CN102091132A - 秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了秦皮药材或其提取物中秦皮苷、秦皮甲素、秦皮素、秦皮乙素等4种有效成分的高效毛细管电泳(HPCE)快速定量方法。通过本发明的方法，4种秦皮香豆素在10min内得到良好分离和测定，同时各成分均具有良好的线性关系和回收率。本方法测定结果与HPLC法相比相关性良好，而分析时间则大大缩短，对环境污染显著降低，分析运行成本明显减少，为考察秦皮药材的有效成分分布和不同采收时期含量的变化规律提供了快速高效的分析手段，也可供秦皮提取物内在质量考察及新药开发研究参考。

Description

秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药中活性成分的检测方法，具体来说，涉及秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的HPCE检测方法。

背景技术

秦皮因地变异，品种来源有所不同，但均属于木犀科(Oleaceae)梣属(Fraxinus)植物，其形态特征和气味与本草所载类似。《中华人民共和国药典》2010年版一部规定秦皮为同属植物苦枥白蜡树Fraxinusrhynchophylla Hance、白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szabaona Lingelsh.或宿柱白蜡树Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。其中苦枥白蜡树分布于吉林、辽宁、河北、河南等地。白蜡树分布于华北、西北、华东、中南、西南及辽宁。尖叶白蜡树分布于河北、陕西、山西、甘肃、湖南。宿柱白蜡树分布于陕西。商品药材主要包括东北秦皮或辽宁秦皮(苦枥白蜡树)、四川秦皮(白蜡树)、陕西白点秦皮(宿柱白蜡树)、河南秦皮等。

秦皮具有清热解毒、清肝明目的功效，用于热痢、泄泻、赤白带下、目赤肿痛、目生翳膜等症。现代药理研究表明，秦皮具有抗病原微生物、抗炎、利尿、抗凝和抗过敏、止咳祛痰平喘、中枢抑制、抗肿瘤等多种作用，临床可用治菌痢、慢性气管炎、结膜炎等。

秦皮主要含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素等香豆素化合物，其主要化学成分的理化性质与结构如下：

秦皮甲素(esculin)

异名七叶苷(aesculin)、七叶树甙、马栗树皮苷、6、7-二羟香豆素-6-葡萄糖苷、七叶灵、esculoside、bicolorin、enullachroma、crataegin、polychrome、escosyl。分子式C₁₅H₁₆O₉，分子量340.28，针状结晶(热水)，mp.204℃-206℃，难溶于冷水，溶于沸水。溶于热乙醇、甲醇、吡啶、醋酸乙酯和醋酸。

秦皮乙素(esculetin)

异名七叶素(aesculetin)、七叶苷元、七叶树内酯、马栗树皮素、七叶亭、6、7-二羟香豆素、cichorigenin、esculetol。分子式C₉H₆O₄，分子量178.14。棱状结晶(冰醋酸)或叶状结晶(真空升华得)，mp.268℃-270℃，溶于稀碱显蓝色荧光、尚易溶于热乙醇及冰醋酸，几乎不溶于乙醚及沸水。

秦皮苷(fraxin)

异名白蜡树苷、秦皮素-8-葡萄糖苷(fraxetin-8-glucoside)、paviin、fraxo-side。分子式C₁₆H₁₈O₁₀，分子量370.30。水合物为黄色针状结晶(乙醇水溶液)，无水物mp.205℃(迅速加热)。微溶于冷水，易溶于热水及热乙醇，不溶于乙醚。

秦皮素(fraxetin)

异名秦皮亭、白蜡树内酯、fraxetol、7，8-二羟基-6-甲氧基香豆素(7，8-dihydroxy-6-methoxy-coumarin)。分子式C₁₀H₈O₅，分子量208.16。片状结晶(乙醇水溶液)，mp.227℃-228℃。极微溶于冷水、微溶于沸水和乙醚、溶于乙醇及盐酸水溶液。

秦皮香豆素化学结构

文献报道秦皮中的秦皮甲素与秦皮乙素并非梣属的专属性成分：前者同时存在于菊科、茜草科、大戟科、茄科等部分植物中；后者同时存在于芸香科、菊科、茄科、萝摩科、豆科等部分植物中，而秦皮中的秦皮苷、秦皮素却是仅存在于木犀科梣属中的专属性成分。其中秦皮苷与秦皮素、秦皮甲素与秦皮乙素互为香豆素苷和苷元的关系，并在秦皮药材的不同生长时期互相转化，其中秦皮甲素与秦皮乙素系中国药典与多数分析文献对秦皮的定量控制指标。由于秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素4种香豆素成分均为秦皮的有效成分，只测定前2～3种成分还不能全面反映秦皮的内在质量，同时也不能有效判断秦皮药材的投料-因为新药开发过程中秦皮制剂的半成品和成品由于经过提取已失去秦皮药材本身的性状特征，故仅测定前两种成分根本无法排除其他药材投料生产的可能性(如中药续随子即同时含有秦皮甲素与秦皮乙素)。因此，建立同时分析上述4种秦皮香豆素的快速测定方法，对深入开展秦皮内在质量控制和新药开发研究具有重要价值。由于HPLC法分析上述4种秦皮香豆素存在诸多不便，故本发明提供一种使用HPCE检测秦皮药材或其提取物中四种活性成分的快速方法，为秦皮质量控制提供新的手段。

发明内容

本发明一方面涉及一种使用HPCE检测秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的方法，其特征在于以磷酸二氢盐-硼砂为缓冲贮备液，其pH值介于7.8-9.2之间，优选为8.6；以乙腈为有机改性剂；检测波长介于200-400nm之间，优选为210nm；工作电压介于5-30kV之间，优选为20kV。

在本发明的一个实施方式中，使用黄豆苷元作为内标物。

在本发明的一个实施方式中，所述秦皮药材或其提取物的供试品溶液是醇提物，优选为甲醇提取物，进一步优选为回流提取或超声提取。

在本发明的一个实施方式中，制备缓冲贮备液时使用的磷酸二氢盐的浓度为80-120mmol/L，优选为100mmol/L，硼砂溶液浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L，两种溶液的体积配比为2∶1-1∶4，优选为1.02∶1.98。

在本发明的一个实施方式中，运行时缓冲贮备液∶水∶有机改性剂的体积配比为1.5∶1∶0.2-4∶1∶1，优选为3∶1∶0.8。

另一方面，本发明还涉及HPCE在同时检测秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的用途。

本发明公开了秦皮药材或其提取物中秦皮苷、秦皮甲素、秦皮素、秦皮乙素等4种有效成分的高效毛细管电泳快速定量方法。通过本发明的方法，4种秦皮香豆素在10min内得到良好分离和测定，同时各成分均具有良好的线性关系和回收率。

本方法测定结果与HPLC法相比相关性良好，而分析时间则大大缩短，对环境污染显著降低，分析运行成本明显减少，为考察秦皮的有效成分分布和不同采收时期含量的变化规律提供了快速高效的分析手段，也可供秦皮提取物内在质量考察及新药开发研究参考。

附图说明

图14种秦皮香豆素的吸收光谱图：1.秦皮苷；2.秦皮甲素；3.秦皮素；4.秦皮乙素；*内标(黄豆苷元)

图2缓冲液pH值对被分析物迁移时间的影响：1.秦皮苷；2.秦皮甲素；3.秦皮素；4.秦皮乙素；

图3乙腈加入比例对4种秦皮香豆素迁移时间和分离效果的影响：1.秦皮苷；2.秦皮甲素；3.秦皮素；4.秦皮乙素；*内标(缓冲溶液储备液∶水＝2∶1)；

图4操作电压对电流的影响；

图5操作电压对迁移时间的影响：1.秦皮苷；2.秦皮甲素；3.秦皮素；4.秦皮乙素；*内标

图6优选条件下秦皮药材的CZE图谱：1.秦皮苷；2.秦皮甲素；3.秦皮素；4.秦皮乙素；*内标

具体实施方式

1仪器、试药与样品

美国安捷伦3DCE毛细管电泳仪(型号：G1600A，包括二极管阵列检测器及HP色谱工作站)；熔融石英毛细管有效长度45cm(53.5cm×75μm ID，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；美国沃特斯515型高效液相色谱仪；沃特斯486检测器；7725i手动进样器；预柱：Phenomenex Security Guard；ChromTek色谱工作站(American Sage Inc.)。

Microfuge 18台式离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；波达1004型超声波清洗器(深圳波达超声工程设备有限公司)；TGL.16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)；BP210D型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；过滤装置及微孔滤膜(0.45μm)。

含量测定用秦皮甲素(110740-200104)、秦皮素(111727-200501)、秦皮乙素(110741-200506)和秦皮对照药材(121415-200501)购于中国药品生物制品检定所。秦皮苷购于美国Sigma公司和芜湖甙尔塔医药科技有限公司(高效液相色谱归一化法含量大于99％)。四硼酸钠(硼砂)为优级纯(天津市科密欧化学试剂开发中心)；乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾、乙醇等均为分析纯。秦皮药材除四川犍为的样品由四川恩威农业资源中心分别于2005、2006、2007年收集于出产地外，其余样品均为市售品。其中四川秦皮经四川大学药学院生药教研室王曙教授鉴定为白蜡树F.chinensis Roxb.的干燥枝皮。

2溶液的配制

2.1缓冲溶液配制

准确称取1.3609g KH₂PO₄于100mL小烧杯中，用适量水溶解后定容于100mL量瓶中，配制成浓度为100mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液。

准确称取1.9068g四硼酸钠(Na₂B₄O₇·10H₂O)于100mL小烧杯中，用适量水溶解后定容于100mL量瓶中，配制成浓度为50mmol/L的硼砂缓冲溶液。

精密吸取100mmol/L磷酸二氢钾和50mmol/L硼砂溶液，按1.02∶1.98比例配制磷酸二氢钾-硼砂缓冲溶液(pH＝8.6)储备液。临用时按如下比例配制运行缓冲溶液：缓冲贮备液-水-乙腈(3∶1∶0.8)。

2.2对照品溶液制备

内标溶液的制备：准确称取黄豆苷元100mg于100mL小烧杯中，用适量甲醇溶解后定容于100mL量瓶中，配制成每1mL含黄豆苷元1mg的溶液。

对照品储备液的制备：分别精密称取对照品秦皮苷4.8mg、秦皮甲素5.6mg、秦皮素1.96mg、秦皮乙素3.76mg，置25mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合储备液(1～4分别为192.0、224.0、78.4、150.4mg/L)。

对照品溶液制备：精密吸取对照品储备液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，再吸取5mL，置10mL量瓶中，加入内标溶液1mL，加水稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜，作为对照品溶液(1～4分别为48.0、56.0、19.6、37.6mg/L)。

2.3供试品溶液的制备

取秦皮药材粉末(过药典3号筛)0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加入内标溶液1mL，加水稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜备用。

3分析条件优化

3.1检测波长的确定

利用二极管阵列检测器在线收集秦皮香豆素在磷酸二氢钾-硼砂-乙腈缓冲系统中的光谱图，结果显示：秦皮苷在210nm和385nm处有吸收峰，秦皮甲素在207nm和373nm处有吸收峰，秦皮素在210nm和355nm处有吸收峰，秦皮乙素在207nm和365nm处有吸收峰，为了同时对这4种成分进行定量且不降低检测灵敏度，优选采用吸收强度大的210nm为检测波长。

3.2缓冲系统选择与pH值优化

采用50mmol/L硼砂缓冲体系时，秦皮素无法与相邻杂质分离，改用磷酸二氢钾-硼砂缓冲体系后分离效果有所改善，通过调整100mmol/L磷酸二氢钾和50mmol/L硼砂溶液的比例，考察了不同pH值(7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.2)的缓冲溶液对4种香豆素的影响，结果如图2所示。其迁移时间随pH值的增大呈现先缩短后恢复或延长的趋势，但出峰顺序未变；秦皮苷与秦皮甲素的分离度随pH值的升高而增大。当pH值低于8.2时，秦皮苷及秦皮甲素不能有效分离，而pH值大于9.0时，秦皮素峰拖尾。优选缓冲溶液的pH值为8.6。

3.3内标物质选择

为改善和消除毛细管电泳仪本身由于进样量极微等原因导致的进样误差，提高分析结果的准确度，进行了内标物质的筛选研究，考察了蛇床子素、香豆素、二氢香豆素、羟基苯甲酸酯类、葛根素、芦丁、橙皮苷、染料木素、水飞蓟素、儿茶素、黄豆苷元等十余种化合物的电泳行为，发现在磷酸二氢钾-硼砂-乙腈缓冲溶液中，黄豆苷元的电泳淌度与被测组分接近，其出峰时间正好在4个香豆素中间，并与其很好地分离，虽然其最大吸收波长为255nm和338nm，与秦皮香豆素并不一致，但由于吸收光谱在210nm处有一拐点，其吸收强度较大，可以满足定量分析对内标的基本要求，优选确定黄豆苷元为本方法的内标物质。

3.4缓冲系统离子强度优化

在毛细管电泳中，缓冲溶液的浓度是一个很重要的影响因素。保持溶液pH值不变，增加浓度，离子强度增大，可明显增加溶液的缓冲容量，并减少溶质和管壁之间、被分离的粒子和粒子之间的相互作用，从而改善分离效果。实验考察了不同离子强度对秦皮香豆素分离的影响。

其缓冲贮备液体积百分比(C/％)的制备方法为：取缓冲贮备液与不同比例的水混合而成，具体比例为缓冲贮备液∶水＝1.5∶1(60％)、2∶1(67％)、3∶1(75％)、4∶1(80％)。实验结果发现香豆素的迁移时间随离子强度的增加而延长。当缓冲贮备液浓度为67％(2∶1)和75％(3∶1)时，各成分分离较佳；当浓度为80％(4∶1)时，内标物质与相邻杂质峰部分重叠。

3.5有机改性剂的选择

为进一步改善分离效果，进行了有机改性剂的选择，考察了甲醇、乙腈、四氢呋喃等对分离的影响，结果发现甲醇、四氢呋喃对分离度和峰形改善不明显，而乙腈可使秦皮素、秦皮乙素峰中包含的杂质峰得到有效分离。

取缓冲贮备液∶水＝2∶1的溶液，按4∶0.2，4∶0.4，4∶0.6，4∶0.8，4∶1的体积比例进一步考察乙腈加入量的影响，结果随乙腈量增加，迁移时间延长，当达到0.8mL时，秦皮素和秦皮乙素与包含的杂质达到一定分离，再增大浓度，分离度不能进一步改善。优选以缓冲贮备液∶水∶乙腈(3∶1∶0.8)为运行缓冲液，获得较佳的分离效果。

3.6缓冲溶液运行电压筛选

分离体系最佳外加电压值与缓冲溶液浓度(离子强度)及毛细管内径和长度有关，为了尽可能使用高电压而不产生过多的焦耳热，特制作欧姆定律曲线。取运行缓冲溶液，按不同设置的运行电压(5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30kV)测试其电流值并绘制欧姆定律曲线，由图可知，当电压大于20kV时开始偏离线性段，其相应的电流偏大；进一步考察12.5、15、17.5、20、22.5、25kV运行条件下4种香豆素的分离情况，结合分析时间等综合考虑，优选分析电压为20kV。

4分析方法

毛细管使用前，用0.1mol/L NaOH溶液、水、操作缓冲溶液[100mmol/L磷酸二氢钾-50mmol/L硼砂-水-乙腈(1.02∶1.98∶1∶0.8)]各冲洗10～20min(55℃)。每次进样间再分别冲洗1、2、3min，以保证良好的重现性。取配制的对照品溶液和供试品溶液放置于样品瓶中，依次放入进样器中。在检测波长210nm(或365nm)，压力进样20kPa·s，运行电压20kV(+)-(-)，柱温25℃条件下测定其电泳谱图。按内标法计算含量。

5方法学验证

用上述秦皮HPCE快速分析方法进行线性关系、进样精密度、稳定性、重现性、加样回收率等方法学验证，结果符合定量分析要求。

6样品测定结果

按上述方法分析供试品溶液，用内标法以相对峰面积计算秦皮香豆素的含量，13批秦皮药材测定结果见表1。

表1样品中4种香豆素HPCE测定结果(n＝2)

^*四川犍为样品含量较高，测定时先稀释。

Claims (10)

1.一种使用HPCE检测秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的方法，其特征在于以磷酸二氢盐-硼砂为缓冲贮备液，其pH值介于7.8-9.2之间，以乙腈为有机改性剂，检测波长介于200-400nm之间，工作电压介于5-30kV之间。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于内标物为黄豆苷元。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述秦皮药材或其提取物的供试品溶液是醇提物。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的检测方法，其特征在于制备缓冲贮备液时使用的磷酸二氢盐的浓度为80-120mmol/L，优选为100mmol/L；硼砂溶液浓度为30-70mmol/L，优选为50mmol/L；两种溶液的体积配比为2∶1-1∶4，优选体积配比为1.02∶1.98。

5.根据权利要求4所述的检测方法，运行时缓冲贮备液∶水∶有机改性剂的体积配比为1.5∶1∶0.2-4∶1∶1。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于缓冲贮备液的pH值为8.6。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于检测波长为210nm。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于工作电压为20kV。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于运行时缓冲贮备液∶水∶有机改性剂的体积配比为3∶1∶0.8。

10.HPCE在同时检测秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的用途。

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