CN103926351B - 生血宝制剂质量检测方法及其标准指纹图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生血宝制剂的指纹图谱检测方法：方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件：色谱柱为C18反相色谱柱；采用梯度洗脱，流动相为乙腈与0.1～0.2％磷酸溶液组成的梯度洗脱液；检测波长为200～230nm；柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；分析时间60min。(4)测定：高效液相色谱法得指纹图谱。本发明的测定方法操作简便，特征性成分保留完整，重复性、稳定性良好，精密度高，专属性强。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，特别涉及一种生血宝制剂质量检测方法及其标准指纹图谱的构建方法。
背景技术
生血宝制剂由制何首乌、女贞子、桑椹、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊七味药材组成。该方具有养肝肾，益气血之功效，用于恶性肿瘤放化疗所致白细胞减少及神疲乏力，腰膝酸软，头晕耳鸣，心悸，气短，失眠、咽干，食欲不振食少等症。
贫血属祖国医学的“血虚”、“血枯”、“血证”、“虚劳”、“虚损”等范畴。《黄帝内经》记载：“精气内夺则积虚成损，积损成劳。而恶性肿瘤病机为虚、毒、瘀、痰、湿交织，停留于机体，引起气血与脏腑功能失调，发病实际上是虚实夹杂、由虚致实、由实加重虚损的复杂病理结局。《内经》的“壮人无积，虚人则有之”以及《景岳全书》的“脾胃不足及虚弱失调之人，多有积聚之病”是对恶性肿瘤病因和发病机制的高度概括。生血宝是我国著名中医药学专家的经验方，临床应用了几十余年，以益元补气、养血生津中药经现代工艺制备而成，扶正培本适合于各种贫血及恶性肿瘤的辅助治疗，特别是恶性肿瘤中晚期，针对肿瘤患者有明显的镇静、促进食欲作用。生血宝能提高干细胞分化池中干细胞的增殖能力，从而促进血细胞生成；减少外周血细胞破坏的程度，减少细胞破坏，消耗过多；调节循环池及边缘池的比例，进而调节细胞分布紊乱；科学组方，有效升高血液中白细胞和血红蛋白的含量。生血宝为纯中药制剂，毒副作用小。
现有技术中，根据生血宝中药方，已制得多种剂型的生血宝制剂，市场上生血宝制剂主要有颗粒剂、合剂等。通常的制备工艺为：将原料药材碎断后加水提取的水提物，按现有常规方法制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、口服液或合剂。
生血宝制剂作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。但目前生血宝制剂现有的质量标准仅测定单一指标成份的含量，未对其他有效成分进行监测，存在一定局限性，不能全面反映生血宝制剂的质量水平。针对生血宝制剂的质量检测方法公开很少，如中国专利03124519.6(公开号CN1552378A)、94110841.4(公开号CN1106287A)、200410047024.9(公开号CN1785260A)、200410092412.9(公开号CN1660290A)、200910021150.X(公开号CN101804103A)与201310373355.0(公开号CN103405522A)均未涉及其质量检测方法；《临床合理用药》2012年3月第5卷第3C期《HPLC法测定生血宝合剂中齐墩果酸的含量分析》记载了一种测定生血宝合剂中齐墩果酸的含量的HPLC方法；《安徽中医学报》2013年10月第32卷第5期《生血宝颗粒中何首乌苷的含量测定》记载了一种测定生血宝颗粒剂中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量的HPLC方法。现有技术中，尚无较全面的质量控制方法反映现有中药材、中间体及成品的质量状况，也无法对生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效。因此，建立生血宝其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱具有非常重要的意义。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种生血宝制剂质量检测方法及其标准指纹图谱的构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
1、生血宝制剂质量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
第一，溶液的制备：
(1)对照品溶液的制备：用体积百分比浓度为50～100％的甲醇将芍药苷配制成每1mL含0.02～0.06mg芍药苷的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取液体剂型的生血宝制剂1.0～5.0ml或固体剂型的生血宝制剂0.6～3.0g，溶于25～125mL体积百分比浓度为0～100％的甲醇或体积百分比浓度为0～50％的乙醇中，混匀，配制成供试品溶液；
第二，测定及分析：
高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录60min的色谱图，即得生血宝制剂指纹图谱；
所述高效液相色谱分析中，色谱柱为C18反相色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为质量百分比浓度为0.1～0.2％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式：
柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；检测波长为200～230nm；
将生血宝制剂指纹图谱与生血宝制剂标准指纹图谱相比对，鉴别生血宝制剂有效成分以及是否添加了其它成分；
所述生血宝制剂标准指纹图谱按照如下步骤构建：
高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录60min的色谱图，得生血宝制剂指纹图谱；
所述高效液相色谱分析中，色谱柱为C18反相色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为质量百分比浓度为0.1～0.2％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式(见表1)：
表1
柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；检测波长为200～230nm；
对10批次生血宝制剂建立指纹图谱，通过分析比较，确定出14个共有特征峰，编号为1～14号，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以第9号峰为参照峰(第9号峰的保保留时和峰面积设为1，其它峰以9号峰为参照峰，所得出的相对保留时间和相对峰面积单位为1)，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.066～0.074、0.073～0.081、0.210～0.232、0.363～0.404、0.637～0.706、0.745～0.824、0.763～0.844、0.907～1.004、1.000、1.034～1.143、1.086～1.200、1.129～1.248、1.199～1.327、1.239～1.370；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.390～1.025、0.149～0.381、0.086～0.256、0.319～0.845、0.095～0.236、0.074～0.236、0.031～1.282、0.206～0.585、1.000、0.041～0.102、0.216～0.711、0.183～1.274、0.136～0.865、0.070～0.151；这些共有特征峰构成了生血宝制剂的指纹特征，作为生血宝制剂标准指纹图谱；
所述的生血宝制剂由下述重量份数的原药材组成：
制何首乌100，女贞子120～130，桑葚120～130，墨旱莲120～130，白芍100，黄芪100，狗脊100；该生血宝制剂为现有中药方，其包括制何首乌、女贞子、桑椹、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊七味药材；可为现有的根据生血宝中药方制备的各种剂型的生血宝制剂，例如颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、合剂等。上述生血宝制剂可由下述方法制得：将原药材碎断后加水提取的水提物，按现有常规方法制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、口服液或合剂。
优选地，所述生血宝制剂标准指纹图谱中，以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.070～0.070、0.077～0.077、0.221～0.221、0.382～0.385、0.671～0.672、0.784～0.785、0.803～0.804、0.955～0.956、1.000、1.088～1.089、1.143～1.143、1.188～1.189、1.262～1.264、1.304～1.305；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.410～0.976、0.157～0.363、0.090～0.244、0.336～0.805、0.100～0.225、0.078～0.225、0.033～1.221、0.217～0.557、1.000、0.043～0.097、0.227～0.677、0.193～1.213、0.143～0.824、0.074～0.144。
下面对本发明作进一步说明：
本发明依据所得的10批生血宝中间体及其制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个共有峰，其中9号峰为芍药苷，10号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，11号峰为2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为特女贞苷。本发明中，所述的生血宝指纹图谱与制定的标准指纹图谱进行比对，其相似度为0.798～1.000，共有峰有14个，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以9号峰芍药苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。将供试品指纹图谱与标准指纹图谱对比，即可得知供试品的质量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明生血宝中间体及其制剂的指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定性良好；
(2)该高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，且生血宝制剂指纹图谱和生血宝制剂中间体指纹图谱具有较好的相关性；
(3)本发明所建立的标准指纹图谱有14个共有峰，信息量较大，明确了5个指标成份，较完整的保留了供试液中的化学成分；
(4)本发明指认了7个特征峰(白芍、女贞子、狗脊、墨旱莲、制何首乌、黄芪、桑椹
)，经比较采用保留时间适中，分离度较好，峰面积较大的芍药苷对照品作为参照峰；
(5)生血宝中间体及其制剂指纹图谱的应用可增加生血宝制剂生产过程的可控性，生血宝制剂指纹图谱的应用能较全面的反映工艺是否稳定均一，有利于保证生血宝制剂的质量稳定和临床疗效，本发明提供的方法有利地保障了从原料到终端制剂的全程质量控制。
总之，本发明针对生血宝制剂的质量控制现状，提供了一种基于高效液相色谱法的生血宝制剂的质量检测检测方法及根据该方法建立得到的生血宝制剂标准指纹图谱，有利于对其原料药材、中间体及其终产品质量的有效控制以保证其临床疗效。
附图说明
图1检测波长3D图；
图2对照品叠加色谱图；
图3为生血宝制剂标准指纹图谱；
图4为10批生血宝制剂指纹图谱；
图5为生血宝制剂中间体标准指纹图谱；
图6为10批生血宝制剂中间体指纹图谱；
图7为生血宝胶囊标准指纹图谱；
图8为10批生血宝胶囊指纹图谱；
图9为生血宝颗粒标准指纹图谱；
图10为10批生血宝颗粒指纹图谱；
图11为生血宝口服液标准指纹图谱；
图12为10批生血宝口服液标准指纹图谱；
图13为生血宝中间体及其制剂指纹图谱各成分峰归属图谱。
具体实施方式
本发明药材、药品的来源及对照品来源如下：
制何首乌药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:JY100202)；女贞子药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1402002)；桑椹药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1401022)；墨旱莲药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1402007)；白芍药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:JY140101)；黄芪药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1401021)；狗脊药材(厂家:安徽芍花堂药业有限公司、批号:ZY1401020)；芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院、110738-201337)；生血宝颗粒(湖南康寿制药有限公司，批号为20120501、20121105、20121207、20121211、20130701、20130704、20130801、130701、130803、130805)；生血宝胶囊、片剂、口服液、丸剂(实验室自制)；生血宝中间体(实验室自制)。
实施例1生血宝制剂指纹图谱的建立。(以生血宝颗粒剂为例)
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件的选择
①流动相的选择
选择乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液、乙腈-0.1％甲酸溶液、甲醇-0.1％磷酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液、甲醇-水等为流动相进行试验，结果表明，乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相时，色谱峰的峰形好，各峰分离较完全，其中乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相时效果最好，故选用乙腈-0.1％磷酸溶液作为最佳流动相。
由于样品中成分复杂，在恒流条件下，样品中的各个成分分离度差，较难体现指纹图谱的整体特性；流动相以如下梯度运行，样品中各组分均有较好的分离，基线平稳，故选用该梯度为最佳洗脱梯度(见表2)。
表2
②检测波长的选择
应用DAD检测器对供试品进行了全波长测定比较，结果在200～230nm所测指纹图谱中主要色谱峰的响应值较大，各色谱峰特征突出，故确定检测波长为200～230nm均可。见图1。
③色谱柱的选择
通过比较Agilent ZORBAX XDB-C18(5μm，4.6×250mm)，Thermo Syncronis-C18(5μm，4.6×250mm)，依利特Hypersil ODS2-C18(5μm，4.6×250mm)，迪马Diamonsil-C18(5μm，4.6×250mm)4种不同型号规格的色谱柱，结果表明，以上4种品牌的色谱柱均可达到保留时间适中，峰数目较多，分离度好的较理想的色谱效果。
④柱温的选择
考察了不同柱温25℃、30℃、35℃、40℃时对同一样品的分离效果。结果表明，不同温度对色谱峰的分离影响较小，以25℃～40℃时分离效果都较理想。
⑤不同流速的选择
在其他色谱条件相同的情况下，分别考察流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min对同一样品色谱峰分离的影响。结果表明，当流速为1.0ml/min时，色谱峰保留时间适中，分离度最好，重复性最好。
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。见图2。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝颗粒剂粉末0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝颗粒剂供试品溶液。
(5)分析时间
在上述色谱条件下进样考察120分钟，结果表明，在60分钟内，样品中所有峰均可被完全洗脱出，故分析时间确定为60分钟。
(6)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明该方法重复性好。
(7)生血宝颗粒剂标准指纹图谱的制定
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批生血宝颗粒剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图3、4。
比较生血宝颗粒剂色谱图，确定14个峰为共有峰，其中9号峰为芍药苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定生血宝颗粒剂的标准指纹图谱。为芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间分别为：(1)0.066～0.074、(2)0.073～0.081、(3)0.210～0.232、(4)0.363～0.404、(5)0.637～0.706、(6)0.745～0.824、(7)0.763～0.844、(8)0.907～1.004、(S)1.000、(10)1.034～1.143、(11)1.086～1.200、(12)1.129～1.248、(13)1.199～1.327、(14)1.239～1.370；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.390～1.025、(2)0.149～0.381、(3)0.086～0.256、(4)0.319～0.845、(5)0.095～0.236、(6)0.074～0.236、(7)0.031～1.282、(8)0.206～0.585、(S)1.000、(10)0.041～0.102、(11)0.216～0.711、(12)0.183～1.274、(13)0.136～0.865、(14)0.070～0.151。
(9)相似度评价(见表3)。
表310批生血宝颗粒剂HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例2生血宝制剂中间体指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件
色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18(5μm，4.6×250mm)反相色谱柱；柱温为25℃；检测波长为200nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间60分钟；洗脱梯度(见表4)：
表4:
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝制剂中间体3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水125ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝制剂中间体供试品溶液。
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明该方法重复性好。
(6)生血宝制剂中间体标准指纹图谱的制定
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批生血宝制剂中间体的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图5、6。
比较生血宝制剂中间体色谱图，确定14个峰为共有峰，其中9号峰为芍药苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定生血宝制剂中间体的标准指纹图谱。以芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间分别为：(1)0.066～0.074、(2)0.073～0.081、(3)0.210～0.233、(4)0.365～0.404、(5)0.638～0.706、(6)0.745～0.823、(7)0.762～0.843、(8)0.908～1.004、(S)1.000、(10)1.034～1.142、(11)1.086～1.200、(12)1.129～1.247、(13)1.201～1.327、(14)1.239～1.369；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.179～0.917、(2)0.106～0.344、(3)0.044～0.252、(4)0.255～0.725、(5)0.092～0.186、(6)0.051～0.133、(7)0.025～1.268、(8)0.155～0.466、(S)1.000、(10)0.029～0.083、(11)0.173～0.671、(12)0.042～0.374、(13)0.175～0.864、(14)0.058～0.135；
(7)相似度评价(见表5)。
表510批生血宝制剂中间体HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例3生血宝制剂指纹图谱的建立(以生血宝胶囊剂为例)。
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件
色谱柱为Thermo Syncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为210nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为0.8ml/min；分析时间60分钟；洗脱梯度(见表6)：
表6:
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝胶囊粉末1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流10分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝胶囊供试品溶液。
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明该方法重复性好。
(6)生血宝胶囊剂标准指纹图谱的制定
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批生血宝制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图7、8。
比较生血宝胶囊剂色谱图，确定14个峰为共有峰，其中9号峰为芍药苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定生血宝胶囊剂的标准指纹图谱。为芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间分别为：(1)0.068～0.072、(2)0.075～0.080、(3)0.212～0.230、(4)0.360～0.402、(5)0.638～0.704、(6)0.746～0.822、(7)0.765～0.841、(8)0.908～1.000、(S)1.000、(10)1.032～1.140、(11)1.089～1.200、(12)1.127～1.246、(13)1.199～1.320、(14)1.239～1.360；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.390～1.020、(2)0.149～0.380、(3)0.088～0.254、(4)0.319～0.841、(5)0.099～0.233、(6)0.078～0.232、(7)0.038～1.281、(8)0.207～0.585、(S)1.000、(10)0.047～0.101、(11)0.218～0.711、(12)0.186～1.273、(13)0.135～0.861、(14)0.075～0.147。
(7)相似度评价(见表7)。
表710批生血宝胶囊剂HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例4生血宝制剂指纹图谱的建立(以生血宝片剂为例)。
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件
色谱柱为依利特Hypersil ODS2-C18(5μm，4.6×250mm)反相色谱柱；柱温为35℃；检测波长为215nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间60分钟；洗脱梯度(见表8)：
表8
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加75％甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝片剂粉末2.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用25％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝片剂供试品溶液。
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明该方法重复性好。
(6)生血宝片剂标准指纹图谱的制定
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批生血宝片剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图9、10。
比较生血宝片剂色谱图，确定14个峰为共有峰，其中9号峰为芍药苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定生血宝片剂的标准指纹图谱。为芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间分别为：(1)0.069～0.071、(2)0.076～0.080、(3)0.213～0.231、(4)0.367～0.401、(5)0.638～0.702、(6)0.747～0.827、(7)0.768～0.847、(8)0.908～1.001、(S)1.000、(10)1.035～1.140、(11)1.088～1.195、(12)1.129～1.241、(13)1.199～1.320、(14)1.239～1.364；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.394～1.021、(2)0.151～0.377、(3)0.087～0.251、(4)0.319～0.841、(5)0.097～0.238、(6)0.077～0.232、(7)0.037～1.276、(8)0.209～0.581、(S)1.000、(10)0.047～0.101、(11)0.218～0.710、(12)0.188～1.271、(13)0.137～0.861、(14)0.070～0.148。
(7)相似度评价(见表9)。
表910批生血宝片剂HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例5生血宝制剂指纹图谱的建立(以生血宝口服液为例)。
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件
色谱柱为迪马Diamonsil-C18(5μm，4.6×250mm)反相色谱柱；柱温为40℃；检测波长为230nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为1.2ml/min；分析时间60分钟；洗脱梯度(见表10)：
表10
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝口服液1ml，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，称定重量，回流处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝口服液供试品溶液。
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样5μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3％，表明该方法重复性好。
(6)生血宝口服液标准指纹图谱的制定
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批生血宝口服液的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图11、12。
比较生血宝口服液色谱图，确定14个峰为共有峰，其中9号峰为芍药苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定生血宝口服液的标准指纹图谱。为芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间分别为：(1)0.070～0.074、(2)0.075～0.079、(3)0.212～0.230、(4)0.361～0.401、(5)0.634～0.701、(6)0.742～0.821、(7)0.768～0.841、(8)0.907～1.001、(S)1.000、(10)1.038～1.140、(11)1.089～1.200、(12)1.129～1.244、(13)1.199～1.323、(14)1.239～1.365；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.395～1.020、(2)0.149～0.376、(3)0.088～0.258、(4)0.319～0.841、(5)0.098～0.231、(6)0.078～0.231、(7)0.037～1.280、(8)0.201～0.581、(S)1.000、(10)0.047～0.100、(11)0.217～0.708、(12)0.181～1.270、(13)0.139～0.861、(14)0.067～0.147。
(7)相似度评价(见表11)。
表1110批生血宝口服液HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例6成品与各原料药材的相关性及各共有峰归属。
(1)仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
(2)色谱条件
色谱柱为Thermo Syncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为230nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间60分钟；洗脱梯度(见表12)：
表12
(3)对照品溶液的制备
称取芍药苷对照品，置于容量瓶中，加75％甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取生血宝丸剂0.6g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，回流处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得生血宝丸剂供试品溶液。
药材溶液的制备方法：分别取各单味药材，按处方制备成干膏，打粉，取折算相当生血宝制剂中间体的量，按生血宝制剂中间体供试品溶液制备方法制备对应的单味药材溶液，共7味药材溶液。
阴性药材溶液的制备方法：分别取除其中某味药材的其他药材，按处方制备成干膏，打粉，取折算相当生血宝制剂中间体的量，按生血宝制剂中间体供试品溶液制备方法制备对应的阴性药材溶液，共7味阴性药材溶液。
(5)成品与各原料药材的相关性及各共有峰的归属。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的图谱，制定各共有峰的归属。见表13，见图13。
表13各共有峰图谱归属
所述生血宝制剂的HPLC在230nm的指纹图谱有14个共有峰，其中归属于白芍的共有峰为：峰2、峰4、峰7、峰8、峰9、峰13、峰14；归属于女贞子的共有峰为：峰2、峰3、峰6、峰12；归属于狗脊的共有峰为：峰1、峰2、峰5；归属于墨旱莲的共有峰为：峰1、峰3、峰5；归属于制何首乌的共有峰为：峰1、峰11；归属于黄芪的共有峰为：峰2、峰10；归属于桑椹的共有峰为：峰1、峰2、峰3、峰5。
Claims (6)
1.生血宝制剂质量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
第一，溶液的制备：
(1)对照品溶液的制备：用体积百分比浓度为50～100％的甲醇将芍药苷配制成每1mL含0.02～0.06mg芍药苷的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取液体剂型的待测生血宝制剂1.0～5.0ml或固体剂型的待测生血宝制剂0.6～3.0g，溶于25～125mL体积百分比浓度为0～100％的甲醇或体积百分比浓度为0～50％的乙醇中，混匀，配制成供试品溶液；
第二，测定及分析：
高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录60min的色谱图，即得生血宝制剂指纹图谱；
所述高效液相色谱分析中，色谱柱为C18反相色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为质量百分比浓度为0.1～0.2％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式：
柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；检测波长为200～230nm；
将生血宝制剂指纹图谱与生血宝制剂标准指纹图谱相比对，鉴别生血宝制剂有效成分以及是否添加了其它成分；
所述生血宝制剂标准指纹图谱按照如下步骤构建：
对照品溶液的制备：用体积百分比浓度为50～100％的甲醇将芍药苷配制成每1mL含0.02～0.06mg芍药苷的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取液体剂型的生血宝制剂1.0～5.0ml或固体剂型的生血宝制剂0.6～3.0g，溶于25～125mL体积百分比浓度为0～100％的甲醇或体积百分比浓度为0～50％的乙醇中，混匀，配制成供试品溶液；
高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录60min的色谱图；
所述高效液相色谱分析中，色谱柱为C18反相色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为质量百分比浓度为0.1～0.2％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式：
柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；检测波长为200～230nm；
对10批次生血宝制剂建立指纹图谱，通过分析比较，确定出14个共有特征峰，编号为1～14号，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.066～0.074、0.073～0.081、0.210～0.232、0.363～0.404、0.637～0.706、0.745～0.824、0.763～0.844、0.907～1.004、1.000、1.034～1.143、1.086～1.200、1.129～1.248、1.199～1.327、1.239～1.370；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.390～1.025、0.149～0.381、0.086～0.256、0.319～0.845、0.095～0.236、0.074～0.236、0.031～1.282、0.206～0.585、1.000、0.041～0.102、0.216～0.711、0.183～1.274、0.136～0.865、0.070～0.151；这些共有特征峰构成了生血宝制剂的指纹特征，作为生血宝制剂标准指纹图谱；
所述生血宝制剂标准指纹图谱构建中使用的生血宝制剂由下述重量份数的原药材组成：
制何首乌100，女贞子120～130，桑葚120～130，墨旱莲120～130，白芍100，黄芪100，狗脊100。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为柱长为250mm的C18反相色谱柱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生血宝制剂标准指纹图谱中，以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.070～0.070、0.077～0.077、0.221～0.221、0.382～0.385、0.671～0.672、0.784～0.785、0.803～0.804、0.955～0.956、1.000、1.088～1.089、1.143～1.143、1.188～1.189、1.262～1.264、1.304～1.305；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.410～0.976、0.157～0.363、0.090～0.244、0.336～0.805、0.100～0.225、0.078～0.225、0.033～1.221、0.217～0.557、1.000、0.043～0.097、0.227～0.677、0.193～1.213、0.143～0.824、0.074～0.144。
4.生血宝制剂标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：用体积百分比浓度为50～100％的甲醇将芍药苷配制成每1mL含0.02～0.06mg芍药苷的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取液体剂型的生血宝制剂1.0～5.0ml或固体剂型的生血宝制剂0.6～3.0g，溶于25～125mL体积百分比浓度为0～100％的甲醇或体积百分比浓度为0～50％的乙醇中，混匀，配制成供试品溶液；
(3)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录60min的色谱图，得生血宝制剂指纹图谱；
其中，步骤(3)所述的高效液相色谱分析中，色谱柱为C18反相色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为质量百分比浓度为0.1～0.2％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式：
柱温25℃～40℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；检测波长为200～230nm；
重复上述步骤(1)至(3)，对10批次生血宝制剂建立指纹图谱，通过分析比较，确定出14个共有特征峰，编号为1～14号，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.066～0.074、0.073～0.081、0.210～0.232、0.363～0.404、0.637～0.706、0.745～0.824、0.763～0.844、0.907～1.004、1.000、1.034～1.143、1.086～1.200、1.129～1.248、1.199～1.327、1.239～1.370；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.390～1.025、0.149～0.381、0.086～0.256、0.319～0.845、0.095～0.236、0.074～0.236、0.031～1.282、0.206～0.585、1.000、0.041～0.102、0.216～0.711、0.183～1.274、0.136～0.865、0.070～0.151；这些共有特征峰构成了生血宝制剂的指纹特征，作为生血宝制剂标准指纹图谱；
所述的生血宝制剂由下述重量份数的原药材组成：
制何首乌100，女贞子120～130，桑葚120～130，墨旱莲120～130，白芍100，黄芪100，狗脊100。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为柱长为250mm的C18反相色谱柱。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生血宝制剂标准指纹图谱中，以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对保留时间分别为：0.070～0.070、0.077～0.077、0.221～0.221、0.382～0.385、0.671～0.672、0.784～0.785、0.803～0.804、0.955～0.956、1.000、1.088～1.089、1.143～1.143、1.188～1.189、1.262～1.264、1.304～1.305；以第9号峰为参照峰，第1～14号各峰的相对峰面积分别为：0.410～0.976、0.157～0.363、0.090～0.244、0.336～0.805、0.100～0.225、0.078～0.225、0.033～1.221、0.217～0.557、1.000、0.043～0.097、0.227～0.677、0.193～1.213、0.143～0.824、0.074～0.144。
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