CN113655163A - 速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法 - Google Patents

速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，它包括步骤1、供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将供试品溶液指纹图谱从仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；并与混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明指纹图谱，能全面，客观地表征速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量。检测方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药速溶固体饮料的检测方法，具体涉及速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法。
背景技术
失眠是临床最常见的睡眠障碍。长期严重失眠不仅会给患者的身体、生活、人际关系和工作带来负面影响，甚至可导致恶性事故的发生。长期睡眠不足、睡眠品质不佳的状态下，不仅会造成精神不济、记忆力衰退、注意力无法集中、情绪不稳等问题，进而影响日常生活。严重甚至会使免疫力下降，容易受到传染性疾病感染，抑或是造成头痛、头晕、忧郁等症状的发生。速溶酸枣仁心宁饮固体饮料针对不同类型的失眠患者，提供有助于调理体质，改善失眠困扰。
配方中酸枣仁养心补肝，宁心安神，生津敛汗；人参甘温益气补中，增强免疫力；茯苓治脾虚失眠，利水渗湿；枸杞滋补肝肾，益精明目；肉桂补火助阳，散寒止痛，温经通脉；葛根解肌退热，通经活络；桔梗宣肺、祛痰，利咽；大枣补中益气，养血安神；莲子补脾止泻，益肾涩精，养心安神；百合润肺止咳、清心安神；决明子通便滑肠，清肝明目；栀子凉血解毒，清热利湿；甘草补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛；山楂消食健胃，行气散瘀，化浊降脂。配方中各成分各司其职，达到养心安神之功，同时增强人体抵抗力，故可用于心烦失眠的辅助食疗。
目前关于速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的指纹图谱检测方法，为速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量，对控制速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的制备：
分别精密称取不同批次的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料清膏样品，置圆底烧瓶中，超声提取，提取液离心，上清液过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定绿原酸、葛根素、芒柄花素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中8号峰为绿原酸、9号峰为葛根素、26号峰为芒柄花素。
作为优选方案，以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，步骤1速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液制备方法为：取8批次的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料清膏样品5g，置圆底烧瓶中，加入甲醇50ml，超声提取30min，提取液12000转离心5min，上清液过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、葛根素、芒柄花素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1008mg/mL葛根素、0.1022mg/ml芒柄花素组成的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：254nm，柱温30℃，流速0.9mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
Figure BDA0003190705940000021
Figure BDA0003190705940000031
作为优选方案，以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰26个。
以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的药味组成和配比为：酸枣仁15～30份、人参10～20份、茯苓12～24份、枸杞7～14份、肉桂5～10份、葛根7～14份、桔梗5～10份、大枣7～14份、莲子6～12份、百合6～12份、决明子5～10份、栀子5～10份、甘草5～10份、山楂5～10份。
作为优选方案，以上所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的药味组成和配比为：酸枣仁15份、人参10份、茯苓12份、枸杞7份、肉桂5份、葛根7份、桔梗5份、大枣7份、莲子6份、百合6份、决明子5份、栀子5份、甘草5份、山楂5份。
指纹图谱检测条件的优化：
1、在样品溶液的制备优化方面
本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、50％乙醇水溶液、70％乙醇、95％乙醇、无水乙醇)进行实验比较，结果发现超声提取所得的谱图差成分比较全面，提取效率高，分离度良好，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高，所以选用甲醇进行提取。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取205nm、225nm、254nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为254nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选254nm为检测波长；
本发明对流速(1mL/min、0.9mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min)进行筛选，因速溶酸枣仁心宁饮中的成分在0.9mL/min的流速下峰形较好且分离效果较好，最终选择在流速为0.9mL/min梯度条件。
本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈-0.1％磷酸水，乙腈-0.2％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1％磷酸水为流动相时，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.1％磷酸水为流动相。
在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0～5min乙腈体积5％；5～25min乙腈体积5％～15％；25～70min乙腈体积15％～30％；70～80min乙腈体积30％～35％；80～100min乙腈体积35％～100％；时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。
有益效果：
1、本发明根据速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明。
2、本发明提供的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量，为保证速溶酸枣仁心宁饮固体饮料疗效具有重要意义。
3、用本发明所提供的方法所建立的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱，能有效地表征速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定速溶酸枣仁心宁饮固体饮料质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
4、本发明提供的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明混合对照品的色谱图。
图2为本发明的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品的对照指纹图谱。
图3为本发明速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品的8批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例用到的仪器与试剂如下：
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。
1.2药品与试剂
速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品来自江苏海昇药业有限公司；绿原酸对照品(批号110753-201314)购自中国食品药品生物制品鉴定所；葛根素对照品((批号3681-99-0)购自中国食品药品检定研究所；芒柄花素对照品(批号111703-200602)购自中国药品生物制品检定所；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)；水(超纯水)。
实施例1一种速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的制备：
取8批次的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料清膏样品20g(酸枣仁3g、人参2g、茯苓2.4g、枸杞1.4g、肉桂1g、葛根1.4g、桔梗1g、大枣1.4g、莲子1.2g、百合1.2g、决明子1g、栀子1g、甘草1g、山楂1g)后置500mL圆底瓶中，加甲醇溶液250mL，超声提取30min，提取液12000转离心5min，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
取精密称定绿原酸、葛根素、芒柄花素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1008mg/mL葛根素、0.1022mg/ml芒柄花素组成的混合对照品溶液。
步骤3，分别精密吸取8批速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：254nm，柱温30℃，流速0.9mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
程序 时间(min) 乙腈体积(％)
1 0 5
2 5 5
3 25 15
4 70 30
5 80 35
6 100 100
步骤4，将步骤3中获得的8批速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择8批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中有27个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。绿原酸保留时间为25.235min，葛根素保留时间为28.92min，芒柄花素保留时间为87.547min。
步骤5，步骤3中获得的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱和混合标准品图谱(图1)进行比对，指认主要成分，对比出速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中8、9、26号色谱峰分别为：绿原酸(保留时间25.235min)、葛根素(保留时间28.92min)、芒柄花素(保留时间87.547min)。
同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得江苏海昇药业厂家的8批速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中药建立的指纹图谱能够很好的检测江苏海昇药业多批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量，结果如表1。
表1各批次样品与共有模式间的相似度
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 R
S1 1.000 0.958 0.991 1.000 0.995 0.991 0.987 0.958 0.994
S2 0.958 1.000 0.965 0.958 0.955 0.965 0.981 1.000 0.980
S3 0.991 0.965 1.000 0.991 0.991 1.000 0.987 0.965 0.995
S4 1.000 0.958 0.991 1.000 0.995 0.991 0.987 0.958 0.994
S5 0.995 0.955 0.991 0.995 1.000 0.991 0.983 0.955 0.993
S6 0.991 0.965 1.000 0.991 0.991 1.000 0.987 0.965 0.995
S7 0.987 0.981 0.987 0.987 0.983 0.987 1.000 0.981 0.996
S8 0.958 1.000 0.965 0.958 0.955 0.965 0.981 1.000 0.980
R 0.994 0.980 0.995 0.994 0.993 0.995 0.996 0.980 1.000
。
实施例2指纹图谱检测的方法学研究：
1、方法学考察
1.1精密度考察
取速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品20g(同实施例1)，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中27个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.5％，共有峰峰面积RSD均小于2.8％，说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品20g(同实施例1)，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中27个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.0％，共有峰峰面积RSD均小于2.7％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取6份速溶酸枣仁心宁饮固体饮料样品20g(同实施例1)，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中27个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于0.9％，共有峰峰面积RSD均小于2.4％，说明该方法重复性良好。
以上实验结果表明，本发明提供的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的制备：
分别称取不同批次的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料清膏样品，加甲醇溶液，超声提取，提取液离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定绿原酸、葛根素、芒柄花素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择不同批次速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出速溶酸枣仁心宁饮固体饮料中8号峰为绿原酸、9号峰为葛根素、26号峰为芒柄花素。
2.根据权利要求1所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1速溶酸枣仁心宁饮固体饮料供试品溶液制备方法为：取8批次的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料清膏样品5～10g，加6～20倍量的甲醇，置圆底烧瓶中，超声提取1～3次，每次0.5～1小时，提取液离心，上清液过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、葛根素、芒柄花素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1008mg/mL葛根素、0.1022mg/ml芒柄花素组成的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：254nm，柱温30℃，流速0.9mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
Figure FDA0003190705930000011
Figure FDA0003190705930000021
5.根据权利要求1所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有27个峰，其保留时间分别为1号峰10.866min、2号峰12.068min、3号峰12.971min、4号峰15.404min、5号峰16.496min、6号峰17.514min、7号峰19.578min、8号峰25.235min、9号峰28.92min、10号峰30.936min、11号峰32.156min、12号峰40.996min、13号峰41.843min、14号峰45.584min、15号峰47.114min、16号峰50.515min、17号峰52.265min、18号峰53.458min、19号峰55.378min、20号峰56.055min、21号峰57.377min、22号峰58.649min、23号峰63.453min、24号峰64.773min、25号峰73.067min、26号峰87.547min、27号峰91.909，其中8号峰为绿原酸、9号峰为葛根素、26号峰为芒柄花素。
6.根据权利要求1至5任一项所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的药味组成和配比为：酸枣仁15～30份、人参10～20份、茯苓12～24份、枸杞7～14份、肉桂5～10份、葛根7～14份、桔梗5～10份、大枣7～14份、莲子6～12份、百合6～12份、决明子5～10份、栀子5～10份、甘草5～10份、山楂5～10份。
7.根据权利要求6所述的速溶酸枣仁心宁饮固体饮料指纹图谱的检测方法，其特征在于，速溶酸枣仁心宁饮固体饮料的药味组成和配比为：酸枣仁15份、人参10份、茯苓12份、枸杞7份、肉桂5份、葛根7份、桔梗5份、大枣7份、莲子6份、百合6份、决明子5份、栀子5份、甘草5份、山楂5份。
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