CN110836944A - 一种小儿解表颗粒hplc指纹图谱建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于指纹图谱建立方法技术领域，具体涉及一种小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法。本发明提供了一种小儿解表颗粒特征图谱的构建方法，包括配制黄芩苷对照品溶液及小儿解表颗粒供试品溶液，进一步的，通过高效液相色谱测定小儿解表颗粒及对照品液相色谱，色谱条件：采用C18柱、DAD检测器，流动相为以乙睛‑0.1％磷酸溶液，波长为220‑350nm，柱温25‑45℃，通过高效液相色谱法测定，得到小儿解表颗粒的特征图谱，本发明的优点是能有效的监控不同批次间小儿解表颗粒的质量，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。

Description

一种小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法

技术领域

本发明属于指纹图谱建立方法技术领域，具体涉及一种中成药小儿解表颗粒HPLC指纹图谱的构建方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

小儿解表颗粒是纯中药制剂，由金银花、连翘、牛蒡子(炒)、蒲公英、黄芩、防风、紫苏叶、荆芥穗、葛根、人工牛黄十种药材构成。具有宣肺解表，清热解毒的功效。主要用于小儿外感风热所致的感冒，症见发热恶风、头痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛痒。现行标准收载于《中国药典》2015年版一部。标准只有黄芩苷一种成分的含量测定，测量成分单一，难以全面有效的控制小儿解表颗粒的质量。

发明内容

本发明对小儿解表颗粒进行了指纹图谱试验研究，建立了指纹图谱的质量检测方法，并对所建立方法进行了精密度、重复性等方法学验证试验，结果表明本发明中检测方法稳定可行。本发明克服了小儿解表颗粒现在执行标准中缺少质量检测方法的不足，以及现有技术中检测方法只能反映极少药物成分质量情况的片面性，建立的指纹图谱测定方法是小儿解表颗粒质量控制方法的有效补充，能反映出所含化学成分的种类和数量，能有效表征其质量，有利于全面控制产品的质量

基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，所述指纹图谱建立方法包括以下步骤：

(1)对照品溶液及供试品溶液的配制

对照品溶液的配制：称定绿原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷、升麻苷、野黄芩苷、大豆苷元、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、黄芩素、芒柄花素、汉黄芩素对照品，加入甲醇溶液进行配制；

供试品溶液的配制：称定小儿解表颗粒加入甲醇进行超声提取，之后取续滤液作为供试品溶液；

(2)分别通过高效液相色谱进行对供试品及对照品进行测定。

优选的，所述供试品溶液的制备，具体步骤如下：取小儿解表颗粒研细，取1～4g小儿解表颗粒加入20～50mL甲醇，超声处理30-60分钟后放冷，再次称重加入甲醇补齐失重的部分，用0.22-0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述供试品溶液。

优选的，所述高效液相采用C18色谱柱、DAD检测器。

进一步优选的，所述色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18柱。

优选的，所述高效液相检测波长为220-350nm，柱温25-45℃，理论板数均不低于10000。

进一步优选的，所述检测波长为250nm。

本发明的最佳紫外吸收波长为250nm。采用本发明中方法用检测器对小儿解表颗粒进行测定，根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图，当检测波长250nm为时，特征峰数目较多，各峰面积较高且各特征峰之间分离效果也最好。

优选的，所述高效液相流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)。

优选的，所述高效液相采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0～5min，7％A；5～20min，7％A～10％A；20～23min，10％A～14％A；23～45min，14％A～15％A；45～58min，15％A～19％A；58～65min，19％A～22％A；65～75min，22％A～28％A；75～90min，28％A～37％A；90～100min，37％A～80％A；100～110min，80％A～7％A。

本发明目的在于提供一种小儿解表颗粒的指纹图谱建立方法，为了获得对药品具有质量评价意义的分析条件，本发明中针对小儿解表颗粒的液相色谱分析条件进行了深入了研究，通过进一步优化流动相及洗脱条件，能够分析得到36个共有峰，这在指纹图谱构建领域也属于非常良好的技术效果。目前现行的小儿解表质量评价方法中，仅采用黄芩苷一种成分作为指标性成分含量测定的控制，难以全面表现药物制剂的质量状况。本发明在获得36个共有峰的基础上，进一步筛选了绿原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷、升麻苷、野黄芩苷、大豆苷元、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、黄芩素、芒柄花素、汉黄芩素等13种成分作为参照对象，并且上述成分在该检测条件下具有良好检测精确度，对于全面评价小儿解表颗粒的质量具有重要的意义。

本发明第二方面，提供第一方面所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法得到的小儿解表颗粒的指纹图谱在质量控制方面的应用。

本发明第三方面，提供一种小儿解表颗粒的质量控制方法，所述质量控制方法包括以下步骤：

(1)按照第一方面所述指纹图谱建立方法获取小儿解表颗粒的指纹图谱及待测样品图谱；

(2)将待测样品图谱与小儿解表颗粒指纹图谱进行相似度比较，相似度不低于0.90为质量合格产品。

优选的，所述指纹图谱建立需要采集至少10批次的样品进行建立。

优选的，所述相似度比较采用国家药典委员会相似度评价系统(2012版)。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

(1)用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次间小儿解表颗粒的质量，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。

(2)本发明的质量检测方法以绿原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷、升麻苷、野黄芩苷、大豆苷元、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、芒柄花素、黄芩素和汉黄芩素为对照，建立的小儿解表颗粒特征图谱注重各个特征峰的顺序和关系，能全面监控产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中13种对照的HPLC图谱。

图2为实施例1中小儿解表颗粒15批次HPLC特征图谱匹配叠加图。

图3为实施例1中小儿解表颗粒HPLC对照特征图谱；

其中，图中峰4为绿原酸，峰6为咖啡酸，峰7为葛根素峰，峰11为大豆苷峰，峰12为升麻苷峰，峰17为野黄芩苷峰，峰24为大豆苷元峰，峰26为黄芩苷峰，峰27为连翘苷峰，峰28为牛蒡苷峰，峰33为黄芩素峰，峰34为芒柄花素峰，峰36为汉黄芩素峰。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1小儿解表颗粒HPLC特征图谱测定方法

1.仪器与试剂

1.1仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1260型)，包括DAD检测器(美国Agilent公司)；分析天平(METTLER AE 240)；超声波清洗器(KS-300E)等。

1.2试剂与试药

试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙睛为色谱纯，水为超纯水。

试药：绿原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷、升麻苷、野黄芩苷、大豆苷元、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、芒柄花素、黄芩素和汉黄芩素(均来自中国食品药品鉴定研究院)。

2.方法与结果

2.1对照品溶液的制备

对照品贮备液配制：精密称取各对照品适量，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

取小儿解表颗粒研细，取约2g，精密称定精密加入25mL甲醇，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为以乙睛-0.1％磷酸溶液为7％-80％，93％-20％的混合溶液；体积流量为1.0mL，DAD检测器，波长为250nm，柱温40℃，理论板数均不低于10000。

流动相以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱0～5min，7％A；5～20min，7％A～10％A；20～23min，10％A～14％A；23～45min，14％A～15％A；45～58min，15％A～19％A；58～65min，19％A～22％A；65～75min，22％A～28％A；75～90min，28％A～37％A；90～100min，37％A～80％A；100～110min，80％A～7％A。

2.4测定

分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液各5μL，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到特征图谱，如图1所示。

3.小儿解表颗粒HPLC特征图谱特征峰指认

精密称取各对照品适量，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成混合对照品溶液。含绿原酸0.04613mg·mL-1，咖啡酸0.02707mg·mL-1，葛根素0.05024mg·mL-1，大豆苷0.008401mg·mL-1，升麻苷0.006017mg·mL-1，野黄芩苷0.01609mg·mL-1，大豆苷元0.01160mg·mL-1，黄芩苷0.3108mg·mL-1，连翘苷0.01797mg·mL-1，牛蒡苷0.2604mg·mL-1，黄芩素0.008512mg·mL-1，芒柄花素0.00656mg·mL-1，汉黄芩素0.008304mg·mL-1。依法测定，。通过上述对照品对色谱峰进行指认，图中峰4为绿原酸，峰6为咖啡酸，峰7为葛根素峰，峰11为大豆苷峰，峰12为升麻苷峰，峰17为野黄芩苷峰，峰24为大豆苷元峰，峰26为黄芩苷峰，峰27为连翘苷峰，峰28为牛蒡苷峰，峰33为黄芩素峰，峰34为芒柄花素峰，峰36为汉黄芩素峰。

4.小儿解表颗粒特征图谱测定方法学考察

4.1精密度实验

取小儿解表颗粒，按“2.2供试品溶液的配制”方法制成供试品溶液，连续进样5次。结果5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间值均<2.0％，表明仪器精密度良好。

4.2稳定性实验

取小儿解表颗粒，按“2.2供试品溶液的配制”方法制成供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48小时依法进行检测。结果次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间值均<2.0％，表明供试品溶液在48小时之间稳定。

4.3重复性实验

取同一批小儿解表颗粒，按“2.2供试品溶液的配制”方法制备6份供试品溶液，依法测定。结果次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间值均<2.0％，表明方法的重复性较好。

5.构建小儿解表颗粒的对照特征图谱

取小儿解表颗粒15批，按实施例1的条件进行测定，得到15批次样品HPLC特征图谱，如图2所示。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对15批特征图谱进行比较，确定36个共有特征峰，生成的对照特征图谱，如图3所示。其中参照峰为黄芩苷峰26号峰。

相似度分析以中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，计算批供试品特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度，结果均大于0.90。

相似度结果分别为：0.945，0.957，0.952，0.967，0.973，0.991，0.995，0.995，0.992，0.978，0.998，0.992，0.968，0.980，0.991。平均相似度为：0.978，RSD为1.9％。

综上所述，本发明所构建质量检测方法的稳定性好，精密度高，重复性好，因此本发明发案具有可行性。利用本发明质量检测方法监控所获得的中成药小儿解表颗粒，质量一致，疗效稳定。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱建立方法包括以下步骤：

(1)对照品溶液及供试品溶液的配制

对照品溶液的配制：称定绿原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷、升麻苷、野黄芩苷、大豆苷元、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、黄芩素、芒柄花素、汉黄芩素对照品，加入甲醇溶液进行配制；

供试品溶液的配制：称定小儿解表颗粒加入甲醇进行超声提取，之后取续滤液作为供试品溶液；

(2)分别通过高效液相色谱进行对供试品及对照品进行测定。

2.如权利要求1所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备，具体步骤如下：取小儿解表颗粒研细，取1～4g小儿解表颗粒加入20～50mL甲醇，超声处理30-60分钟后放冷，再次称重加入甲醇补齐失重的部分，用0.22-0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述供试品溶液。

3.如权利要求1所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相采用C18色谱柱、DAD检测器。

4.如权利要求3所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18柱。

5.如权利要求1所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相检测波长为220-350nm，柱温25-45℃，理论板数均不低于10000；优选的，所述检测波长为250nm。

6.如权利要求1所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)。

7.如权利要求1所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0～5min，7％A；5～20min，7％A～10％A；20～23min，10％A～14％A；23～45min，14％A～15％A；45～58min，15％A～19％A；58～65min，19％A～22％A；65～75min，22％A～28％A；75～90min，28％A～37％A；90～100min，37％A～80％A；100～110min，80％A～7％A。

8.权利要求1-7任一项所述小儿解表颗粒HPLC指纹图谱建立方法得到的小儿解表颗粒的指纹图谱在质量控制方面的应用。

9.一种小儿解表颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括以下步骤：

(1)按照权利要求1-7任一项所述指纹图谱建立方法获取小儿解表颗粒的指纹图谱及待测样品图谱；

(2)将待测样品图谱与小儿解表颗粒指纹图谱进行相似度比较，相似度不低于0.90为质量合格产品。

10.如权利要求9所述小儿解表颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述指纹图谱建立需要采集至少10批次的样品进行建立；或所述相似度比较采用国家药典委员会相似度评价系统(2012版)。

Images