CN110554124A - 一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于栀子配方颗粒的质量控制方法技术领域，具体涉及一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法。所述指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：S1对照品溶液的制备：取栀子苷对照品用甲醇溶解稀释，制成对照品溶液；S2供试品溶液的制备：取栀子配方颗粒，提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05‑2％的磷酸水溶液，梯度洗脱。本发明具有操作简单、精密度、重复性、稳定性高的优点。
Description
技术领域
本发明属于栀子配方颗粒的质量控制方法技术领域，具体涉及一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法。
背景技术
中药配方颗粒是近年来新出现的一种饮片补充形式，逐渐受到广大消费者的接受和欢迎。
栀子(Gradenia jasminoides Ellis)系茜草科栀子属植物的干燥成熟果实，具有泻火除燥、清热利湿、凉血解毒和外用消肿止痛的功效。用于热病心烦、湿热黄瘟、淋证涩痛、血热吐阻、目赤肿痛、火毒疮疡，外治扭挫伤痛。
栀子含有11种环烯醚萜苷类化合物，包括栀子苷(Geniposide)、羟异栀子苷(Gardenoside)、京尼平1-β-龙胆双糖苷(Genipin1-β-gentiobioside)、栀子苷酸(Geniposidic acid)、京尼平(Genipin)等。而栀子苷是主要的环烯醚萜苷化合物，它是栀子作为中药的有效成分。此外，栀子中还含有有机酸类化合物如绿原酸，二萜类化合物如西红花苷等。
栀子配方颗粒以栀子饮片为原料，经现代化的提取、浓缩、干燥、制粒等制剂工艺加工而成。
栀子的鉴别及分析测定方法较多，有纸色谱、薄层色谱、紫外分光光度法、薄层扫描法及HPLC法等，但均存在不同程度的缺点和不足之处。栀子、炒栀子、焦栀子饮片在性状上存在明显的差异，通过性状即可简单快速地对其进行鉴别。但是栀子、炒栀子、焦栀子通过水提取、浓缩、干燥、制粒等工艺制成配方颗粒之后，失去了性状上的差异，很难直观地对其进行辨别。
而且，有文献研究表明，土壤、光照、水分、CO2浓度、温度、UV-B辐射等因素会造成积累不同的中药次生代谢产物，影响药材品质，进而导致中药饮片质量不一。栀子主产于江西、福建、湖北、浙江、广西、四川等地，为临床常用药，其品质的好坏直接影响到用药的安全性和有效性。在2015年版《中国药典》中仅采用单一成分栀子苷作为质控指标，不能从整体上控制药材的内在质量。指纹图谱可以体现药材中已知成分或未知成分的分布情况，能够较为全面的反映中药所含化学成分的相对关系，进而真正全面表征药材内在质量。
经检索，已有不少企业在栀子药材及含栀子的药物制剂中引入指纹图谱的形式进行质量控制。如中国专利申请CN200810184581.3即公开了一种对炒栀子配方颗粒进行质量控制的方法，该方法是基于红外指纹图谱的方法进行质量鉴别。
中国专利申请CN03146034.8公开了一种对栀子药材和栀子半成品进行质量控制的方法。该方法以栀子苷对照品，供试品溶液的制备：取栀子过24目筛的粗粉0.5g，精密称定，置100ml三角瓶中，加甲醇100ml超声提取15-30min，过滤，取续滤液50ml，水浴蒸干，残渣用约5ml水溶解，上5g的颗粒活性炭柱，用水洗至近无色后，加30ml 60-80％乙醇洗脱，乙醇洗脱液蒸干，残渣用甲醇溶解，定容成10ml，摇匀，用滤膜过滤，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：取栀子苷对照品，用甲醇制成1mg含0.5mg的溶液作为对照品溶液；测定方法：照高效液相色谱法测定；色谱条件和系统适用性试验，检测波长238nm，乙腈-水梯度洗脱；理论塔板数计算，应不低30000；设定供试品溶液进样量为10μl，记录60分钟的色谱图，即得；以栀于苷的色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和峰面积比值；指纹图谱及技术参数：采用高效液相色谱法，检测10批栀子药材，记录时间为1小时；共得到26个指纹峰(相对保留时间)：1(0.400)，2(0.458)，3(0.511)，4(0.588)，5(0.618)6(0.666)，7(0.722)，8(0.800)，S(1.000)，9(1.084)，10(1.109)，11(1.195)，12(1.235)，13(1.290)，14(1.815)，15(1.832)，16(1.850)，17(1.864)，18(1.889)，19(1.905)，20(1.918)，21(1.940)，22(1.950)，23(1.962)，24(1.972)，25(1.991)，26(2.019)；共有指纹峰面积比值：除栀子苷峰外，其它峰的峰面积占总峰面积的百分比都小于10％，故峰面积比值不作要求；部分峰形描述：14-26号峰为未达基线分离的组峰，有的呈宽峰；非共有峰面积：供试品图谱与对照指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积地10％。但该方法仅适用于栀子药材及半成品，无法保证能适用于栀子配方颗粒。
而且，上述方法供试品溶液的制备以及流动相梯度洗脱程序过程比较复杂，得到的指纹图谱在精密度、重复性、稳定性方面也有待提高。
发明内容
本发明的其目的在于克服现有技术的上述不足之处，提供一种操作简单、精密度、重复性、稳定性高的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，其包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备：取栀子苷对照品用甲醇溶解稀释，制成对照品溶液；
S2供试品溶液的制备：取栀子配方颗粒，提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05-2％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
优选地，S1所述对照品溶液的浓度为0.01-10mg/mL。
更优选地，S1所述对照品溶液的浓度为0.05-2mg/mL。
优选地，S3中所述高效液相色谱法的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
优选地，色谱柱的柱温为20-40℃。
更优选地，所述色谱柱的柱温为25℃，此温度下的色谱峰峰型最为正态，分离度最好。
优选地，S3中所述高效液相色谱法的检测波长为238nm，在238nm下的色谱峰较多且各峰之间的分离度较好，信息量大。
优选地，S3中所述梯度洗脱时间为90分钟；流速为每分钟1-3mL。
优选地，S3中所述梯度洗脱为：0-24min，流动相A 5％，流动相B 95％；25-39min，流动相A 15％，流动相B 85％；40-79min，流动相A 20％，流动相B 80％；80-89min，流动相A40％，流动相B 60％；90min，流动相A 50％，流动相B 50％。
优选地，所述测定方法还包括如下步骤：
S4将10-20批供试品的指纹图谱采用相对保留时间方式标定共有指纹峰，确定相对偏差大小生成对照图谱；
S5将10-20批供试品的指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度的比对，确定特征峰。
更优选地，S4中所述相对偏差不超过±3％。
更优选地，S5中所述特征峰为6个共有特征峰，峰号依次记为1-6，以6号峰栀子苷的特征峰为参比峰，出峰时间记为1min，各特征峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.41、2号峰为0.48、3号峰为、4号峰为和5号峰为0.84。
更优选地，S5中所述相似度≥0.998。
优选地，S2中提取是指向栀子配方颗粒中加入浓度为40-60％的甲醇水溶液后超声处理20-40分钟。
更优选地，所述甲醇水溶液浓度为50％，此时所得色谱峰最多，信息量最大。
更优选地，所述提取过程中超声处理30分钟，就能将栀子药材及配方颗粒的主要成分提取完全。
更优选地，所述栀子配方颗粒和甲醇水溶液的质量体积比为1:1900-2100g/ml。
优选地，S3中色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒径4-6μm。
优选地，S3中高效液相测定时进样量为5-20μL。
更优选地，所述栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备：取栀子苷对照品用甲醇溶解稀释，制成0.01-10mg/mL的对照品溶液；
S2供试品溶液的制备：取栀子配方颗粒0.05-0.5g，加入浓度为40-60％的甲醇水溶液后超声处理20-40分钟，所述栀子配方颗粒和甲醇水溶液的质量体积比为1:1900-2100g/ml，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，进样量为5-20μL，色谱柱规格：4.6×250mm，4-6μm；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05-2％的磷酸水溶液，梯度洗脱90分钟，流速为每分钟1-3mL，检测波长为238nm，柱温为20-40℃；
S4将十批供试品的指纹图谱采用相对保留时间方式标定共有指纹峰，确定相对偏差不超过±3％，生成对照图谱；
S5将十批供试品的指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行比对，确定相似度≥0.998。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，系统的反映了栀子配方颗粒化学成分的全貌，共有峰相对保留时间较为稳定，为栀子配方颗粒的质量控制提供了一种简单可靠的方法；
(2)该方法供试品制作简单，色谱条件容易实现；
(3)该方法有效表征了栀子配方颗粒的质量，有利于产品质量监控，而且该方法稳定性高、精密度高、重复性好，可准确的鉴别栀子配方颗粒的真伪。
附图说明
图1为对照品测得的指纹图谱。
图2为实施例1中供试样品测得的指纹图谱。
图3为根据10批样品的指纹图谱生成的对照图谱。
图4为10批样品的指纹图谱的相似度比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。如无特别说明，如下实施例中用到的材料、试剂与仪器如下：
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪KQ-250B型超声清洗机(昆山超声电子设备厂)；试剂：栀子苷对照品购自中国药品生物制品鉴定所，批号：110749-201316，供含量测定用，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
实施例1
一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，其包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备
取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含10mg的溶液，即得；
S2供试品溶液的制备
取栀子配方颗粒0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100mL 50％甲醇超声处理30min，振摇，放冷，再称定重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；检测波长为238nm；梯度洗脱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.4％的磷酸水溶液；梯度洗脱时间为90分钟；柱温为25℃；流速为每分钟1mL；
所述梯度洗脱程序为0-24min，流动相A 5％，流动相B 95％；25-39min，流动相A15％，流动相B 85％；40-79min，流动相A 20％，流动相B 80％；80-89min，流动相A 40％，流动相B 60％；90min，流动相A 50％，流动相B 50％。
测定步骤为：
精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录90分钟色谱，得指纹图谱，如图2所示，与对照品指纹图谱(图1)相似。
实施例2：精密度试验
取栀子配方颗粒的供试品溶液，连续进样6次，每次10μl，所得特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.3％见表1，特征峰的相对峰面积RSD均小于2.0％见表2，表明该仪器精密度良好。
表1精密度考察-特征峰相对保留时间比值
表2精密度考察-特征峰相对峰面积比值
实施例3：重复性试验
精密称取的栀子配方颗粒6份，采用同实施例1的方法进行制备，取供试品溶液，分别进样，进样体积为10μl，记录90min内的色谱图，所得各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.3％见表3，特征峰的相对峰面积RSD均小于2.0％见表4，表明该方法重现性好。
表3重复性考察-特征峰相对保留时间比值
表4重复性考察-特征峰相对峰面积比值
实施例4：稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12h测定，检测90min内的色谱图，对其中的特征峰进行分析，其相对应的色谱峰相对保留时间均小于0.3％见表5，特征峰的相对峰面积的RSD均小于2.0％见表6，结果表明供试品溶液在12h内稳定。
表5稳定性考察-特征峰相对保留时间
表6稳定性考察-特征峰相对峰面积比值
实施例5：检测十批栀子配方颗粒的指纹图谱
取10批栀子配方颗粒的供试品溶液，进样，记录90min的色谱图。以栀子苷峰为参照峰，结果10批配方颗粒有6个共有峰，分别在9.768、11.495、12.657、16.593、20.237、24.097min左右出峰。共有峰保留时间及相对保留时间均具有较好的重复性。6个共有峰的平均相对保留时间RSD均低于0.3％。这6个共有峰出峰时间较为稳定，可作为栀子配方颗粒的特征峰，见表7。10批栀子配方颗粒相似度分析结果如表8所示。图3为根据10批样品的指纹图谱生成的对照图谱。图4为10批样品的指纹图谱的相似度比较。
表7栀子配方颗粒相对保留时间
表8 10批栀子配方颗粒相似度分析结果
实施例6
一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，其包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备
取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液，即得；
S2供试品溶液的制备
取栀子配方颗粒0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加95mL 40％甲醇超声处理20min，振摇，放冷，再称定重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；检测波长为238nm；梯度洗脱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05％的磷酸水溶液；梯度洗脱时间为90分钟；柱温为20℃；流速为每分钟2mL；
所述梯度洗脱程序为0-24min，流动相A 5％，流动相B 95％；25-39min，流动相A15％，流动相B 85％；40-79min，流动相A 20％，流动相B 80％；80-89min，流动相A 40％，流动相B 60％；90min，流动相A 50％，流动相B 50％。
测定步骤为：
精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录90分钟色谱，得指纹图谱。
实施例7
一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，其包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备
取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含5mg的溶液，即得；
S2供试品溶液的制备
取栀子配方颗粒0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加105mL 60％甲醇超声处理40min，振摇，放冷，再称定重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱规格：4.6×250mm，4μm；检测波长为238nm；梯度洗脱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为2％的磷酸水溶液；梯度洗脱时间为90分钟；柱温为40℃；流速为每分钟3mL；
所述梯度洗脱程序为0-24min，流动相A 5％，流动相B 95％；25-39min，流动相A15％，流动相B 85％；40-79min，流动相A 20％，流动相B 80％；80-89min，流动相A40％，流动相B 60％；90min，流动相A50％，流动相B 50％。
测定步骤为：
精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录90分钟色谱，得指纹图谱。
上述实施例仅作为解释本发明的目的，本发明的范围不受此限制。对本领域的技术人员来说所做的修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。
Claims (10)
1.一种栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，其包括如下步骤：
S1 对照品溶液的制备：取栀子苷对照品用甲醇溶解稀释，制成对照品溶液；
S2 供试品溶液的制备：取栀子配方颗粒，提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
S3 采用高效液相色谱法测得指纹图谱，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05-2％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S1所述对照品溶液的浓度为0.01-10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S3中所述高效液相色谱法的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为238nm；梯度洗脱时间为90分钟；柱温为20-40℃；流速为每分钟1-3mL。
4.根据权利要求1所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S3中所述梯度洗脱为：0-24min，流动相A 5％，流动相B 95％；25-39min，流动相A 15％，流动相B 85％；40-79min，流动相A 20％，流动相B 80％；80-89min，流动相A 40％，流动相B 60％；90min，流动相A50％，流动相B 50％。
5.根据权利要求1所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，所述测定方法还包括如下步骤：
S4 将10-20批供试品的指纹图谱采用相对保留时间方式标定共有指纹峰，确定相对偏差大小生成对照图谱；
S5 将10-20批供试品的指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度的比对，确定特征峰。
6.根据权利要求5所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S4中所述相对偏差不超过±3％。
7.根据权利要求5所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S5中所述特征峰有6个，峰号依次记为1-6，以6号峰栀子苷的特征峰为参比峰，出峰时间记为1min，其余各特征峰的相对保留时间分别为：0.41、0.48、0.53、0.69和0.84。
8.根据权利要求5所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S5中所述相似度≥0.998。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S2中所述提取是指向栀子配方颗粒中加入浓度为40-60％的甲醇水溶液后超声处理20-40分钟。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的栀子配方颗粒指纹图谱的测定方法，S3中高效液相色谱法色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒径4-6μm；进样量为5-20μL。
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