CN111413429A - 一种栀子中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种栀子中间体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取栀子中间体供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为78％‑82％的乙腈‑甲醇溶液，A相为0.08％‑0.12％的磷酸水溶液。本发明的检测方法具有技术简便、快速、准确的优点，重复性良好，能够有效分离待测组分，引入了一测多评法，以栀子苷、绿原酸参照物，可快速检测出栀子中间体中多种有效成分的含量变化。

Description

一种栀子中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种栀子中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法。
背景技术
千百年来，医药一直在保障和提高国人身体健康素质方面发挥着不可替代的作用。药与医相辅相成，医在乎临床疗效，药则关注品质，合格的“药”是临床疗效的前提、基础。为了保证药物临床疗效，确保制剂品质，往往需追溯至制剂生产的源头和中间过程，对从而对中药材或其中间体进行质量进行控制。
热毒宁注射液是由江苏康缘药业股份有限公司研发生产的纯中药注射剂。处方由青蒿、金银花、栀子3味药材组成，具有清热、疏风、解毒之功效，临床上常用于外感风热所致感冒、咳嗽、症见高热、微恶风寒、头痛、身痛、咳嗽痰黄；上呼道感染、急性支气管炎见上述证候者。上市至今，其明确的临床疗效，得到广大医患人员的认可，市场占有率高、临床用量大，具有较高的研究价值。
由于热毒宁注射液生产工艺复杂，涉及提取、萃取、醇沉、浓缩、干燥等多个环节。因此，为保证终产品质量的稳定、均一，对制剂生产全过程的关键工艺点建立质量评价方法、实时有效地监控热毒宁注射液生产过程中的质量显得至关重要。
栀子中间体即为热毒宁注射液生产的最重要的中间体之一，如何更有效的对其进行检测和质量监控，对终产品的质量有着直接的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种一测多评法测定栀子中间体中多种有效成分含量测定的方法，还建立了栀子中间体指纹图谱的测定方法，能更全面的控制栀子中间体的质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种栀子中间体的检测方法，该方法包括如下步骤：取栀子中间体供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为78％-82％的乙腈-甲醇溶液，A相为0.08％-0.12％的磷酸水溶液；梯度洗脱如下：
Figure BDA0002452354540000021
根据检测结果，获得栀子中间体的成分信息，或成分及其含量信息。
具体地，所述供试品的制备为，称取栀子干膏，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释，超声处理20min，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。该栀子干膏制备方法可选地如下：
栀子粉碎成粗粉，用6倍量80％乙醇加热回流1-3次，每次1小时，合并药液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶1，用盐酸调pH4.0，100℃加热1小时，冷藏12小时，滤过，滤液浓缩至50℃相对密度为1.10-1.12，真空干燥。
进一步地，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波长：237-239nm、323-325nm，柱温：34.5-35.5℃。
优选地，所述色谱条件包括：色谱柱WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为80％乙腈-甲醇溶液，A相为0.1％磷酸水溶液。
进一步地，所述色谱条件还包括：柱温：35℃；流速：0.3ml/min，检测波长：237nm、324nm。
进一步地，所述对照品选自京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C中的一种或多种。
本发明还提出了一种栀子中间体的指纹图谱构建方法，其特征在于，该方法包括：
供试品溶液的制备：栀子干膏0.06g，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释，超声处理，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液；
对所述供试品溶液进行HPLC检测，其中，所述HPLC检测色谱条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为78％-82％的乙腈-甲醇溶液，A相为0.08％-0.12％的磷酸水溶液；梯度洗脱如下：
Figure BDA0002452354540000031
根据HPLC检测结果，获得栀子中间体指纹图谱。
进一步地，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波长：237-239nm、323-325nm，柱温：34.5-35.5℃。
进一步地，所述方法还包括将对照品溶液进行所述HPLC检测；其中所述对照品选自栀子苷。
优选地，所述色谱条件包括：色谱柱WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为80％乙腈-甲醇溶液，A相为0.1％磷酸水溶液；柱温：35℃；流速：0.3ml/min，检测波长：237nm、324nm。
按以上方法建立栀子中间体图谱后，按相同的方法测定待测栀子中间体样品的图谱，然后将其与上述栀子中间体的图谱比较，相似度不低于0.90。
本发明的检测方法具有如下优点：
(1)本发明的检测方法具有技术简便、快速、准确的优点，可用于产品的定性定量检测，为热毒宁注射液成品质量控制提供了理论依据；
(2)本发明的检测方法重复性良好，能够有效分离待测组分，引入了一测多评法，以栀子苷、绿原酸参照物，可快速检测出栀子中间体中多种有效成分的含量变化。
附图说明
图1为本发明栀子中间体的洗脱条件1的色谱图。
图2为本发明栀子中间体的洗脱条件2的色谱图。
图3为本发明栀子中间体对照指纹图谱。
图4为本发明栀子中间体含量测定色谱图。
图5为本发明栀子中间体不同柱温考察色谱图。
图6为本发明栀子中间体不同流速考察色谱图。
具体实施方式
本发明中，热毒宁的制备方法如下：
青蒿1250g金银花750g栀子600g
以上三味，金银花、青蒿加13-18倍量水浸泡3小时，加热煎煮蒸馏2次，每次2小时，同时收集挥发油，备用。合并煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.03-1.08，高速离心(20000转/min)取上清液，分级超滤，超滤液减压浓缩至50℃相对密度为1.10-1.12，真空干燥，得金银花、青蒿干膏粉。栀子粉碎成粗粉，用6倍量80％乙醇加热回流1-3次，每次1小时，合并药液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶1，用盐酸调pH4.0，100℃加热1小时，冷藏12小时，滤过，滤液浓缩至50℃相对密度为1.10-1.12，真空干燥，得栀子干膏粉。取挥发油，加入6g波洛沙姆108研磨混匀后，加入900ml注射用水中，搅拌使澄明再加入上述干膏粉，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调PH值为7.5-8.0，加注射用水至1000ml。用G4垂熔漏斗滤过，灌封于10ml安瓿中，100℃流通蒸汽灭菌。每支10ml，相当生药26克，静脉滴注，本品10-20ml注射液，加入5％葡萄液或0.9％氯化钠注射液250-500ml。
前期研究中，上述栀子干膏定性定量检测方法存在共有峰少(4个共有峰)，检测指标单一(栀子苷)，测定时间长(长达60min)等问题，因此有必要对栀子干膏的定性定量检测方法进行优化。本发明提出了一种一测多评法测定栀子中间体中多种有效成分含量测定的方法，以及栀子中间体指纹图谱的测定方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
除特别指出，本发明提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可由常规渠道或市场购得。
一、色谱条件的筛选
(1)色谱柱：WatersHSST3(3.0mm×100mm，1.8μm)，流动相：B相：乙腈：甲醇(50:50)；A相：0.1％H3PO4，洗脱梯度见下表，检测波长：237nm、324nm，流速：0.4ml/min，柱温：30℃。
Figure BDA0002452354540000051
结果：如图1所示，该洗脱条件1下异绿原酸B色谱峰包峰，异绿原酸A色谱峰受杂质干扰严重分离度不佳。
(2)色谱柱：WatersHSST3(3.0mm×100mm，1.8μm)，流动相：B相：乙腈；A相：0.1％H3PO4，洗脱梯度见下表，检测波长：237nm、324nm，流速：0.3ml/min，柱温：35℃。
Figure BDA0002452354540000061
结果：如图2所示，该洗脱条件2下异绿原酸A色谱峰分离度不佳。
(3)色谱柱：WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；柱温：35℃；流动相：B相为80％乙腈-甲醇溶液，A相为0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱，洗脱梯度为见下表，流速：0.3ml/min，检测波长：237nm、324nm。
Figure BDA0002452354540000062
结果：在该条件下异绿原酸B、异绿原酸C分离度较好，确定该条件作为栀子干膏含量测定色谱条件。
二、指纹图谱的方法学考察
【指纹图谱】液相色谱法照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈：甲醇(8:2)-0.1％磷酸水溶液系统为流动相；洗脱程序为：
Figure BDA0002452354540000071
柱温为35℃；流速为0.3ml/min；检测波长为220nm。理论板数按参照物(栀子苷)峰计算，应不低于6000。
参照物溶液的制备取栀子苷对照品适量，精密称定，加25％甲醇溶解，制成每1ml含栀子苷约60μg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品约0.06g，精密称定，置25ml量瓶中，加25％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，分别注入液相色谱仪，记录1小时色谱图。
供试品指纹图谱应与对照指纹图谱相似，应有7个共有峰，经过相似度软件计算，相似度应大于0.90。
指纹图谱及各项技术参数：
(峰号)相对保留时间：(1)0.377±20％、(2)0.411±20％、(3)0.561±20％、(4)0.813±20％、(5)0.832±20％、(S)应为1、(6)1.969±20％。
对照指纹图谱如图3所示。技术参考：仪器：Agilent1290超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)。1.山栀苷；2.京尼平苷酸；3.新绿原酸；4.绿原酸；5.京尼平龙胆双糖苷；S.栀子苷。
1.仪器与材料
1.1实验仪器
Agilent1290高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；XS205电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KH-300DB超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
1.2试药与试剂
栀子干膏(江苏康缘药业股份有限公司，批号：160402-160411)；栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201617，纯度：97.6％)。
甲醇(南京化学试剂股份有限公司，批号：180522285K)；乙腈(Tedia，批号：18035148)；甲醇(Tedia，批号：18905055)；磷酸(南京化学试剂股份有限公司，批号：170825965E)。
2.方法与结果
2.1溶液制备
2.1.1对照品溶液的制备
分别取栀子苷对照品适量，精密称定，置于25ml容量瓶中，用25％甲醇溶解并定容至刻度，即得。
2.1.2供试品溶液的制备
精密称取栀子干膏0.06g，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释近刻度，超声处理20min，放冷，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(8:2)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下表；检测波长：220nm；流速：0.3ml/min；柱温：35℃。
Figure BDA0002452354540000081
Figure BDA0002452354540000091
2.3方法学考察
2.3.1精密度试验
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，以栀子苷作为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，以及相应RSD值，结果见表1、2。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5.0％，表明本方法精密度良好。
表1指纹峰相对保留时间精密度考察
Figure BDA0002452354540000092
表2指纹峰相对峰面积精密度考察
Figure BDA0002452354540000093
2.3.2重复性试验
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，分别进样，以栀子苷作为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，以及相应RSD值，结果见表3、4。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5.0％，说明本方法重复性良好。
表3指纹峰相对保留时间重复性考察
Figure BDA0002452354540000101
表4指纹峰相对峰面积重复性考察
Figure BDA0002452354540000102
2.3.3稳定性试验
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h分别进样，以栀子苷作为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，以及相应RSD值，结果见表5、6。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD小于5.0％，表明栀子干膏在24h内稳定性良好。
表5指纹峰相对保留时间稳定性考察
Figure BDA0002452354540000103
Figure BDA0002452354540000111
表6指纹峰相对峰面积精密度考察
Figure BDA0002452354540000112
2.4样品测定
按上述所建方法分析10批栀子干膏，采集指纹图谱，结果见表7、8。将得到的10批样品色谱图导入由国家药典委员会主持开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A”中进行数据处理分析，生成对照指纹图谱(见图3)，并评价相似度(表9)，相似度均在0.9以上。
表7 10批次栀子干膏指纹峰相对保留时间
Figure BDA0002452354540000113
Figure BDA0002452354540000121
表8 10批次栀子干膏指纹峰相对峰面积
Figure BDA0002452354540000122
表9 10批栀子干膏样品相似度
Figure BDA0002452354540000123
三、含量测定方法的方法学考察
【含量测定】依据高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)项下有关规定测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈：甲醇(8:2)-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，按下表进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为35℃；绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的检测波长为324nm，京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷的检测波长为237nm；理论塔板数按栀子苷峰计算，应不低于10000。
Figure BDA0002452354540000131
参照物溶液的制备取绿原酸对照品和栀子苷对照品各适量，精密称定，加25％甲醇制成每1ml含绿原酸0.03mg、栀子苷0.9mg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备精密称取栀子干膏0.06g，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释近刻度，超声处理20min，放冷，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定。以绿原酸对照品为对照，按外标法计算本品中绿原酸的含量；以本品中的绿原酸为内参物，分别按下表相对校正因子计算本品中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的含量；以栀子苷对照品为对照，按外标法计算本品中栀子苷的含量；以本品中的栀子苷为内参物，分别按下表相对校正因子计算本品中京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷的含量；以相对保留时间确定各成分峰位，其相对保留时应在规定值的±10％范围之内(若相对保留时间偏离超过±10％，则应以相应的被替代对照品确证为准)；按下述公式计算本品中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷的含量，即得。
计算公式如下：
Figure BDA0002452354540000141
Ci为本品中待测组分i的含量，fsi为待测组分i的相对校正因子，Ai为供试品溶液中待测组分i的峰面积，Cs′为用外标法测得本品中内参物含量，As′为供试品溶液中内参物的峰面积。
新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C以绿原酸为内参物，相对校正因子和相对保留时间见下表：
Figure BDA0002452354540000142
注：相对保留时间为待测成分与内参物的保留时间之比。
京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷以栀子苷为内参物，相对校正因子和相对保留时间见下表：
Figure BDA0002452354540000143
注：相对保留时间为待测成分与内参物的保留时间之比。
供试品溶液中总有机酸的含量为待测成分中的6个有机酸含量之和，分别为：绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。
供试品溶液中总环烯醚萜苷的含量为待测成分中的4个环烯醚萜苷含量之和，分别为：京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷。
本品含总环烯醚萜苷类成分的量，应为31.8％～53.1％；含总有机酸类成分的量，应为1.4％～3.0％。
技术参数(参考)：仪器：Agilent1290超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)。
1.仪器与材料
1.1实验仪器
Agilent1290高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；XS205电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KH-300DB超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
1.2试药与试剂
栀子干膏(江苏康缘药业股份有限公司，批号：160402-160411)；京尼平苷酸(中国食品药品检定研究院，批号：111828-201604，纯度：97.4％)；京尼平龙胆双糖苷(成都普菲德股份有限公司，批号：18051408，纯度：98.1％)；山栀苷(上海源叶生物科技有限公司，P30J9F64637，纯度：99.4％)；栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201617，纯度：97.6％)；新绿原酸(上海源叶生物科技有限公司，批号：P13O8F45676，纯度：99.6％)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201716，纯度：99.3％)；隐绿原酸(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y12O8H45678，纯度：98.5％)；异绿原酸A(中国食品药品检定研究院，批号：111782-201706，纯度：97.3％)；异绿原酸B(上海源叶生物科技有限公司，批号：P20J9F53191，纯度：97.3％)；异绿原酸C(中国食品药品检定研究院，批号：111894-201001，纯度：89.6％)。
甲醇(南京化学试剂股份有限公司，批号：180522285K)；乙腈(Tedia，批号：16065075、18035148)；甲醇(Tedia，批号：17095086、18905055)；磷酸(南京化学试剂股份有限公司，批号：13072211046、170825965E)。
2.方法与结果
2.1溶液制备
2.1.1对照品溶液的制备
混标母液制备：分别取京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，按表10-1所示，用25％甲醇溶解并定容至刻度，即得各单标溶液。分别精密吸取上述各单标溶液适量，用25％甲醇配制成分别含京尼平苷酸0.0413mg/ml、山栀苷0.109mg/ml、京尼平龙胆双糖苷0.488mg/ml、栀子苷4.369mg/ml、新绿原酸0.0124mg/ml、绿原酸0.0993mg/ml、隐绿原酸0.0108mg/ml、异绿原酸B0.0096mg/ml、异绿原酸A0.0217mg/ml、异绿原酸C0.0298mg/ml的混标母液。
标准工作液的制备：精密取上述对照品母液适量，配制成混合对照品溶液，分别取混标溶液2.5ml置5ml容量瓶中定容至刻度，再等比稀释，即得系列标准工作液，详见表10-2。
表10-1 10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的浓度信息
Figure BDA0002452354540000161
表10-2 10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的浓度信息(mg/ml)
Figure BDA0002452354540000162
Figure BDA0002452354540000171
2.1.2供试品溶液的制备
精密称取栀子干膏0.06g，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释近刻度，超声处理20min，放冷，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：WatersHSST3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(8:2)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下表；检测波长：237nm、324nm；流速：0.3ml/min；柱温：35℃。结果见图4。其中，1、新绿原酸2、京尼平苷酸3、山栀苷4、绿原酸5、隐绿原酸6、京尼平龙胆双糖苷7、栀子苷8、异绿原酸B9、异绿原酸A10、异绿原酸C。
Figure BDA0002452354540000172
2.3校正因子考察
2.3.1校正因子的计算
取“2.1.1”项下表10-2中不同浓度(BQ2、BQ3、BQ4)的混合对照品溶液，进样分析，其中环烯醚萜苷类成分以栀子苷作为内参物，有机酸类成分以绿原酸作为内参物，分别计算校正因子。结果见表11。
表11栀子中间体各化合物的相对校正因子
Figure BDA0002452354540000181
2.3.2校正因子的耐用性考察
取“2.1.1”项下表10-2中不同浓度(BQ2、BQ3、BQ4)的混合对照品溶液，分别考察不同柱温、流速、色谱柱、检测波长、流动相组成及不同pH值条件下校正因子的变化情况，结果见表12。
表12栀子中间体各化合物校正因子耐用性考察
Figure BDA0002452354540000182
Figure BDA0002452354540000191
2.4耐用性考察
2.4.1不同柱温考察
按“2.2”项下色谱条件，比较不同柱温(33℃，35℃，37℃)条件下栀子中间体中10个成分的分离情况，结果见图5、表13。
表13栀子中间体不同柱温考察结果
Figure BDA0002452354540000192
结果：在33℃、37℃条件下京尼平龙胆双糖苷、异绿原酸B未达到基线分离，因此柱温选用35℃。
2.4.2不同流速考察
按“2.2”项下色谱条件，比较不同流速(0.28ml/min，0.30ml/min，0.32ml/min)下栀子中间体中10个成分的分离情况，结果见图6、表14。
表14栀子中间体不同流速考察结果
Figure BDA0002452354540000193
Figure BDA0002452354540000201
结果：流速对栀子中间体中10个化合物分离度无影响。
2.5方法学考察
2.5.1线性关系考察
分别精密吸取“2.1.1”项下系列对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。记录各色谱峰的峰面积，以进样浓度(mg/ml)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表15。
表15 10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的线性回归方程
Figure BDA0002452354540000202
2.5.2精密度试验
取“2.1.1”项下同一浓度的对照品溶液(BQ3)，连续进样6针，测定峰面积，计算各色谱峰峰面积的RSD值，结果见表16。
表16栀子中间体中10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的精密度
Figure BDA0002452354540000203
Figure BDA0002452354540000211
2.5.3重复性试验
取同一批供试品(批号：160411)，精密称取0.06g，至25ml容量瓶中，平行制备供试品溶液6份，加入50％甲醇适量，超声20min，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，按“2.2”项下条件进行测定。结果见表17。
表17栀子中间体中10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的重复性(mg/g)
Figure BDA0002452354540000212
2.5.4稳定性试验
取对照品溶液(BQ3)、供试品溶液(批号：160411)各一份，分别于0、2、4、8、12、24h进样，计算各成分色谱峰峰面积的RSD值。结果见表18。
表18栀子中间体中10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的稳定性
Figure BDA0002452354540000221
2.5.5加样回收率试验
取同一批供试品(批号：160411)，精密称取0.03g，置25ml容量瓶中，加入适宜量的对照品，平行制备供试品溶液9份，加入50％甲醇适量，超声20min，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，按照上述色谱条件进行测定。结果见表19。
表19栀子中间体中10个有机酸与环烯醚萜苷类化合物的加样回收率
Figure BDA0002452354540000222
Figure BDA0002452354540000231
Figure BDA0002452354540000241
Figure BDA0002452354540000251
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种栀子中间体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取栀子中间体供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为78％-82％的乙腈-甲醇溶液，A相为0.08％-0.12％的磷酸水溶液；梯度洗脱如下：
Figure FDA0002452354530000011
根据检测结果，获得栀子中间体的成分信息，或成分及其含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品的制备为，称取栀子干膏，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释，超声处理20min，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波长：237-239nm、323-325nm，柱温：34.5-35.5℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：色谱柱WatersHSS T3 C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为80％乙腈-甲醇溶液，A相为0.1％磷酸水溶液。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：柱温：35℃；流速：0.3ml/min，检测波长：237nm、324nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品选自京尼平苷酸、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C中的一种或多种。
7.一种栀子中间体的指纹图谱构建方法，其特征在于，该方法包括：
供试品溶液的制备：栀子干膏0.06g，置于25ml量瓶中，加50％甲醇稀释，超声处理，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液；
对所述供试品溶液进行HPLC检测，其中，所述HPLC检测色谱条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为78％-82％的乙腈-甲醇溶液，A相为0.08％-0.12％的磷酸水溶液；梯度洗脱如下：
Figure FDA0002452354530000021
根据HPLC检测结果，获得栀子中间体指纹图谱。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波长：220-222nm，柱温：34.5-35.5℃。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括将对照品溶液进行所述HPLC检测；其中所述对照品选自栀子苷。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：色谱柱WatersHSS T3 C18(3.0mm×100mm，1.7μm)；流动相：B相为80％乙腈-甲醇溶液，A相为0.1％磷酸水溶液；柱温：35℃；流速：0.3ml/min，检测波长：220nm。
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