纹图谱各色谱峰峰面积与总黄酮含量进行相关性分析，将显著相关的色谱峰筛选为优选峰；再将优选峰的峰面积和总黄酮含量数据组成数据集，运用相关统计学方法分析该数据集，从而构建得到的，经过31组黄芩样品的验证，该数学模型可准确测定出总黄酮含量，数学模型可靠。
附图说明
图1为本发明实施例1中26批黄芩UPLC指纹图谱。
图2为本发明实施例1中黄芩相关对照品的指纹图谱；其中，A：野黄芩苷；B：黄芩苷；C：汉黄芩苷；D：黄芩素；E：汉黄芩素；F：千层纸素A。
图3为本发明实施例1中黄芩UPLC指纹图谱的共有模式图；其中，2：野黄芩苷；4：黄芩苷；10：汉黄芩苷；11：黄芩素；12：汉黄芩素；13：千层纸素A。
图4为本发明实施例1中黄芩苷的标准曲线图。
图5为本发明实施例1中26批黄芩的8个优选峰峰面积与总黄酮含量的散点图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明的一个方面，构建了峰面积-黄芩总黄酮含量的通用数学模型：Y＝aX+b，其中，X为峰面积，Y为总黄酮含量，1.10*e-10≤a≤1.20*e-10，0.090≤b≤0.100。更为优选的，1.10*e-10≤a≤1.15*e-10，0.095≤b≤0.098，最为优选的，峰面积-黄芩总黄酮含量的通用数学模型为Y＝0.096+1.128*e-10X。
该通用数学模型是通过选用较强代表性的黄芩样品，利用黄芩样品的指纹图谱和紫外光分光光度法测得的总黄酮含量，进行了优选峰峰面积和总黄酮含量之间的相关性、显著性、统计学等分析方法构建得到的。并通过26组已知总黄酮含量的黄芩样品和5组未知总黄酮含量的黄芩样品，对通用数学模型进行了验证，证明了该通用数学模型的可靠性。
在本发明的另一方面，利用黄芩样品的指纹图谱及构建得到的通用数学模型，无需再利用紫外分光度法，即可以利用一张指纹图谱准确计算出黄芩样品中的总黄酮含量。其中，指纹图谱是使用高效液相色谱或超高效液相色谱测定得到的，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：BEH C18；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～0.5min，15％B；0.5～2min，15％～20％B；2～6min，20％～23％B；6～10min，23％～30％B；10～12min，30％～60％B；12～14min，60％B，运行5±1min；检测波长：280±2nm；流速：0.4±0.1mL/min；柱温：40±1℃。待测黄芩样品溶液是通过以下方法制备而得：精密移取50ml65％～75％甲醇，加至0.25g～0.35g过60目～70目筛的待测黄芩样品粉末中，称重，超声10min～60min，冷却至室温后补足重量，摇匀过滤，取1ml滤液，加65％～75％甲醇定容至10ml，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
采用本发明所述的方法制备待测黄芩样品溶液，并使用本发明所述的超高效液相色谱法的色谱条件测定待测黄芩样品溶液，得到的指纹图谱，均具有15个共有峰，其中第2、3、4、5、6、7、8、10号色谱峰为优选峰。将8个优选峰的峰面积求和，再根据峰面积-总黄酮含量的数学模型，即可计算出待测黄芩样品中的总黄酮含量。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1峰面积-黄芩总黄酮含量的数学模型的构建
本实施例基于黄芩样品的指纹图谱，构建了峰面积-黄芩总黄酮含量的数学模型，包括以下步骤：
1、黄芩代表性样品的收集
本实施例建立黄芩指纹图谱与黄芩总黄酮含量之间的数学关系，而样品具有较强代表性最为关键，其直接决定了所建立数学模型的可靠性，因此基于黄芩质量的关键影响因素如产地、采收季节、生长年限等，分别从5个产地(山东、山西、陕西、甘肃、河北)收集了春、秋两个季节、1-3年生的黄芩样品，共26份，经暨南大学药学院中药教研室张英副教授鉴定，均为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，如表1。
黄芩春、秋二季采挖后，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。
表1黄芩样品表(n＝26)
2、指纹图谱测定方法的建立与测定
(1)、对照品溶液的制备
分别精密称取野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A，加甲醇分别配成质量体积浓度0.048mg/ml的野黄芩苷对照品溶液、0.34mg/ml的黄芩苷对照品溶液、0.075mg/ml的汉黄芩苷对照品溶液、0.024mg/ml的黄芩素对照品溶液、0.01mg/ml的汉黄芩素对照品溶液、0.005mg/ml的千层纸素A对照品溶液，备用。
(2)、供试品溶液的制备
分别称取26份黄芩样品粉末(过65目筛)约0.3g，置于100ml具塞锥形瓶中，精密移取50ml 70％甲醇于锥形瓶中，称重，超声50min，冷却至室温后补足重量，摇匀过滤，取1ml续滤液，置于10ml容量瓶中，加70％甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液2μL，作为供试品溶液，待测。
(3)、指纹图谱测定，记录色谱图
取各供试品溶液与各对照品溶液，按以下色谱条件进行测定。
色谱柱：BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～0.5min，15％B；0.5～2min，15％～20％B；2～6min，20％～23％B；6～10min，23％～30％B；10～12min，30％～60％B；12～14min,60％B)后，运行5min；检测波长：280nm；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。
记录26个供试品溶液、相关对照品溶液的色谱图(图1～2)，比对26个供试品溶液的主要共有峰，共有峰有15个(图3)，其中6个峰已通过对照品进行确认，分别为野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A，均属于黄酮类化合物。15个共有峰的峰面积统计如表2。
表2 26批黄芩共有峰峰面积
3、紫外分光光度法测定黄芩总黄酮的含量
(1)、对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的黄芩苷约10.0mg，置500mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，备用。
(2)、供试品溶液的制备
分别精密称取26份黄芩样品粉末(过40目筛)约0.1g，置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液50ml，精密称定，超声(60℃、40Hz)30min，放至室温，用50％乙醇溶液补重，取溶液适量，离心(3700r/s)20分钟，取上清液0.5mL，置于50mL容量瓶中，加50％乙醇溶液定容，摇匀，即得供试品溶液。每个样品平行制备两份供试品溶液。
(3)、线性关系考察
精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置于10mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，以乙醇为空白溶液，在278nm处测吸收度。以吸收度为纵坐标(Y)，黄芩苷浓度(mg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线(如图4)，得回归方程为Y＝67.293X-0.0178，r2＝0.999。结果表明黄芩苷浓度在0.002mg/mL～0.012mg/mL范围内线性关系良好。
(4)、样品测定
以乙醇为空白溶液，分别在278nm处测定各供试品溶液的吸光度，代入步骤(3)的回归方程计算黄芩样品中的黄芩总黄酮浓度，并进一步计算出百分含量，结果如表3。
表3 26批黄芩中总黄酮含量表
| 样品编号 | 百分含量(％) | 样品编号 | 百分含量(％) | 样品编号 | 百分含量(％) |
| S1 | 25.37 | S10 | 26.67 | S19 | 27.69 |
| S2 | 26.77 | S11 | 24.58 | S20 | 23.19 |
| S3 | 25.67 | S12 | 23.85 | S21 | 26.31 |
| S4 | 24.94 | S13 | 24.27 | S22 | 23.65 |
| S5 | 23.5 | S14 | 30.21 | S23 | 23.07 |
| S6 | 25.57 | S15 | 23.48 | S24 | 18.48 |
| S7 | 28.03 | S16 | 27.52 | S25 | 14.9 |
| S8 | 26.47 | S17 | 24.45 | S26 | 21.24 |
| S9 | 25.97 | S18 | 23.25 |
4、黄芩指纹图谱共有峰中与总黄酮含量显著相关的优选色谱峰的确定
(1)、数据处理
依据黄芩指纹图谱测定时供试液制备的数量关系，将26批样品的15个共有峰分别折算成每克黄芩对应的峰面积，计为X1-X15；将26批样品的总黄酮含量折算成每克黄芩对应的总黄酮含量，计为Y；如表4。
表4 26批黄芩共有峰峰面积与总黄酮含量转换后数据表
(2)、优选峰的确定
运用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件，分别对表4的峰面积与总黄酮含量进行Pearson相关性分析，结果如表5。由结果可知，15个共有峰与总黄酮含量的相关性大小依次为：X4＞X10＞X3＞X7＞X6＞X8＞X5＞X2＞X11＞X13＞X12＞X1＞X15＞X9＞X14，其中排名前7的共有峰在0.01水平(双侧)上均显著相关，排名第8的共有峰(X2)在0.05水平(双侧)上显著相关，其他共有峰相关性较弱。依据相关系数大小及显著性程度得到优选共有峰共8个，分别为X4、X10、X3、X7、X6、X8、X5、X2。
表5共有峰峰面积与总黄酮含量的相关系数表
| 相关性 | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 | X7 | X8 |
| Y | 0.061 | 0.481* | 0.749** | 0.967** | 0.519** | 0.705** | 0.742** | 0.623** |
| 相关性 | X9 | X10 | X11 | X12 | X13 | X14 | X15 | |
| Y | -0.043 | 0.877** | 0.262 | 0.170 | 0.237 | -0.333 | -0.003 |
注：*在0.05水平(双侧)上显著相关；**在0.01水平(双侧)上显著相关。
(3)、建立优选共有色谱峰与总黄酮含量数据集之间的数学关系
运用相关统计学方法(相关性分析、变化趋势分析与线性回归分析)对跟总黄酮含量显著相关的8个优选共有峰(X4、X10、X3、X7、X6、X8、X5、X2)的峰面积总和与总黄酮含量进行分析，建立了优选共有色谱峰的峰面积与总黄酮含量之间的通用数学模型，即Y＝aX+b，其中，X为峰面积，Y为总黄酮含量，1.10*e-10≤a≤1.20*e-10，0.090≤b≤0.100，从而实现通过该数学模型与峰面积而准确地计算出总黄酮含量。
通用数学模型的构建方法，具体包括以下步骤：
(a)、运用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件对8个优选共有峰峰面积总和与总黄酮含量数据集(表6)进行相关性分析、变化趋势分析与线性回归分析，分析结果如表7～9和图5。
表6 26批黄芩8个优选共有峰峰面积和与总黄酮含量数据表
| 样号 | 8个峰峰面积和(X) | 总黄酮含量(Y) | 样号 | 8个峰峰面积和(X) | 总黄酮含量(Y) |
| S1 | 1258188917 | 0.2537 | S14 | 1707069666 | 0.3021 |
| S2 | 1522755417 | 0.2677 | S15 | 1294151583 | 0.2348 |
| S3 | 1420522500 | 0.2567 | S16 | 1522353667 | 0.2752 |
| S4 | 1279029667 | 0.2494 | S17 | 1295583667 | 0.2445 |
| S5 | 1218886833 | 0.235 | S18 | 1307471667 | 0.2325 |
| S6 | 1394430833 | 0.2557 | S19 | 1682995083 | 0.2769 |
| S7 | 1656456417 | 0.2803 | S20 | 1245378167 | 0.2319 |
| S8 | 1595050834 | 0.2647 | S21 | 1401932750 | 0.2631 |
| S9 | 1494370333 | 0.2597 | S22 | 1240457667 | 0.2365 |
| S10 | 1470867583 | 0.2667 | S23 | 1227487667 | 0.2307 |
| S11 | 1403935167 | 0.2458 | S24 | 768068000 | 0.1848 |
| S12 | 1278700083 | 0.2385 | S25 | 527329750 | 0.149 |
| S13 | 1272949583 | 0.2427 | S26 | 959412916.6 | 0.2124 |
表7模型汇总表
| 模型 | R | R方 | 调整R方 | 标准估计的误差 |
| 1 | .971a | .943 | .941 | .0074397 |
表8方差分析表
表9系数表
由相关性结果可知，显著性值为0.000＜0.01，相关系数为0.971，说明该8个优选共有峰峰面积总和与总黄酮含量在0.01水平上具有显著相关性。由散点图(如图5)可知，该8个优选共有峰峰面积总和(x轴)与总黄酮含量(y轴)呈明显线性关系。由线性回归分析结果可知，模型汇总表(如表7)中R＝0.971，说明该8个优选共有峰峰面积总和与总黄酮含量的相关性很强；方差分析表(如表8)中显著性概率为0.000，说明该8个优选共有峰峰面积总和与总黄酮含量的线性关系非常显著，可建立线性模型；由系数表(如表9)可知，回归方程为：Y＝0.096+1.128*e-10X(r＝0.97)(a＝1.128*e-10，b＝0.096)，回归系数的显著性水平为0.000，明显小于0.01，说明该线性模型是恰当的。
实施例2实施例1中指纹图谱测定方法的方法学验证
1、重复性试验
取同一批黄芩粉末(S4)共6份，分别按实施例1步骤2的方法制备供试品溶液，按实施例1步骤2中的色谱条件进行测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行评价，以黄芩苷为参照峰(S)计算其余5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积及其对应RSD，结果显示，6份样品对应指纹图谱的相似度均大于0.99，5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为0.10％～0.15％与0.26％～3.8％，表明方法重复性良好。
2、精密性试验
取同一份黄芩供试品溶液(S4)，按实施例1步骤2的色谱条件连续进样6次，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行评价，以黄芩苷为参照峰(S)计算其余5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积及其对应RSD，结果显示，6次进样对应指纹图谱的相似度均为1，5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为0.12％～0.19％与0.11％～0.54％，表明方法精密度良好。
3、稳定性试验
取同一份黄芩供试品溶液(S4)，按实施例1步骤2的色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24h进样分析，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行评价，以黄芩苷为参照峰(S)计算其余5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积及其对应RSD，结果显示，各时间点对应指纹图谱的相似度均大于0.99，5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为0.10％～0.23％与0.38％～1.30％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。实施例3实施例1中紫外分光光度法测定黄芩总黄酮含量方法的方法学验证
1、精密度试验
取供试品溶液(S4)1份，以乙醇为空白溶液，在278nm处测定吸收度，重复测定6次，6次吸收度值的RSD为0.20％，证明仪器精密度良好。
2、稳定性试验
取供试品溶液(S4)1份，以乙醇为空白溶液，分别在0、2、4、6、8h等5个时间点测定278nm处的吸光度，6个吸收度值RSD为1.32％，证明供试品溶液在8h内稳定性良好。
3、重复性试验
取供试品溶液(S4)6份，以乙醇为空白溶液，在278nm处测定吸收度，6份供试品溶液吸收度值的RSD值为1.32％，证明方法重复性良好。
4、加样回收试验
精密称定已知含量的样品(S4，约含总黄酮25mg)6份，加入黄芩苷标准品25mg，制成供试品溶液。在278nm处测吸收度。计算回收率为100.17％，RSD值为1.4％，证明试验回收率良好。
实施例4实施例1建立的数学模型的验证，以及利用实施例1建立的数学模型测定黄芩样品的黄芩总黄酮含量
1、实施例1建立的数学模型的验证
以表1的26批黄芩样品作为验证样品。基于实施例1中的8个优选共有峰峰面积总和，代入实施例1构建的通用数学模型：Y＝0.096+1.128*e-10X(r＝0.971)，得到各批样品总黄酮含量的计算值；对各批样品总黄酮含量测定值与计算值作对比分析，通过两者差值及误差来验证所得数学模型的准确度，结果如表10。
表10 26批黄芩总黄酮含量计算值与测定值对比表
由结果可知，26批黄芩总黄酮含量的计算值与测定值偏差在±6.07％以内，相差较小。说明实施例1构建的数学模型可靠。
2、根据实施例1的数学模型测定待测黄芩样品的黄芩总黄酮含量，并以待测黄芩
样品为验证样品进一步验证实施例1的数学模型
另外选取5批黄芩样品(药店购买)作为待测样品，按照实施例1中步骤2的指纹图谱的建立方法，得到5批样品的指纹图谱，收集指纹图谱的峰面积数据。计算出各批样品8个优选共有峰(即2～8号及10号)的峰面积总和；将各批样品峰面积代入实施例1构建的通用数学模型：Y＝0.096+1.128*e-10X(r＝0.971)，得到各批样品的总黄酮含量计算值。结果如表11所示。
同时，按照实施例1的紫外分光光度法测定这5批黄芩样品的黄芩总黄酮的含量。
对比分析各批样品总黄酮含量测定值与计算值，通过两者差值及误差来验证所得数学模型的准确度，结果如表11。
表11 5批黄芩总黄酮含量计算值与测定值对比表
| 样品号 | 总黄酮含量测定值 | 总黄酮含量计算值 | 差值 | 误差/％ |
| 验证1批 | 0.2149 | 0.2125 | -0.0024 | -1.12 |
| 验证2批 | 0.236 | 0.2295 | -0.0065 | -2.75 |
| 验证3批 | 0.2203 | 0.2255 | 0.0052 | 2.36 |
| 验证4批 | 0.216 | 0.2199 | 0.0039 | 1.81 |
| 验证5批 | 0.1845 | 0.1826 | -0.0019 | -1.03 |
由表11结果可知，该5批黄芩总黄酮含量的计算值与测定值偏差在±2.75％以内，相差较小。
通过以上2项验证试验共计31批样品的结果可知，通过8个优选共有峰的峰面积总和及实施例1中得到的数学模型可准确计算出黄芩中的总黄酮含量，实施例1建立的数学模型可行。
综上所述，本发明的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，根据黄芩指纹图谱中与总黄酮含量显著相关的8个优选共有色谱峰的峰面积来计算总黄酮含量，从而实现“一张指纹图谱既可整体定性又可整体定量”的双重质量控制效果，为黄芩整体质量控制提供了一种新方法。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法测定待测黄芩样品溶液，得到黄芩样品指纹图谱，收集所述指纹图谱的8个优选色谱峰，所述优选色谱峰为2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号和10号；
其中，所述优选色谱峰是通过以下步骤确定的：
a、采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法分别对黄芩样品集的黄芩样品进行测定，得到黄芩样品指纹图谱的15个共有峰峰面积数据集；
b、采用紫外分光光度法分别对步骤a所述黄芩样品集中的黄芩样品溶液进行测定，得到总黄酮含量数据集；
c、对步骤a所述15个共有峰峰面积数据集的每一个色谱峰峰面积，分别和步骤b所述总黄酮含量数据集对应的总黄酮含量进行相关性分析，依据相关系数大小及显著性程度得到8个优选色谱峰，分别为4号、10号、3号、7号、6号、8号、5号、2号；
(2)、将步骤(1)中所述8个优选色谱峰的峰面积求和，根据峰面积-总黄酮含量的数学模型，即得所述待测黄芩样品的总黄酮含量；
所述峰面积-总黄酮含量的数学模型为：Y＝aX+b，其中，X为峰面积，Y为总黄酮含量，1.10*e-10≤a≤1.20*e-10，0.090≤b≤0.100。
2.根据权利要求1所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述峰面积-总黄酮含量的数学模型中，1.10*e-10≤a≤1.15*e-10，0.095≤b≤0.098。
3.根据权利要求2所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，所述峰面积-总黄酮含量的数学模型为Y＝0.096+1.128*e-10X。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述超高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：BEH C18；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～0.5min，15％B；0.5～2min，15％～20％B；2～6min，20％～23％B；6～10min，23％～30％B；10～12min，30％～60％B；12～14min，60％B，运行5±1min；检测波长：280±2nm；流速：0.4±0.1mL/min；柱温：40±1℃。
5.根据权利要求1～3任一项所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述待测黄芩样品溶液是通过以下方法制备而得：精密移取50ml 65％～75％甲醇，加至0.25g～0.35g过60目～70目筛的待测黄芩样品粉末中，称重，超声10min～60min，冷却至室温后补足重量，摇匀过滤，取1ml滤液，加65％～75％甲醇定容至10ml，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
6.根据权利要求1～3任一项所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(2)中所述峰面积-总黄酮含量的数学模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)、采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法分别对黄芩样品集的黄芩样品进行测定，得到黄芩样品指纹图谱的共有峰峰面积数据集；
(2)、采用紫外分光光度法分别对步骤(1)所述黄芩样品集中的黄芩样品溶液进行测定，得到总黄酮含量数据集；
(3)、对步骤(1)所述共有峰峰面积数据集的每一个色谱峰峰面积，分别和步骤(2)所述总黄酮含量数据集对应的总黄酮含量进行相关性分析，得到8个显著相关的优选峰峰面积数据集，即为2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号和10号色谱峰；
(4)、将每个黄芩样品的所述8个优选峰的峰面积求和组成峰面积数据集，再与每个黄芩样品的所述总黄酮含量数据集，组成对应的峰面积-总黄酮含量数据集；运用统计学方法对所述峰面积-总黄酮含量数据集进行分析，即得峰面积-总黄酮含量的数学模型。
7.根据权利要求6所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)中所述优选峰是依据相关系数大小和显著性程度筛选获得的。
8.根据权利要求6所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(4)中，所述统计学方法为相关性分析、变化趋势分析和/或回归分析。
9.根据权利要求6所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述黄芩样品集包括15个或15个以上黄芩样品，所述黄芩样品为：分别于春秋两季、不同产地采挖的1年～3年生的黄芩根。
10.权利要求1～9任一项所述的基于指纹图谱的黄芩总黄酮含量的测定方法在黄芩药材质量控制中的应用。
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