CN113376273B - 一种清心莲子饮hplc特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用 - Google Patents

一种清心莲子饮hplc特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种清心莲子饮HPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用，利用高效液相色谱法，以多个对照品作为参照峰，以磷酸‑乙腈作为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定13个共有峰，构成了清心莲子饮药物特征图谱的全貌，经过指认的共有峰有6个，使清心莲子饮药物的质量控制从原来针对一个或两个成分的含量测定或少数几个共有峰的检测上升到针对整个清心莲子饮药物内在品质的把控，能够比较全面地反映清心莲子饮药物的特征，避免了只检测单一或少数几个共有峰而带来的方法缺陷，为清心莲子饮药物的内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制清心莲子饮中原药材的目的。

Description

一种清心莲子饮HPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的 应用
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种清心莲子饮HPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用。
背景技术
清心莲子饮，经典名方，出自《太平惠民和剂局方》卷五。具有清心利湿，益气养阴的功效，用于心火妄动，气阴两虚，湿热下注，遗精白浊，妇人带下赤白；肺肾亏虚，心火刑金，口舌干燥，渐成消渴，睡卧不安，四肢倦怠，病后气不收敛，阳浮于外，五心烦热病症。
为了有效地发挥清心莲子饮经典名方的临床治疗作用，对于目前中药复方制剂的质量控制来说，能够做到对于处方中的每一味药物都有一个含量测定成分，是一种比较高的质量标准。
[1]陈忠新,苟鑫宇,牟景龙,解颖,李强.HPLC法同时测定清心莲子饮中京尼平苷酸的含量，公开了采用HPLC法测定清心莲子饮中京尼平苷酸含量的方法；方法采用EliteHPLC C18(4.6×25mm，5μm)色谱柱，甲醇-0.5％HAc为流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm，流速为1.0ml/min。该方法中只检测了清心莲子饮中京尼平苷酸的含量，不能够更好地控制产品的质量。
[2]陈忠新,苟鑫宇,李强,解颖,田明.HPLC法同时测定清心莲子饮中黄芩苷及甘草酸铵两种成分的含量[J].化学工程师,2021,35(02):14-16，建立高效液相色谱方法，以清心莲子饮中黄苓苷以及甘草酸铵两种成分为研究对象，黄苓苷含量的色谱条件为：色谱柱为Elite ODS，流动相为甲醇-水-磷酸(47：3：0.2),检测波长为280nm,柱温为25℃,流速为1.0ml/min；甘草酸铵含量的色谱条件为:色谱柱为Elite ODS，流动相为乙腈-0.05％磷酸(体积比19→50：81→50进行梯度洗脱,检测波长为237nm流速为1.0ml/min。该方法检测了清心莲子饮中黄芩苷及甘草酸铵两个含量，也未针对清心莲子饮中的其他成分进行检测，不能全面控制产品的质量，而且该检测方法不是同时检测，操作复杂。
为了确保清心莲子饮的质量，发明人通过了大量的实验研究，对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定13个共有峰，构成了清心莲子饮药物特征图谱的全貌，使清心莲子饮质量控制从原来针对1个或两个成分的含量测定上升到针对整个清心莲子饮药物内在品质的把控，能够比较全面地反映清心莲子饮特征，避免了只检测单一或两个有效成分含量带来的方法缺陷，为清心莲子饮内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制清心莲子饮中原药材的目的。
发明内容
本发明的目的提供一种清心莲子饮HPLC特征图谱及该特征图谱的应用。
本发明所述清心莲子饮药物由黄芩2.18g、地骨皮2.18g、车前子2.18g、炙甘草2.18g，麦冬8.88g，去心莲子3.26g、茯苓3.26g、蜜炙黄芪3.26g、人参3.26g组成，其制备方法为：将配方量粉碎过10目筛，置电控温煎药壶，加水煎煮两次，第一次煎煮加15倍量水，浸泡30分钟后，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，用200目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，趁热用200目筛网滤过，合并滤液，即得，煎液60℃浓缩至60g,即得清心莲子饮对应实物，所述HPLC特征图谱的检测方法包括下列步骤：
1)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物2-8g，精密称定，置25ml容量瓶中，加60-80％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理20-40分钟，再称定重量，用60-80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加60-80％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.05-0.15％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5-1.5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，
1)供试品溶液的制备：取对应实物3-6g，精密称定，置25ml容量瓶中，加65-75％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理25-35分钟，再称定重量，用65-75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加65-75％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.08-0.12％％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.8-1.2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步优选的，
1)供试品溶液的制备：取对应实物5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加70％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加70％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
所述的检测方法，可用于表征车前子、甘草、黄芩药味。
根据所述的检测方法，所得的HPLC特征图谱中包含13个共有峰，其中在检测波长为237nm时，相对保留时间依次为：0.27±5％、0.59±5％、0.60±5％、1±5％、1.79±5％、1.92±5％；在检测波长为276nm时，相对保留时间依次为：0.58±5％、0.62±5％、1±5％、1.10±5％、1.12±5％、1.15±5％；1.21±5％；1.82±5％。
优选的，
根据所述的检测方法，所得的HPLC特征图谱中包含13个共有峰，其中在检测波长为237nm时，相对保留时间依次为：0.27、0.59、0.60、1、1.79、1.92；在检测波长为276nm时，相对保留时间依次为：0.58、0.62、1、1.10、1.12、1.15、1.21、1.82。
根据所述的检测方法，所述的HPLC特征图谱中包含13个共有峰中，经过指认的有6个共有峰，其中在检测波长为237nm时，指认峰为：京尼平苷酸、甘草苷，黄芩苷、甘草酸铵，相对保留时间依次为0.27±5％、0.60±5％、1.0±5％、1.79±5％；在检测波长为276nm时，指认峰为：黄芩苷、汉黄芩苷，汉黄芩素，相对保留时间依次为1.0±5％、1.21±5％、1.82±5％。
优选的，
根据所述的检测方法，所述的HPLC特征图谱中包含13个共有峰中，经过指认的有6个共有峰，其中在检测波长为237nm时，指认峰为：京尼平苷酸、甘草苷，黄芩苷、甘草酸铵，相对保留时间依次为0.27、0.60、1.0、1.79；在检测波长为276nm时，指认峰为：黄芩苷、汉黄芩苷，汉黄芩素，相对保留时间依次为1.0、1.21、1.82。
根据所述的检测方法，所述检测方法还适用于清心莲子饮中黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵的含量测定。
根据所述的检测方法，所述特征图谱在清心莲子饮药物以及含车前子药材、黄芩药材、甘草药材的制剂中检测的应用。
本发明的有益效果
1、本发明确定了清心莲子饮中黄酮类特征峰13个，指认其中6个，并表征了车前子、甘草、黄芩三个药味；不同批次对应实物的确认结果表明指纹图谱方法具有可行性和适用性；指纹图谱方法还可用于黄芩、甘草指标成分的含量测定；
2、本发明利用高效液相色谱法，以对照品地骨皮乙素、黄芩苷、黄芪甲苷、人参皂苷、甘草苷、甘草酸铵、麦冬皂苷D、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、去氢土莫酸、猪苓酸C作为参照峰，以磷酸-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定13个共有峰，构成了清心莲子饮药物特征图谱的全貌，使清心莲子饮质量控制从原来针对两个成分的含量测定检测上升到针对整个清心莲子饮药物内在品质的把控，能够比较全面地反映清心莲子饮特征，避免了只检测单一或少数两个共有峰而带来的方法缺陷，为清心莲子饮内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制清心莲子饮中原药材目的。
3、本发明采用高效液相色谱(HPLC)法构建清心莲子饮特征图谱，引入黄芩单方、黄芪单方、石莲肉单方、麦门冬单方、甘草(炙)单方、车前子单方、茯苓单方、地骨皮单方、人参单方的特征图谱进行研究，针对饮片单方、与汤剂共有的成分进行研究，并作为特征图谱峰确定的依据。采用高效液相色谱和相关对照品指认了6个特征成分，可用于表征车前子、甘草、黄芩药味，分别为京尼平苷酸、甘草苷，黄芩苷、甘草酸铵、汉黄芩苷，汉黄芩素，并作为清心莲子饮药物特征图谱特征峰确定的依据。
4、本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对清心莲子饮药物多个特征成分的质量监控，既提升了黄芩药材、地骨皮药材、车前子药材、炙甘草药材，麦冬药材，去心莲子药材、茯苓药材、蜜炙黄芪药材、人参药材的质量控制水平，又提升清心莲子饮内在质量；保持了黄芩单方、黄芪单方、石莲肉单方、麦门冬单方、甘草(炙)单方、车前子单方、茯苓单方、地骨皮单方、人参单方与清心莲子饮质量的一致性，为临床提供符合清心莲子饮要求的原料，为清心莲子饮药物用药安全提供了保障。
5、本发明用于构建特征图谱的方法简单易行，重现性好，准确可靠，在同一色谱条件下一次性最少确认6个成分，节约时间，节省检验成本，提高检测效率。
6、本发明针对目前清心莲子饮药物检测手段较少的现状，提供了一种新的清心莲子饮检测分析手段。
说明书附图
图1特征HPLC图谱(拟定)；
图2特征HPLC图谱(梯度优化1)；
图3特征HPLC图谱(梯度优化2)；
图4特征HPLC图谱(梯度优化3)；
图5流动相筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.1％磷酸)；
图6流动相筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.1％甲酸)；
图7流动相筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.1％乙酸)；
图8磷酸浓度筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.02％磷酸)；
图9磷酸浓度筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.05％磷酸)；
图10磷酸浓度筛选特征HPLC图谱(流动相A为0.1％磷酸)；
图11流速筛选特征HPLC图谱(流速为0.20ml/min)；
图12流速筛选特征HPLC图谱(流速为0.25ml/min)
图13流速筛选特征HPLC图谱(流速为0.30ml/min)；
图14色谱柱筛选特征HPLC图谱(色谱柱为ACQUITY BEH C18 100mm)；
图15色谱柱筛选特征HPLC图谱(色谱柱为Endeavorsil C18 100mm)；
图16色谱柱筛选特征HPLC图谱(色谱柱为ACQUITY HSS T3 100mm)；
图17色谱柱筛选特征HPLC图谱(色谱柱为Endeavorsil C18 150mm)；
图18色谱柱筛选特征HPLC图谱(色谱柱为ZORBAX SB-Aq 100nm)；
图19柱温筛选特征HPLC图谱(柱温为25℃)；
图20柱温筛选特征HPLC图谱(柱温为30℃)；
图21柱温筛选特征HPLC图谱(柱温为35℃)；
图22莲子饮全波长扫描的指纹图谱；
图23波长筛选特征HPLC图谱(波长为237nm)；
图24波长筛选特征HPLC图谱(波长为250nmnm)；
图25波长筛选特征HPLC图谱(波长为276nm)；
图26波长筛选特征HPLC图谱(波长为310nm)；
图27波长筛选特征HPLC图谱(波长为320nm)；
图28清心莲子饮特征HPLC图谱(波长为276nm)；
图29清心莲子饮特征HPLC图谱(波长为237nm)；
图30黄芩饮片煎液的特征HPLC图谱(波长为276nm)；
图31黄芩阴性煎液的特征HPLC图谱(波长为276nm)；
图32黄芩苷对照品特征HPLC图谱；
图33黄芩苷PDA光谱图；
图34汉黄芩苷对照品特征HPLC图谱；
图35汉黄芩苷PDA光谱图；
图36汉黄芩素对照品特征HPLC图谱；
图37汉黄芩素PDA光谱图；
图38黄芩混合对照品HPLC图谱；
图39炙甘草饮片煎液HPLC图谱(波长为237nm)；
图40炙甘草阴性煎液HPLC图谱；
图41甘草酸铵对照品HPLC图谱；
图42甘草酸铵PDA光谱图
图43甘草苷对照品HPLC图谱；
图44甘草苷PDA光谱图；
图45甘草对照品混合HPLC图谱；
图46车前子饮片煎液HPLC图谱(波长237nm)；
图47京尼平苷酸对照品HPLC图谱；
图48京尼平苷酸PDA光谱图；
图49多批对应实物图谱(276nm)；
图50多批对应实物图谱(237nm)；
图51空白溶剂HPLC图谱(波长为276nm)；
图52对照品(波长为276nm)；
图53对照品(波长为237nm)；
图54黄芩饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图55炙甘草饮片水煎HPLC图谱(波长为237nm)；
图56车前子饮片水煎HPLC图谱(波长为237nm)；
图57地骨皮饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图58茯苓饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图59黄芪饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图60人参饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图61麦冬饮片水煎HPLC图谱(波长为276nm)；
图62清心莲子饮浓缩液HPLC图谱(波长为276nm)；
图63清心莲子饮HPLC图谱(波长为237nm)。
具体实施方式
实施例1清心莲子饮对应实物的制备
取黄芩2.18g、地骨皮2.18g、车前子2.18g、炙甘草2.18g，麦冬8.88g，去心莲子3.26g、茯苓3.26g、蜜炙黄芪3.26g、人参3.26g组成，其制备方法为：将配方量粉碎过10目筛，置电控温煎药壶，加水煎煮两次，第一次煎煮加15倍量水，浸泡30分钟后，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，用200目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，趁热用200目筛网滤过，合并滤液，即得，煎液60℃浓缩至60g,即得清心莲子饮对应实物。
以下实施例2-5分别用于实施例1制备的清心莲子饮对应实物的特征图谱检测及京尼平苷酸、甘草苷，甘草酸铵、黄芩苷、汉黄芩苷，汉黄芩的含量测定。
实施例2
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加70％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加70％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加60％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物2g，精密称定，置25ml容量瓶中，加60％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理20分钟，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.05％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
(4)测定法同实施例1。
实施例4
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加80％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物8g，精密称定，置25ml容量瓶中，加80％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理40分钟，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.15％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
(4)测定法同实施例1。
实施例5
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加65％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物4g，精密称定，置25ml容量瓶中，加65％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理25分钟，再称定重量，用65％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.08％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
实施例6
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加75％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物6g，精密称定，置25ml容量瓶中，加75％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理35分钟，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.12％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
(4)测定法同实施例1。
实施例7
(1)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加78％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物7g，精密称定，置25ml容量瓶中，加78％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理38分钟，再称定重量，用78％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.14％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
(4)测定法同实施例1。
实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：
1材料、仪器、试剂与对照品
1.1饮片
Figure BDA0003097539370000071
1.2仪器
Figure BDA0003097539370000075
1.3试剂
Figure BDA0003097539370000073
1.4对照品
Figure BDA0003097539370000074
2试验方法
2.1样品制备
2.1.1清心莲子饮样品的制备
古法：分别称取黄芩、地骨皮、车前子、炙甘草各2.18g，麦冬8.88g，莲子(去心)、茯苓、黄芪(蜜炙)、人参各3.26g，粉碎过10目筛，置电控温煎药壶，加水煎煮两次。第一次煎煮加15倍量水，浸泡30分钟后，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，用200目筛网趁热过滤。第二次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，趁热用200目筛网滤过，合并滤液，即得。煎液60℃浓缩至60g,即得清心莲子饮对应实物。
2.1.2单方对应实物的制备
取单味药饮片，粉碎过10目筛，置电控温煎药壶，加水煎煮两次。第一次煎煮加15倍量水，浸泡30分钟后，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，用200目筛网趁热过滤。第二次煎煮加处方量10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，趁热用200目筛网滤过，合并滤液。煎液60℃浓缩至60g,即得。结果见表1、表2。
表1单味药对应实物的制备结果
样品名称 样品编号 投料量(g) 得液量(g) 出膏率(％) 浓缩量(g)
对应实物 QL200106-02 30.64 516.4 37.23 60.2
麦冬单方 QL200609-01 8.88 488 73.71 60.1
黄芪单方 QL200609-02 3.26 524.3 58.08 60.5
黄芩单方 QL200609-03 2.18 552.5 70.12 60.0
人参单方 QL200609-04 3.26 512.6 59.55 60.0
茯苓单方 QL200609-05 3.26 507.9 15.09 59.8
莲子单方 QL200609-06 3.26 520.3 47.33 60.5
车前子单方 QL200609-07 2.18 488.6 16.39 60.3
地骨皮单方 QL200609-08 2.18 452.4 27.93 60.0
甘草单方 QL200609-09 2.18 477 37.38 60.2
表2浓缩对应实物的制备结果
Figure BDA0003097539370000081
2.1.3阴性样(缺药味)的制备
制备方法同对应实物，煎煮时缺少相关药味即可，结果见表3。
表3阴性样(缺药味对应实物)的制备结果
样品名称 样品编号 投料量(g) 得液量(g) 浓缩液量(g)
茯苓阴性 QL200429-01 109.5 2213.4 200.0
石莲肉阴性 QL200429-02 109.63 2291 200.3
地骨皮阴性 QL200429-03 113.86 2307 200.1
炙甘草阴性 QL200428-04 113.82 2349.3 200.2
黄芩阴性 QL200428-02 113.82 2260.1 200.4
人参阴性 QL200428-01 109.47 2233.8 200.1
车前子阴性 QL200428-03 113.87 2357.3 200.0
黄芪阴性 QL1911131Y-HQ 65.7 1290.8 200.3
麦冬阴性 QL191113Y-MD 48 855.7 200.1
2.2指纹图谱方法的确立
2.2.1方案
分别从拟定指纹图谱方法的比较、色谱条件优化、供试品溶液制备方法考察、色谱峰指认和归属、不同批次对应实物的确认、初步方法再优化等方面说明方法建立过程。
2.2.2拟定指纹图谱方法
【特征图谱】照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以HSS T3(2.1*100mm,1.8μm)为色谱柱；以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为30℃；检测波长为254nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
表4梯度洗脱程序(拟定)
Figure BDA0003097539370000082
供试品溶液的制备：取本品对应实物约5g，精密称定，加水20ml，加甲醇定容至50ml，超声提取30min，再补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图1。
结果：由图1可知，色谱峰出峰较多，响应较好，色谱条件可行，但色谱峰分离较差，需进行梯度优化。
2.2.2.1梯度洗脱程序的筛选
依据“2.2.2”项下拟定指纹图谱方法，结合基线情况、色谱峰分离效果、色谱峰个数等情况，筛选梯度洗脱程序。
梯度优化1色谱条件与系统适用性试验结果见表5、图2。
表5梯度洗脱程序(梯度优化1)
Figure BDA0003097539370000091
结果：由图2可知，色谱峰出峰较前，8分钟左右出峰分离较差，调整流速，继续优化梯度。
梯度优化2色谱条件与系统适用性试验参照“2.2.2”，流速改为0.25ml/min，结果见表6、图3。
表6梯度洗脱程序(梯度优化2)
Figure BDA0003097539370000092
结果，由图3可知，色谱峰分离度较好，个别色谱峰分离不完全，继续调整梯度。
梯度优化3色谱条件与系统适用性试验参照“2.2.2”，流速改为0.25ml/min，结果见表7、图4。
表7梯度洗脱程序(梯度优化3)
Figure BDA0003097539370000093
结果：由图4可知，色谱峰分离情况较好，为优选梯度洗脱程序。
2.2.2.2色谱条件筛选
筛选方案：采用“2.2.2”的优选的梯度洗脱程序，以色谱峰个数、分离度为评价指标，对初步筛选后的指纹图谱方法的流动相(流动相种类、流速)、色谱柱(类型、厂家、柱温)、检测方法(检测器、检测波长)等进行优化，初步确定色谱条件。
2.2.2.2.1流动相的筛选
考察流动相种类、流速等对指纹图谱的影响。
色谱条件与系统适用性试验：以Endeavorsil C18 150mm为色谱柱；A为水相，以乙腈为流动相B，按2.2.2优选梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为30℃；进行PDA扫描。处理方法：276nm波长下，峰宽20，阈值50最小峰面积10000最小高度2000。
(1)比较不同酸种类：0.1％甲酸，0.1％磷酸与0.1％乙酸,结果见图5、图6、图7、表8。
表8总峰数及总峰面积结果表(流动相A为不同酸)
Figure BDA0003097539370000101
结果：流动相A为0.1％磷酸时，峰分离度较好，总峰数和总峰面积较高，所以0.1％磷酸为优选。
(2)比较不同磷酸浓度：0.02％磷酸、0.05％磷酸、0.1％磷酸，结果见图8、图9、图10、表9。
表9总峰数及总峰面积结果表(不同浓度的磷酸)
Figure BDA0003097539370000102
结果：0.1％磷酸条件下出峰数较多，分离度较好，因此0.1％磷酸为优选。
2.2.2.2.2流速的筛选
分别以流速为0.20ml/min、0.25ml/min、0.30ml/min进样，结果见图11、图12、图13、表10。
表10不同流速总峰面积结果表
Figure BDA0003097539370000103
结果：流速对色谱分离影响较小，流速为0.25ml/min的条件下主要峰的分离度较好，考虑系统压力，所以选择流速0.25ml/min为优选。
2.2.2.2.3色谱柱的筛选
考察色谱柱类型、色谱柱厂家、柱温等对指纹图谱的影响，不同色谱柱对比结果见图14、图15、图16、图17、图18、表11。
表11总峰数及总峰面积结果表(不同色谱柱)
Figure BDA0003097539370000104
结果：使用ACQUITY HSS T3 100mm色谱柱色谱峰较多，总峰面积较大，分离度较好，因此ACQUITY HSS T3 100mm色谱柱优选。
2.2.2.2.4柱温的筛选
分别以柱温为25℃、30℃、35℃进样，结果见图19、图20、图21、表12。
表12总峰数及总峰面积结果表(不同柱温)
Figure BDA0003097539370000105
结果：在30℃下峰的分离度较好，因此柱温30℃优选。
2.2.2.2.5检测波长的筛选
对供试品溶液进行全波长扫描，筛选指纹图谱方法的最佳检测波长，结果见图22。
分别以检测波长为237nm、250nm、276nm、310nm、320nm进样，结果见图23、图24、图25、图26、图27、表13。
表13总峰数及总峰面积结果表(不同波长)
Figure BDA0003097539370000111
结果：在237nm和276nm处有较多吸收。且清心莲子饮中含有的甘草和黄芩含量是在此波长下测定的。综合分析，选择检测波长为237nm和276nm优选。
2.2.3供试品溶液制备方法筛选
2.2.3.1方案
采用“2.2.2”项下拟定指纹图谱方法中的梯度洗脱程序及色谱条件的优选方案，以色谱峰个数、峰面积、等为评价指标，对提取溶剂进行考察。同时考察各含量测定指标成分是否已提取完全，判断指纹图谱方法是否可以用于指标成分的含量测定。
2.2.3.2提取溶剂的选择
样品溶剂的选择需要考虑提取峰个数、总峰面积、过滤难易程度等因素。分别比较水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇作为提取溶剂超声提取，在276nm检测波长下比较色谱峰面积大小。结果见表14、表15、表16、表17、表18。
表14 HPLC图谱结果表(提取溶剂为70％甲醇)
Figure BDA0003097539370000112
表15 HPLC图谱结果表(提取溶剂为50％甲醇)
Figure BDA0003097539370000113
Figure BDA0003097539370000121
表16 HPLC图谱结果表(提取溶剂为30％甲醇)
Figure BDA0003097539370000122
表17 HPLC图谱结果表(提取溶剂为水)
Figure BDA0003097539370000123
表18 HPLC图谱结果对比表(不同提取溶剂)
Figure BDA0003097539370000131
结果：通过比较四种选择提取溶剂得到的色谱峰提取峰的个数和总峰面积，最终选择70％甲醇作为提取溶剂为优选。
2.3考察指纹图谱方法是否可以用于指标成分的含量测定
2.3.1方案
采用“2.2.2”项下拟定指纹图谱的优选方案，对含量测定指标成分的色谱峰进行峰纯度、分离度。结合供试品溶液制备方法考察结果，与配方颗粒等方法的含量测定方法的提取溶剂类型和极性、供试品溶液浓度等进行比较，分析各成分是否已提取完全。综合分析指纹图谱方法可否用于指标成分的含量测定。结果见表20。
照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以HSS T3(2.1*100mm,1.8μm)为色谱柱；以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表31中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为30℃；检测波长为237，276nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
表19梯度洗脱表
Figure BDA0003097539370000132
对照品溶液的制备取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加70％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备取对应实物约5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解至70％甲醇左右并定容至刻度，称定重量，超声处理30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表20含量与特征图谱结果对比表
Figure BDA0003097539370000133
Figure BDA0003097539370000141
结果：由表20可知，采用特征图谱测定的色谱峰与含量测定的结果无明显差异，可用特征图谱色谱峰计算含量。
2.4初步方法的确认
2.4.1色谱峰指认和归属
对照品溶液的制备取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加70％甲醇制成没1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备取对应实物约5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解至70％甲醇左右并定容至刻度，称定重量，超声处理30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
分别取表21中的各药味，同法制备单方的煎液、阴性煎液。分别按“2.2.2”项下拟定指纹图谱方法中的梯度洗脱程序、色谱条件进行HPLC检测，结果见表20、图28、图29、图30、图31、图32、图33、图34、图35、图36、图37、图38、图39、图40、图41、图42、图43、图44、图45、图46、图47、图48。
表21对应实物特征峰归属表
Figure BDA0003097539370000142
结果：经图28-53的指认，6与黄芩苷光谱图一致，故6为黄芩苷；10与汉黄芩苷光谱图一致，故10为汉黄芩苷；12与汉黄芩素光谱图一致，故12为汉黄芩素，4与甘草苷光谱图一致，4为甘草苷，11与甘草酸铵光谱图一致，11为甘草酸铵，1与京尼平苷酸光谱图一致，故1为京尼平苷酸。
2.5不同批次对应实物的确认
2.5.1方案
按“2.2.2”项下拟定指纹图谱方法，分别测定三批由不同产地或不同批次的饮片组合制备的对应实物，考察色谱峰个数和分离效果，初步确认指纹图谱方法的可行性和适用性。
另外，将三批对应实物图谱数据分别导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，选择时间窗宽度为0.10，平均数法对色谱图进行多点校正后，自动匹配，生成图谱，计算相似度。结果见图49、图50。
结果：清心莲子饮三批对应实物样品共6针特征图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)后，相似度均在0.9以上，说明特征图谱方法稳定可行。
3指纹图谱方法学验证
3.1专属性：
按“2.3”项下拟定指纹图谱方法中的梯度洗脱程序、色谱条件及“2.4”项下的供试品溶液进行检测，分别精密吸清心莲子饮供试品溶液、混合对照品溶液、各单味药煎液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表22特征峰保留时间和峰面积(276nm)
Figure BDA0003097539370000151
表23特征峰保留时间和峰面积(237nm)
Figure BDA0003097539370000152
结果：如图51、图52、图53、图54、图55、图56、图57、图58、图59、图60、图61、图62、图63所示，清心莲子饮与各单味及对照品对照表明，黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素为黄芩的专属成分；甘草苷、甘草酸铵为甘草的专属成分；京尼平苷酸为车前子的专属成分。13个特征峰在相应的检测波长色谱峰分离度良好，见表22、表23。
3.2仪器精密度
同一份样品连续进样6次，测定指纹图谱。考察特征峰的相对保留时间、相对峰面积(RSD)。指纹峰相对保留时间见表24、表25；指纹峰相对峰面积见表26、表27。
表24指纹峰相对保留时间(237nm)
Figure BDA0003097539370000153
表25指纹峰相对保留时间(276nm)
Figure BDA0003097539370000154
表26指纹峰相对峰面积(237nm)
Figure BDA0003097539370000161
表27指纹峰相对峰面积(276nm)
Figure BDA0003097539370000162
结果：进样6次，以黄芩苷为参照峰(S)计算相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明建立的方法用于指纹图谱测定精密度良好。
4.3重复性
取同一批号样品平行6份，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，测定指纹图谱。考察指纹峰的相对保留时间、相对峰面积(RSD)。指纹峰相对保留时间见表28、表29：指纹峰相对峰面积见表30、表31。
表28指纹峰相对保留时间(重复性实验237nm)
Figure BDA0003097539370000163
表29指纹峰相对保留时间(重复性实验276nm)
Figure BDA0003097539370000164
Figure BDA0003097539370000171
表30指纹峰相对峰面积(重复性实验237nm)
Figure BDA0003097539370000172
表31指纹峰相对峰面积(重复性实验276nm)
Figure BDA0003097539370000173
结果：13个特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD符合要求，表明方法同时用于含量测定和指纹图谱重复性良好。
5试验总结
本试验依据文献和配方颗粒资料，通过色谱方法的初筛和优化，初步建立了清心莲子饮的指纹图谱方法，结论如下：
(1)确定黄酮类特征峰13个，指认其中6个，并表征了车前子、甘草、黄芩三个药味。
(2)不同批次对应实物的确认结果表明指纹图谱方法具有可行性和适用性。
(3)指纹图谱方法可用于黄芩、甘草指标成分的含量测定；
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种清心莲子饮HPLC特征图谱的检测方法，该药物由黄芩2.18g、地骨皮2.18g、车前子2.18g、炙甘草2.18g，麦冬8.88g，去心莲子3.26g、茯苓3.26g、蜜炙黄芪3.26g、人参3.26g组成，其制备方法为：将配方量粉碎过10目筛，置电控温煎药壶，加水煎煮两次，第一次煎煮加15倍量水，浸泡30分钟后，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，用200目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸20分钟，趁热用200目筛网滤过，合并滤液，即得，煎液60℃浓缩至60g,即得清心莲子饮对应实物，其特征在于，检测方法步骤为：
1)供试品溶液的制备：取清心莲子饮对应实物5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加70％甲醇溶解至刻度，称定重量，超声处理30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，即得；
2)对照品溶液的制备：精密称取适量黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、京尼平苷酸对照品，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含黄芩苷300μg、汉黄芩苷160μg、汉黄芩素30μg、甘草苷50μg、甘草酸铵250μg、京尼平苷酸50μg的混合溶液，即得；
3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：HSS T3，色谱柱规格：2.1*100mm,1.8μm；流动相：以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～2min，95％A，5％B；2～8min，95％～79％A,5％～21％B；8～15min，79％A,21％B；15～22min，79％～68％A,21％～32％B；22～24min，68％A,32％B；24～35min，68％～56％A,32％～44％B；35～40min，56％～25％A,44％～75％B；40～50min，25％～95％A,75％～5％B；50～60min，95％A,5％B；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm，276nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得京尼平苷酸、甘草苷，甘草酸铵、黄芩苷、汉黄芩苷，汉黄芩素的含量；
所述特征图谱检测方法所得的HPLC特征图谱中包含13个共有峰，其中在检测波长为237nm时，相对保留时间依次为：0.27、0.59、0.60、1、1.79、1.92；在检测波长为276nm时，相对保留时间依次为：0.58、0.62、1、1.10、1.12、1.15、1.21、1.82；经过指认的有6个共有峰，其中在检测波长为237nm时，指认峰为：京尼平苷酸、甘草苷，黄芩苷、甘草酸铵，相对保留时间依次为0.27、0.60、1.0、1.79；在检测波长为276nm时，指认峰为：黄芩苷、汉黄芩苷，汉黄芩素，相对保留时间依次为1.0、1.21、1.82。
2.根据权利要求1所述特征图谱的检测方法，其特征在于，所述检测方法可用于表征车前子、甘草、黄芩药味。
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