CN102980956A - 一种9-羰基-10,11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，其步骤：A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片阴干，粉碎；B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品，溶于甲醇，在超声提取器中提取，过滤得到滤液；C、减压蒸干：将上述滤液减压蒸干，得到浸膏，用少量甲醇溶解，用水分散；D、萃取：上述C步骤的甲醇溶液用乙酸乙酯萃取，取上层减压蒸干得到浸膏；E、硅胶柱层析；G、HPLC检测。本发明可靠性高、所用仪器简单、操作方便、检测效率高等优点，适于常规实验室进行标准毒素的制备和分析工作。

Description

一种9-羰基-10,11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法。 

背景技术

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)是一种世界性恶性有毒杂草，自20世纪40年代从缅甸、印度、越南等国边境传入我国以来，迅速遍及云南、贵州、广西、四川、西藏等省区。紫茎泽兰的繁殖能力强，传播速度快，以每年30公里的速度向北、向东推进。在国家总局公认的首批入侵国内的16种外来物种黑名单中，紫茎泽兰名列第一，被称为生物癌症。其中9-羰基-10，11-去氢泽兰酮为紫茎泽兰的主要致肝脏毒性成分及杀虫的生物活性成分。因此有必要建立一种能在常规实验室推广应用的高效提取检测9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的技术。 

发明内容

本发明的目的克服现有技术中的缺陷，提供一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，能快速的提取EUPTOX A，并精确的检测其纯度，为科学研究提供了技术基础。 

其具体技术方案为： 

一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，包括以下步骤： 

A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片在没有阳光的地方阴干或冻干，然后粉碎； 

B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品，溶于甲醇，置于40MHz超声提取器或超声波清洗器，在40℃超生提取30min，提取2-3次，即提取完全，过滤得到滤液； 

C、减压蒸干：将步骤B所得的滤液在旋转蒸发仪中40℃减压蒸干，得到浸膏，按浸膏与甲醇的用量比为1∶5溶解，待完全溶解加入蒸馏水至甲醇含量为20％进行分散； 

D、萃取：上述C步骤的甲醇水提液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的量为甲醇水提液的1/2，取上层减压蒸干得到浸膏，为了提取率高可进行多次萃取； 

E、硅胶拌样，干法上样进行硅胶柱层析：按浸膏与硅胶H的用量比为1∶1～1∶2，搅拌混合后，加入层析柱后，先用二氯甲烷做洗脱液，洗去低极性杂质；再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(98∶2，v/v)洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到浸膏； 

F、过树脂：浸膏溶于甲醇∶水∶三氯甲烷85∶10∶5(v/v/v)溶剂中，上XAD-2/D101大孔 树脂柱洗脱以除去色素等杂质，收集洗脱液，减压蒸干得到粗品，粗品反复硅胶层析，并且分时间段收集洗脱液，薄层色谱法对洗脱液进行分类及合并同类项，展开剂为石油醚∶丙酮/12∶1(v/v)，Rf值为0.45的收集液为所提取物质； 

G、HPLC检测：上述F步骤所得物质用HPLC进行浓度检测，HPLC条件：C18色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5.0μm；流动相为20％-100％的甲醇；流速为1mL·min^-1；进样量10μL；检测波长为255nm；柱温为25℃；梯度洗脱时间程序为0-10min。 

步骤B中样品和甲醇的质量比为1∶10。 

步骤E中浸膏与硅胶H的用量比1∶2。 

步骤G中，梯度洗脱时间程序为10min。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

1.本提取方法采用的是甲醇超声一步法提取，避免了提取液的多次转移而造成的污染、损失等误差，充分保证了测定结果的准确性和可靠性。 

2.提取方法涉及的仪器非常简单。所需的主要设备器材仅为测定干重时使用的烘箱，分析天平和甲醇提取时使用的超声提取器、旋转蒸发仪、冰箱等等，在普通实验室均可以操作。 

3.另外，本提取方法操作简单，大大减轻了工作强度，大大降低了提取的成本。 

4.本发明中采用的HPLC检测方法可将毒素的保留时间缩短在10min内。该检测方法值得在9-羰基-10，11-去氢泽兰酮毒素的检测中广泛应用推广。 

附图说明

图1为本发明一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮毒素的快速提取检测方法的工艺流程图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 

实施例1 

A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片在没有阳光的地方阴干，然后粉碎； 

B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品20g，溶于100ml的甲醇，置于40MHz超声波清洗器，40℃超生提取30min，提取2次，即提取完全，过滤得到滤液； 

C、减压蒸干：将上述滤液在旋转蒸发仪中40℃减压蒸干，得到浸膏，用5ml甲醇溶解，并加入蒸馏水20ml至甲醇含量为20％进行分散； 

D、萃取：上述C步骤的甲醇水提液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的量为15ml，充分摇匀，静止待萃取完成后取其上层(乙酸乙酯部分)减压蒸干得到浸膏，如果萃取不完全 可以适当增加乙酸乙酯的量； 

E、硅胶拌样，干法上样，湿法装柱进行硅胶柱层析：得到上述浸膏大约1g，按浸膏与硅胶H的用量比为1∶1，搅拌混合后，加入层析柱后，先用二氯甲烷30ml做洗脱液，洗去低极性杂质；再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(98∶2，v/v)120ml洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到浸膏； 

F、过树脂：浸膏溶于20ml甲醇∶水∶三氯甲烷(85∶10∶5，v/v/v)溶剂中，上D101大孔树脂柱洗脱以除去色素等杂，收集洗脱液，减压蒸干得到粗品，粗品反复硅胶层析，并且每3分钟收集一次洗脱液，并用薄层色谱法对洗脱液进行分类及合并同类项，展开剂为(石油醚∶丙酮/12∶1，V/V)，Rf值为0.45左右的收集液为所提取物质； 

G、HPLC检测：上述F步骤所得物质用HPLC进行浓度检测，HPLC条件：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相为甲醇∶水＝(50∶50，v/v)；流速为1mL.min^-1；进样量5μL；检测波长为255nm；柱温为25℃；梯度洗脱时间程序为0min；进样前待测样品微滤器过滤，做标准曲线计算待测样品的纯度。在该梯度洗脱时间程序下没有出现波峰，把洗脱时间改为无限后波峰在4.5min出现。 

实施例2 

A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片在没有阳光的地方阴干，然后粉碎； 

B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品20g，溶于200ml的甲醇，置于40MHz超声波清洗器，40℃超生提取30min，提取3次，即提取完全，过滤得到滤液； 

C、减压蒸干：将上述滤液在旋转蒸发仪中40℃减压蒸干，得到浸膏，用12ml甲醇溶解，并加入蒸馏水48ml至甲醇含量为20％进行分散； 

D、萃取：上述C步骤的甲醇水提液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的量为30ml(甲醇水提液的1/2)，充分摇匀，静止待萃取完成后取其上层(乙酸乙酯部分)减压蒸干得到浸膏，如果萃取不完全可以适当增加乙酸乙酯的量或多次萃取； 

E、硅胶拌样，干法上样，湿法装柱进行硅胶柱层析：得到上述浸膏大约2g，按浸膏与硅胶H的用量比为1∶2，搅拌混合后，加入层析柱后，先用二氯甲烷50ml做洗脱液，洗去低极性杂质；再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(98∶2，v/v)150ml洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到浸膏； 

F、过树脂：浸膏溶于20ml甲醇∶水∶三氯甲烷(85∶10∶5，v/v/v)溶剂中，上D101大孔树脂柱洗脱以除去色素等杂，收集洗脱液，减压蒸干得到粗品，粗品反复硅胶层析，并且每5分钟收集一次洗脱液，并用薄层色谱法对洗脱液进行分类及合并同类项，展开剂为(石油醚∶ 丙酮/12∶1，v/v)，Rf值为0.45左右的收集液为所提取物质； 

G、HPLC检测：上述F步骤所得物质用HPLC进行浓度检测，HPLC条件：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相为甲醇∶水＝(50∶50，v/v)；流速为1mL·min^-1；进样量10μL；检测波长为255nm；柱温为25℃；梯度洗脱时间程序为5min；进样前待测样品微滤器过滤，根据峰面积和进样量做线性回归分析计算。但是在该梯度洗脱时间程序下，波峰不够完整，有的杂峰还没有出现可能导致误差偏大。 

实施例3 

A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片在没有阳光的地方阴干，然后粉碎； 

B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品20g，溶于200ml的甲醇，置于50MHz超声波清洗器，40℃超生提取30min，提取3次，即提取完全，过滤得到滤液； 

C、减压蒸干：将上述滤液在旋转蒸发仪中50℃减压蒸干，得到浸膏，用10ml甲醇溶解，并加入蒸馏水40ml至甲醇含量为20％进行分散； 

D、萃取：上述C步骤的甲醇水提液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的量为25ml(甲醇水提液的1/2)，充分摇匀，静止待萃取完成后取其上层(乙酸乙酯部分)减压蒸干得到浸膏，如果萃取不完全可以适当增加乙酸乙酯的量； 

E、硅胶拌样，干法上样，湿法装柱进行硅胶柱层析：得到上述浸膏大约1.5g，按浸膏与硅胶H的用量比为1∶2，搅拌混合后，加入层析柱后，先用二氯甲烷40ml做洗脱液，洗去低极性杂质；再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(98∶2，v/v)150ml洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到浸膏； 

F、过树脂：浸膏溶于20ml甲醇∶水∶三氯甲烷(85∶10∶5，v/v/v)溶剂中，上D101大孔树脂柱洗脱以除去色素等杂，收集洗脱液，减压蒸干得到粗品，粗品反复硅胶层析，并且每5分钟收集一次洗脱液，并用薄层色谱法对洗脱液进行分类及合并同类项，展开剂为(石油醚∶丙酮/12∶1，v/v)，Rf值为0.45左右的收集液为所提取物质； 

G、HPLC检测：上述F步骤所得物质用HPLC进行浓度检测，HPLC条件：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相为甲醇∶水＝(50∶50，v/v)；流速为1mL.min^-1；进样量10μL；检测波长为255nm；柱温为25℃；梯度洗脱时间程序为10min；进样前待测样品微滤器过滤，根据峰面积和进样量做线性回归分析计算。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化 或等效替换均落入本发明的保护范围内。 

Claims (4)

1.一种9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、样品预处理：采集紫茎泽兰叶片在没有阳光的地方阴干或冻干，然后粉碎；

B、甲醇超声一步提取法：称取上述A步骤样品，溶于甲醇，置于40MHz超声提取器或超声波清洗器，在40℃超生提取30min，提取2-3次，即提取完全，过滤得到滤液；

C、减压蒸干：将步骤B所得的滤液在旋转蒸发仪中40℃减压蒸干，得到浸膏，按浸膏与甲醇的用量比为1∶5溶解，待完全溶解加入蒸馏水至甲醇含量为20％进行分散；

D、萃取：上述C步骤的甲醇水提液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的量为甲醇水提液的1/2，取上层减压蒸干得到浸膏；

E、硅胶拌样，干法上样进行硅胶柱层析：按浸膏与硅胶H的用量比为1∶1～1∶2，搅拌混合后，加入层析柱后，先用二氯甲烷做洗脱液，洗去低极性杂质；再用二氯甲烷∶乙酸乙酯98∶2(v/v)洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到浸膏；

F、过树脂：浸膏溶于甲醇∶水∶三氯甲烷85∶10∶5(v/v/v)溶剂中，上XAD-2/D101大孔树脂柱洗脱以除去色素等杂质，收集洗脱液，减压蒸干得到粗品，粗品反复硅胶层析，并且分时间段收集洗脱液，薄层色谱法对洗脱液进行分类及合并同类项，展开剂为石油醚∶丙酮/12∶1(V/V)，Rf值为0.45的收集液为所提取物质；

G、HPLC检测：上述F步骤所得物质用HPLC进行浓度检测，HPLC条件：C18色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5.0μm；流动相为20％-100％的甲醇；流速为1mL·min^-1；进样量10μL；检测波长为255nm；柱温为25℃；梯度洗脱时间程序为0-10min。

2.根据权利要求1所述的9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，其特征在于，步骤B中样品和甲醇的质量比为1∶10。

3.根据权利要求1所述的9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，其特征在于，步骤E中浸膏与硅胶H的用量比1∶2。

4.根据权利要求1所述的9-羰基-10，11-去氢泽兰酮的快速提取检测方法，其特征在于，步骤G中，梯度洗脱时间程序为10min。

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