CN112213414B - 一种生发片hplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法，属于中药分析技术领域，针对以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料制成的生发片中药片剂为检测目标，采用高效液相色谱法得到生发片高效液相色谱指纹图谱。本发明所构建的指纹图谱10个共有特征峰，利用DAD检测器和UFLC‑TRIPLETOF‑DAD‑MS/MS技术手段确证和指认了10个化学成分。本发明的质量控制方法能够全面、系统的检测处方中的药材，对制剂生产工艺全过程的质量控制和最终产品的质量评价，具有实际的应用价值。

Description

一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种以中药原料制成的生发片HPLC指纹图谱的构建方法。
背景技术
本发明所用的生发片是以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料制成的中药片剂，具有滋补肝肾，益气养血，生发乌发功能。用于肝肾不足、气血亏虚所致的头发早白、脱落；斑秃，全秃，脂溢性脱发，具有广阔的临床应用前景。本发明提供一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法，通过生发片标准指纹图谱，能对其质量进行监控，确保成品的均一性。
现有技术中对中药制剂的HPLC指纹图谱的构建方法中，多采用测定某一显著成分的含量，而中药制剂的药效往往是多种活性成分共同作用的结果，因此，某一成分的含量合格不能代表整体的质量水平，具有很大的局限性。公告号为CN103926351B的中国发明专利公开了一种生血宝制剂质量检测方法及其标准指纹图谱的构建方法，对由制何首乌、女贞子、桑葚、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊组成的生血宝进行质量检测，以芍药苷为对照品，分别指认了7个特征峰，以实现检测组方中7种药物的含量的目的，其中，得到了制何首乌、女贞子、白芍、黄芪的专属特征峰，其余3种药物对应为共有峰，且构建图谱方法复杂，不适合多组方的中药制剂。
因此，现需研究以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料生发片的标准指纹图谱的构建。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法，是以生发片中药片剂为检测目标，采用高效液相色谱法得到生发片高效液相色谱指纹图谱，构建图谱方法简单，所得指纹图谱各特征峰分离效果好，检测准确度高。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取生发片除去包衣后研细，得到供试品粉末，将供试品粉末按料液比为0.5g：9-10mL加入溶剂，超声处理28-30分钟，放冷后用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷为对照品并混合，再加入溶剂制成每mL含上述各对照品50-55μg的对照品溶液；
(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，得到生发片高效液相色谱指纹图谱；再利用DAD检测器和UFLC-TRIPLE TOF-DAD-MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测；质谱工作参数：ESI电喷雾离子源，离子喷雾电压负模式-4500V；喷雾气55psi；辅助加热气55psi；离子源温度550℃；气帘气35psi；碰撞气压力10psi,扫描范围m/z100-2000，采用负离子模式进行检测；通过DAD光谱比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定。
进一步地，所述生发片是以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料制成。
进一步地，所述溶剂为70-100％的甲醇或乙醇。
进一步地，在步骤(1)中，所述超声处理是在功率250-300W、频率35-40kHz的条件下进行。
进一步地，在步骤(3)中，所述指纹图谱检测出10个共有色谱峰，1号峰为没食子酸、2号峰为原儿茶酸、3号峰为芍药苷、4号峰为大豆苷、5号峰为Suffruticoside C或异构体、6号峰为二苯乙烯苷、7号峰为染料木苷、8号峰为特女贞苷、9号峰女贞苷G13或异构体、10号峰为苯甲酰芍药苷。
进一步地，在步骤(3)中，所述指纹图谱检测出10个共有色谱峰，归属于何首乌的特征峰为1、6号峰；归属于女贞子的特征峰为2、8、9号峰；归属于黑豆的特征峰为2、4、7号峰；归属于墨旱莲的特征峰为2号峰；归属于牡丹皮的特征峰为1、3、5、10号峰。
进一步地，在步骤(3)中，所述色谱柱为规格为4.6×250mm、5μm的C18键合硅胶柱。
进一步地，在步骤(3)中，所述色谱条件为：进样量10μL；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液或0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0min→105min，5％→60％A，95％→40％B，柱温25℃，检测波长225～229nm。
进一步地，以6号峰二苯乙烯苷为参照物峰，生发片指纹图谱的共有峰的相对保留值列表如下：
Figure BDA0002662498290000021
Figure BDA0002662498290000031
本发明具有以下有益效果：
1.本发明针对以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料制成的生发片中药片剂为检测目标，采用高效液相色谱法得到生发片高效液相色谱指纹图谱。构建图谱方法简单，所得指纹图谱各特征峰分离效果好，检测准确度高，完善生发片的质量评价体系。
2.本发明通过乙醇或甲醇提取处理成分复杂的生发片，能够很好的保留生发片中各成分的性质，不影响检测结果，所得到的色谱峰峰形较好，并且总峰数及总峰面积较大，这种混合溶剂的提取效率高，稳定性较好，确保生发片成分的真实、安全且有效，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据。
3.本发明指认了10个特征峰，1号峰为没食子酸、2号峰为原儿茶酸、3号峰为芍药苷、4号峰为大豆苷、5号峰为Suffruticoside C或异构体、6号峰为二苯乙烯苷、7号峰为染料木苷、8号峰为特女贞苷、9号峰女贞苷G13或异构体、10号峰为苯甲酰芍药苷。以上色谱峰构成了生发片的指纹特征。分离度较好。
附图说明
图1是本发明的生发片对照指纹图谱。(图中从左到右分别是特征峰1至10。)
图2是生发片、何首乌药材对照色谱图。(图中S1为生发片，S2为何首乌，图中数字为生发片中归属于何首乌的色谱峰的峰号。)
图3是生发片、女贞子药材对照色谱图。(图中S1为生发片，S2为女贞子，图中数字为生发片中归属于女贞子的色谱峰的峰号。)
图4是生发片、牡丹皮药材对照色谱图。(图中S1为生发片，S2为牡丹皮，图中数字为生发片中归属于牡丹皮的色谱峰的峰号。)
图5是生发片、墨旱莲药材对照色谱图。(图中S1为生发片，S2为墨旱莲，图中数字为生发片中归属于墨旱莲的色谱峰的峰号。)
图6是生发片、黑豆药材对照色谱图。(图中S1为生发片，S2为黑豆，图中数字从左到右的数字所指为生发片中归属于黑豆的色谱峰的峰号。)
图7是生发片成品与标准指纹图谱相似度示意图。(图中从左到右分别是特征峰1至10；R为对照指纹图谱；S1～S20依次为批号1801003、1801004、1801005、1807029、1807030、1811058、1811061、1908001、1908002、1908003、20020005、20030010、20030011、20030013、20030014、20030015、20030016、20030017、20030018、20040019的指纹图谱。)
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不作为是对本发明的限制。
一、实验准备
1、仪器与试药
1.1仪器：日本SHIMADZU公司超快速高效液相质谱仪(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自动进样器，CTO-20A柱温箱，SPD-M10A-PDA检测器)；Agilent1260高效液相色谱仪(德国Agilent公司，G1311B单四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器、OPENLAB CDS ChemStation Edition数据处理软件)；Dionex Ultimate 3000DGLC高效液相色谱仪(DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器)；色谱柱：WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent ZorbaxEclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)、Hitachi High-Ted Lachrom C18(4.6×250mm，5μm)。
1.2试药：20批成品及对照药材，均由广西南宁百会药业集团有限公司提供。实验中液相色谱所用试剂均为色谱级，水为超纯水。
对照品均购自中国食品药品检定研究院，见表1：
表1所用对照品
Figure BDA0002662498290000041
实施例1
生发片HPLC指纹图谱的构建
1.供试品溶液的制备：取本品生发片，去包衣，研细，得到供试品粉末，取0.5g供试品粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂10mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
2.对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷对照品适量，置于同一容量瓶，加溶剂制成每mL含上述对照品各50μg的混合对照品溶液；
3.药材供试品溶液的制备：取20批成品及对照药材，分别按上述供试品溶液的制备的方法进行制备，得到药材供试品溶液。
上述步骤1-3中所采用的溶剂均为体积浓度为100％的甲醇。
4.高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μL，进样：色谱条件：色谱柱为WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA0002662498290000051
检测波长227nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；得到高效液相色谱标准指纹图谱，如图1所示，图1是本发明的生发片对照指纹图谱。
5.共有峰确定：将上述得到的20药材供试品溶液的高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行比较，确定10个共有特征峰并获得共有模式(参照指纹图谱)，图1是本发明的生发片对照指纹图谱，图1中从左到右分别是特征峰1至10。
所得的色谱图检出：
归属于何首乌的特征峰为1、6号峰；图2是生发片、何首乌药材对照色谱图。图2中S1为生发片，S2为何首乌，图2中数字为生发片中归属于何首乌的色谱峰的峰号。
归属于女贞子的特征峰为2、8、9号峰；图3是生发片、女贞子药材对照色谱图。图3中S1为生发片，S2为女贞子，图3中数字为生发片中归属于女贞子的色谱峰的峰号。
归属于牡丹皮的特征峰为1、3、5、10号峰。图4是生发片、牡丹皮药材对照色谱图。图4中S1为生发片，S2为牡丹皮，图4中数字为生发片中归属于牡丹皮的色谱峰的峰号。
归属于墨旱莲的特征峰为2号峰；图5是生发片、墨旱莲药材对照色谱图。图5中S1为生发片，S2为墨旱莲，图5中数字为生发片中归属于墨旱莲的色谱峰的峰号。
归属于黑豆的特征峰为2、4、7号峰；图6是生发片、黑豆药材对照色谱图。图6中S1为生发片，S2为黑豆，图6中数字从左到右的数字所指为生发片中归属于黑豆的色谱峰的峰号。
6.利用DAD检测器和UFLC-TRIPLE TOF-DAD-MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：1号峰为没食子酸、2号峰为原儿茶酸、3号峰为芍药苷、4号峰为大豆苷、5号峰为Suffruticoside C或异构体、6号峰为二苯乙烯苷、7号峰为染料木苷、8号峰为特女贞苷、9号峰女贞苷G13或异构体、10号峰为苯甲酰芍药苷。以上色谱峰构成了生发片的指纹特征。
二、方法学研究
1.精密度试验：精密称取同一批生发片，按实施例1中供试品溶液制备项下方法操作，于高效液相色谱仪上连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表2。
表2相似度结果
Figure BDA0002662498290000061
由表2可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明仪器的精密度良好。
2.稳定性试验：精密称取同一批生发片，按实施例1中供试品溶液制备项下方法操作，分别在0、2、8、24、26、48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表3。
表3相似度结果
Figure BDA0002662498290000062
Figure BDA0002662498290000071
由表3可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明供试品溶液放置48小时内稳定。
3.重复性试验：精密称取同一批生发片6份，按实施例1中供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表4。
表4相似度结果
Figure BDA0002662498290000072
由表4可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明方法的重复性良好。
4.中间精密度：精密称取同一批生发片，按实施例1中供试品溶液制备，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价：
(1)不同分析时间：取同一批号的生发片，分别于不同日期按实施例1中供试品溶液的制备方法操作，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表5。
表5相似度结果
Figure BDA0002662498290000073
(2)不同分析人员：取同一批号的生发片，不同人员分别按实施例1中供试品溶液的制备方法操作，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表6。
表6相似度结果
Figure BDA0002662498290000081
(3)不同仪器：取同一批号的生发片，按实施例1中供试品溶液的制备方法操作，分别在不同的仪器依法测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表7。
表7相似度结果
Figure BDA0002662498290000082
由上述表5-7可见，表5的供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00。表6的供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00。表7的供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99。结果表明该方法中间精密度好，生发片HPLC指纹图谱质量控制方法可行。
5.耐用性试验：精密称取同一生发片，按实施例1中供试品溶液制备，分别使用柱子1(WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm))、柱子2(Agilent Zorbax Eclipse PlusC18(4.6×250mm，5μm))、柱子3(Hitachi High-Ted Lachrom C18(4.6×250mm，5μm))三种型号的色谱柱进行检测，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，评价结果见表8。
表8相似度结果
Figure BDA0002662498290000083
由表8可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，结果表明该方法耐用性良好。
二、应用高效液相指纹图谱检测生发片
在实验过程中，检测28批次的生发片，其中20批为S1～S20的批号：1801003、1801004、1801005、1807029、1807030、1811058、1811061、1908001、1908002、1908003、20020005、20030010、20030011、20030013、20030014、20030015、20030016、20030017、20030018、20040019；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版对其中20批生发片作为研究集进行模式识别，通过平均数法获得生发片HPLC指纹图谱的共有模式(对照指纹图谱)；并将另8批生发片作为检验集与对照指纹图谱比较。相似度评价结果如下表9、表10。
表9 20批生发片相似度评价结果
序号 产品批号 相似度 序号 产品批号 相似度
S1 1801003 0.9820 S11 20020005 0.9840
S2 1801004 0.9760 S12 20030010 0.9820
S3 1801005 0.9680 S13 20030011 0.9810
S4 1807029 0.9660 S14 20030013 0.9810
S5 1807030 0.9850 S15 20030014 0.9870
S6 1811058 0.9800 S16 20030015 0.9840
S7 1811061 0.9800 S17 20030016 0.9940
S8 1908001 0.9910 S18 20030017 0.9890
S9 1908002 0.9900 S19 20030018 0.9870
S10 1908003 0.9890 S20 20040019 0.9800
表10另8批生发片与对照指纹图谱比较结果
Figure BDA0002662498290000091
由表9、表10可见，20批生发片相似度系数均大于0.90，另8批生发片与共有模式比较，超出有效期的两批生发片1501001、1605001与对照指纹图谱的相似度降低，低于0.90；有效期内6批生发片相似度良好，均大于0.90；证明生发片的生产工艺稳定，产品的均一性较好。
图7是生发片成品与标准指纹图谱相似度示意图。图7中从左到右分别是特征峰1至10；R为对照指纹图谱；S1～S20依次为批号1801003、1801004、1801005、1807029、1807030、1811058、1811061、1908001、1908002、1908003、20020005、20030010、20030011、20030013、20030014、20030015、20030016、20030017、20030018、20040019的指纹图谱。证明生发片的生产工艺稳定，产品的均一性较好。
实施例2
生发片HPLC指纹图谱的构建
1.供试品溶液的制备：取本品生发片，去包衣，研细，得到供试品粉末，取0.5g供试品粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂9mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)29分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
2.对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷对照品适量，置于同一容量瓶，加溶剂制成每mL含上述对照品各52μg的混合对照品溶液；
3.药材供试品溶液的制备：取20批成品及对照药材，分别按上述供试品溶液的制备的方法进行制备，得到药材供试品溶液。
上述步骤1-3中所采用的溶剂均为体积浓度为100％的乙醇。
4.高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μL，进样：色谱条件：色谱柱为WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)；以乙醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA0002662498290000101
检测波长225nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；得到高效液相色谱标准指纹图谱。
实施例3
生发片HPLC指纹图谱的构建
1.供试品溶液的制备：取本品生发片，去包衣，研细，得到供试品粉末，取0.5g供试品粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂9.5mL，称定重量，超声处理(功率270W，频率36kHz)28分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
2.对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷对照品适量，置于同一容量瓶，加溶剂制成每mL含上述对照品各55μg的混合对照品溶液。
3.药材供试品溶液的制备：取20批成品及对照药材，分别按上述供试品溶液的制备的方法进行制备，得到药材供试品溶液。
上述步骤1-3中所采用的溶剂均为体积浓度为70％的甲醇。
4.高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μL，进样：色谱条件：色谱柱为WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA0002662498290000111
检测波长227nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；得到高效液相色谱标准指纹图谱。
实施例4
生发片HPLC指纹图谱的构建
1.供试品溶液的制备：取本品生发片，去包衣，研细，得到供试品粉末，取0.5g供试品粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂9mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)29分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
2.对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷对照品适量，置于同一容量瓶，加溶剂制成每mL含上述对照品各52μg的混合对照品溶液。
3.药材供试品溶液的制备：取20批成品及对照药材，分别按上述供试品溶液的制备的方法进行制备，得到药材供试品溶液。
上述步骤1-3中所采用的溶剂均为体积浓度为85％的甲醇。
4.高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μL，进样：色谱条件：色谱柱为WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA0002662498290000112
检测波长229nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；得到高效液相色谱标准指纹图谱。
实施例5
生发片HPLC指纹图谱的构建
1.供试品溶液的制备：取本品生发片，去包衣，研细，得到供试品粉末，取0.5g供试品粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂9mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)29分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
2.对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷对照品适量，置于同一容量瓶，加溶剂制成每mL含上述对照品各52μg的混合对照品溶液。
3.药材供试品溶液的制备：取20批成品及对照药材，分别按上述供试品溶液的制备的方法进行制备，得到药材供试品溶液。
上述步骤1-3中所采用的溶剂均为体积浓度为100％的甲醇。
4.高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μL，进样：色谱条件：色谱柱为WelchΜltimate XB-C18(4.6×250mm，5μm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA0002662498290000121
检测波长227nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；得到高效液相色谱标准指纹图谱。
以上实验结果表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价生发片的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种生发片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取生发片除去包衣后研细，得到供试品粉末，将供试品粉末按料液比为0.5g：加入9-10mL溶剂，超声处理28-30分钟，放冷后用溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
所述生发片是以中药何首乌、女贞子、墨旱莲、地黄、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻、桑椹、麦冬、黑枣、黑豆为原料制成；
（2）对照品溶液的制备：分别称取二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷为对照品并混合，再加入溶剂制成每mL含上述各对照品50-55μg的对照品溶液；
（3）采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，得到生发片高效液相色谱指纹图谱；所述色谱柱为规格为4.6×250mm、5μm的 C18键合硅胶柱，所述色谱条件为：进样量10μL；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液或0.1%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0min→105min，5%→60%A，95%→40%B，柱温25℃，检测波长225~229nm；
再利用DAD检测器和UFLC-TRIPLE TOF-DAD-MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测；质谱工作参数：ESI电喷雾离子源，离子喷雾电压负模式-4500V；喷雾气55psi；辅助加热气55psi；离子源温度550℃；气帘气35psi；碰撞气压力10psi，扫描范围m/z100-2000，采用负离子模式进行检测；通过DAD光谱比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定；
所述溶剂为70-100%的甲醇或乙醇。
2.根据权利要求1所述生发片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述超声处理是在功率250-300W、频率35-40kHz的条件下进行。
3.根据权利要求1所述生发片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述指纹图谱检测出10个共有色谱峰，1号峰为没食子酸、2号峰为原儿茶酸、3号峰为芍药苷、4号峰为大豆苷、5号峰为Suffruticoside C或异构体、6号峰为二苯乙烯苷、7号峰为染料木苷、8号峰为特女贞苷、9号峰女贞苷G13或异构体、10号峰为苯甲酰芍药苷。
4.根据权利要求1所述生发片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述指纹图谱检测出10个共有色谱峰，归属于何首乌的特征峰为1、6号峰；归属于女贞子的特征峰为2、8、9号峰；归属于黑豆的特征峰为2、4、7号峰；归属于墨旱莲的特征峰为2号峰；归属于牡丹皮的特征峰为1、3、5、10号峰。
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