CN114767737B

CN114767737B - 一种秦皮提取物、其制备方法及应用

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Publication number: CN114767737B
Application number: CN202210701431.5A
Authority: CN
Inventors: 张彤; 张建革; 丁越; 路璐; 林国强; 季光
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN114767737A

Abstract

本发明涉及一种秦皮提取物、其制备方法及应用。所述秦皮提取物通过以下方法制备：将中药秦皮饮片或者秦皮药材用乙醇提取获得秦皮醇提物，之后采用生物酶对所述秦皮醇提物进行酶解反应，后续进行大孔树脂纯化和干燥。本发明中将秦皮通过上述方法处理，可将提取物中含量较高的秦皮甲素和秦皮苷转化成药效作用较强的秦皮乙素和秦皮素，进而显著提高了秦皮提取物的药物活性。

Description

一种秦皮提取物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种秦皮提取物、其制备方法及应用。

背景技术

中药秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树（Fraxinus rhynchophylla Hance）、白蜡树（Fraxinus chinensis Roxb. ）、尖叶白蜡树（Fraxinus szaboana Lingelsh. ）或宿柱白蜡树（Fraxinus stylosa Lingelsh.）的干燥枝皮或干皮。春、秋二季剥取，晒干。主产于东北、河北、河南、内蒙古、陕西、山西等地，具有清热燥湿，收涩止痢，止带，明目的功效，用于湿热泻痢，赤白带下，目赤肿痛，目生器膜。现代药理学研究表明，秦皮有抗病原微生物、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、神经血管保护、利尿等作用。秦皮中含有香豆素类、酚类、皂苷、鞣质、生物碱等多种化学成分。香豆素类化合物是秦皮的主要活性成分，其中秦皮甲素和秦皮乙素是秦皮药材质量控制的指标性成分，2020版《中国药典》规定秦皮按干燥品计算，含秦皮甲素（C₁₅H₁₆O₉）和秦皮乙素（C₉H₆O₄）的总量，不得少于1.0%。同时研究表明，秦皮药材中除了含有秦皮甲素和秦皮乙素外，还含有秦皮苷和秦皮素。相关研究（叶皓，李敬伟，曾博文，等，HPLC法测定秦皮4种有效成分的含量[J]，沈阳药科大学学报，2019，(12)：1087-1092；以及李晓尧，张丹，汤丽芝等，HPLC法同时测定秦皮中四种成分含量的研究，陕西中医, 2016,37(9):3）表明：秦皮药材中秦皮甲素和秦皮苷含量明显高于秦皮乙素和秦皮素。

从化学结构上，秦皮中的秦皮甲素和秦皮苷均是苷类香豆素成分，而秦皮乙素、秦皮素则是秦皮甲素和秦皮苷的苷元成分。秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的化学结构见图1。同时，现代药效学研究也显示苷元类成分秦皮乙素、秦皮素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等9种细菌的抑菌作用明显强于苷类香豆素成分秦皮甲素和秦皮苷。同时，秦皮乙素在抗炎和抗氧化活性方面，作用也强于秦皮甲素。鉴于此，如果能将秦皮总香豆素中的含量较高的秦皮甲素和秦皮苷转化成药效作用较强的秦皮乙素和秦皮素，将提高秦皮总香豆素的药效作用。

而目前文献和专利报道的秦皮总香豆素及其大孔树脂纯化物中总香豆素主要是以药效活性较弱的秦皮甲素和秦皮苷为主要成分。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种新的秦皮提取物，所述提取物中的秦皮乙素和秦皮素的含量在50wt%以上。

本发明的另一目的在于提供所述秦皮提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述秦皮提取物在制备药物中的用途。

本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，其包含上述秦皮提取物以及冰片。

针对秦皮药材和饮片中秦皮乙素和秦皮素含量低，传统酸水解提取方法容易引起秦皮乙素和秦皮素的开环反应，副产物较多，反应得率较差。本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的、以酶转化法制备以秦皮乙素和秦皮素为主要成分的秦皮香豆素的新方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供一种秦皮提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 以中药秦皮饮片或者秦皮药材为原料，用乙醇水溶液加热回流提取，浓缩，制得秦皮醇提物；

(2) 酶解：将步骤(1)制得的秦皮醇提物用生物酶处理经酶解反应制备得到秦皮醇提物的酶解物；

(3) 大孔树脂纯化：将步骤(2)制得的秦皮醇提物的酶解物采用大孔树脂吸附法分离，其中，用乙醇水溶液，优选地，用30-40vol%的乙醇水溶液，更优选用35 vol %乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱；

(4) 干燥：收集步骤(3)的洗脱液，浓缩后，进一步真空干燥制得所述秦皮提取物，

其中，在所述秦皮提取物中，秦皮乙素和秦皮素的总含量在50wt%以上。

在具体实施方式中，在步骤(1)中，乙醇水溶液的浓度为50-75vol%，优选地，乙醇水溶液的浓度为75%。

在具体实施方式中，在步骤(2)中，所述生物酶选自：β-葡萄糖苷酶（特别是来源于杏仁或黑曲霉的β-葡萄糖苷酶），以及木聚糖酶和纤维素酶的复合酶。该酶可以采用游离酶的方式或固定化酶的方式加入。

在具体实施方式中，所述木聚糖酶和纤维素酶的复合酶中，木聚糖酶与纤维素酶的重量比为：5:1至1:3，优选地，木聚糖酶与纤维素酶的重量比为：4:1至1:1。

在具体实施方式中，在步骤(2)中的酶解反应的pH为3.5至5.5，优选为3.8-4.8，优选地，pH系统采用醋酸-醋酸钠缓冲体系。

在具体实施方式中，在步骤(2)中的酶解反应的温度为45-55℃，优选为50℃。

在具体实施方式中，在步骤(3)中，将步骤(2)制得的秦皮醇提物的酶解物在离心或过滤后得到的离心上清液或过滤液采用大孔树脂吸附法分离。

在具体实施方式中，在步骤(3)中，大孔树脂吸附法所用吸附树脂选自D101、D301R、HPD100、ADS-7和HPD500，优选为D301R、HPD500或ADS-7。

在具体实施方式中，在步骤(3)中，采用HPD500或ADS-7大孔树脂柱进行吸附洗脱，以2BV/h速度进行吸附洗脱，采用例如3倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的35vol%乙醇水溶液洗脱，弃掉前1倍柱体积35 vol %乙醇水溶液洗脱液，收集第3-6倍柱体积的35 vol%乙醇水溶液洗脱液。

另一方面，本发明提供一种根据上述方法制备的秦皮提取物，其中所述秦皮提取物中秦皮乙素和秦皮素的总含量在50wt%以上。

在具体实施方式中，基于秦皮提取物的总重量，所述秦皮提取物中总香豆素含量高达68wt%，秦皮乙素和秦皮素的总含量在55wt%以上，秦皮甲素和秦皮苷的总含量低于1.5wt%。

在具体实施方式中，基于秦皮提取物的总重量，所述秦皮提取物中的秦皮乙素和秦皮素的含量分别为30-45wt%和10-20wt%，例如，秦皮乙素和秦皮素的含量分别为41.6wt%和15.8wt%。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述秦皮提取物，以及药学上可接受的辅料。

在具体实施方式中，所述药物组合物还包含冰片。

在具体实施方式中，所述药物组合物包含25-40重量份的所述秦皮提取物，以及1重量份的冰片。

在具体实施方式中，所述药物组合物包含25-30重量份的所述秦皮提取物，以及1重量份的冰片，例如，所述药物组合物包含29重量份的所述秦皮提取物，以及1重量份的冰片，又例如，所述药物组合物包含28.9重量份的所述秦皮提取物，以及1重量份的冰片。

在具体实施方式中，所述药物组合物的剂型形式可为滴剂、颗粒剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、胶囊剂等，但不限于此。

再一方面，本发明提供上述秦皮提取物或上述药物组合物在制备用于治疗角膜损伤药物中的用途。

在具体实施方式中，所述秦皮提取物或所述药物组合物通过抑制角膜淋巴血管新生来治疗角膜损伤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用生物酶将秦皮提取物中药效作用较弱的秦皮甲素和秦皮苷转化成药效作用较强秦皮乙素和秦皮素，新的秦皮提取物中总香豆素含量高达68wt%，其中主要以秦皮乙素和秦皮素为主要成分，含量分别为41.6wt%和15.8wt%，秦皮甲素和秦皮苷含量低于1wt%。作为药物原料，本发明的秦皮提取物比未经酶法处理的秦皮提取物更具药物开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1分别示出秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的化学结构。

图2为秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的色谱图，图2中的A：混标的HPLC色谱图；图2中的B：本申请实施例1中使用75vol%乙醇水溶液提取制得的秦皮乙醇提取物的HPLC色谱图；图2中的C：本申请的秦皮提取物 (下文中也称为“秦皮醇提物的酶解纯化产物”)的HPLC色谱图，说明：此处所述本申请的秦皮提取物按照以下实施例1中的方法，在如下工艺条件下制备：采用75 vol %乙醇水溶液提取；再用木聚糖酶和纤维素酶比例为3:1的复合酶在pH 4.5，50℃下酶解，之后采用HPD500大孔树脂柱纯化，收集第3-6倍柱体积的35vol%乙醇洗脱液洗脱，后续进行减压浓缩干燥得到。

图3示出实施例3中试验各组对小鼠角膜碱烧伤模型中淋巴管新生的作用活性结果图。其中，对照组（Ctrl，角膜未经碱烧伤）；模型组（Model，碱烧伤，用含1% DMSO的生理盐水滴眼）；秦冰滴眼液组（DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼）、5.825 mg/ml秦皮提取物（实施例1）添加0.75 mg/ml冰片组（5.825 mg/ml CHW + 0.75 mg/ml BP，碱烧伤）、10.85 mg/ml对照秦皮提取物（对照组）添加0.75 mg/ml冰片组（10.85 mg/ml TQW + 0.75 mg/ml BP，碱烧伤）和阳性对照组（0.1% CpyA，碱烧伤，用0.1% CpyA滴眼）。*、**和***表示与模型组（Model组）对比，有显著性差异（p<0.05）、非常显著性差异和极显著性差异（p<0.001）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，提供以下实施例仅出于说明目的并不构成对本发明要求保护范围的限制。

在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。

除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件（包括所附权利要求）中的参数（例如，数量或条件）的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确（在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似）。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10%，小于或等于5%，小于或等于4%，小于或等于3%，小于或等于2%，小于或等于1%或者小于或等于0.5%的变化。

除特殊说明外，在实施例中所采用的原料、试剂、方法等均为本领域常规的原料、试剂、方法。

秦皮提取物中活性成分测定：

1、秦皮提取物中总香豆素的含量测定

（1）对照品溶液的制备

精密称取秦皮甲素对照品5 mg置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为200 μg/ml 的对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备

取秦皮提取物60mg，于100 ml容量瓶中，甲醇定容，超声5分钟，混匀。

（3）样品的测定

采用紫外-可见分光光度计，取上述（1）秦皮甲素对照品溶液和上述（2）供试品溶液，以甲醇为空白，选择秦皮甲素对照品溶液的最大吸收波长334nm作为测定波长，测定样品溶液中总香豆素的含量。

2、秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量测定

（1）对照品溶液的制备

取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素对照品适量，精密称定，甲醇溶解，摇匀，即得秦皮甲素（0.00398-0.3184 mg/ml）、秦皮乙素（0.00246-0.1968 mg/ml）、秦皮苷（0.003005-0.2404 mg/ml）和秦皮素（0.002565-0.2052 mg/ml）混合对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备

取秦皮提取物60mg，于100 ml容量瓶中，甲醇定容，超声5分钟，混匀。从中取1ml至25ml容量瓶中，甲醇定容，滤过，即得。

（3）色谱条件和系统的适应性

采用液相色谱，色谱柱为Aglient TC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液：0～20min，8%乙腈；20～30min，8%～80%乙腈；30.1～32min，100%乙腈；32.1～40min, 8%乙腈；柱温30℃，体积流量1.0ml/min，检测波长334nm，进样量10μL。混标的HPLC色谱图见图2中的A，醇提物的HPLC色谱图见图2中的B，本申请实施例1中制备的秦皮提取物的HPLC色谱图见图2中的C。

第一部分：秦皮醇提物的酶解纯化物的制备工艺优化

实施例1 秦皮乙醇提取物酶解物的制备工艺

⑴ 秦皮乙醇提取物的制备

称取 250g 秦皮药材（产地：陕西商洛），分别使用8倍量不同浓度乙醇水溶液（25vol%乙醇水溶液、50 vol %乙醇水溶液、75 vol %乙醇水溶液）加热回流提取 2 次，每次 2 小时，提取液减压回收乙醇浓缩至1g/mL。测定秦皮提取液中总香豆素、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量，计算乙醇回流提取过程中，总香豆素、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的提取率，结果示于下表1中。

表1 秦皮中总香豆素、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的提取率%

结果表明：采用75 vol%乙醇水溶液提取秦皮时，总香豆素提取率最高。

⑵ 秦皮提取物酶解转化物的制备

① 生物酶的考察

酶解：取上述75 vol%乙醇水溶液提取制得的秦皮乙醇提取物80 ml，加入至300ml醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）中，加入适量的酶（其中木聚糖酶和纤维素酶复合酶考察重量比例为：5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3；来源于杏仁、黑曲霉的β-葡萄糖苷酶），50℃，185 rpm/min摇速控温搅拌反应3小时。离心取上清液，浓缩到合适体积（120ml），加入3倍95%乙醇水溶液，充分搅拌，离心弃去沉淀，浓缩至适量体积，4℃冰箱放置，备用。测定秦皮提取物的酶解物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率，结果示于下表2中。

表2 不同酶对秦皮醇提物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率的影响（%）

*表示重量比

结果表明：木聚糖酶和纤维素酶复合酶的重量比为：4:1、3:1、2:1和1:1时，秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率均高于85%，同时采用来源于杏仁和黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的酶解转化率均高于95%，但是由于β-葡萄糖苷酶的提纯酶价格太高，推荐使用木聚糖酶和纤维素酶复合酶进行酶解实验。

② 酶解反应pH值的优化

取上述75vol%乙醇水溶液提取制得的秦皮乙醇提取物80 ml，分别加入至300 ml不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.5，3.8，4.0，4.5，4.7，4.8，5.0，5.5）中，加入6.0g木聚糖酶和纤维素酶复合酶（3:1）中，50℃，185 rpm/min摇速控温搅拌反应3小时。离心取上清液，浓缩到合适体积（120ml），加入3倍95%乙醇水溶液，充分搅拌，离心弃去沉淀，浓缩至适量体积，4℃冰箱放置，备用。测定秦皮提取物的酶解物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率，结果示于下表3中。

表3 不同pH对秦皮醇提物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率的影响（%）

结果表明：在pH为3.8-4.8范围内，秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率均高于85%，其中在pH为4.5时，获得最高的酶解转化率。

③ 反应温度的优化

取上述75vol%乙醇水溶液提取制得的秦皮乙醇提取物80 ml，分别加入至300 mlpH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入6.0g木聚糖酶和纤维素酶复合酶（3:1）中，在不同温度下（40、45、50、55、60℃），185 rpm/min摇速控温搅拌反应3小时。离心取上清液，浓缩到合适体积（120ml），加入3倍95%乙醇，充分搅拌，离心弃去沉淀，浓缩至适量体积，4℃冰箱放置，备用。测定秦皮提取物的酶解物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率，结果如下表4中所示。

表4 不同温度对秦皮醇提物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率的影响（%）

结果表明：在反应温度为45-55℃范围内，秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率均高于85%。

⑶ 秦皮香豆素的纯化工艺研究

① 静态吸附法筛选大孔树脂

取秦皮醇提物酶解（选用上述优选pH、温度及生物酶参数）后的酶解产物溶液浓缩液10毫升，采用25g不同类型大孔树脂（D101、D301R、HPD100、ADS-7、HD450、HPD500）与10 ml秦皮提取液进行静态吸附，计算比吸附率。

比吸附率（％98）= （原液中总香豆素浓度-吸附后滤液中总香豆素浓度）*V吸收液/大孔树脂重量M

结果表明：D101、D301R、HPD100、ADS-7、HPD500 5种大孔树脂对秦皮乙素和秦皮素的比吸附率均高于65%，其中D301R和HPD500对秦皮乙素和秦皮苷元的比吸附率最高，分别为83.2%和88.9%。可见，D101、D301R、HPD100、ADS-7、HPD500适合于本类秦皮香豆素的纯化。

② 大孔树脂柱层析纯化工艺

取上述优化参数制得的酶解液60ml（0.5 g生药/ml），采用已处理好（用95%乙醇冲至无浑浊，再蒸馏水冲至无醇味）的HPD500大孔树脂柱进行吸附洗脱，以2BV/h速度进行吸附洗脱，采用3倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的35vol%乙醇水溶液洗脱，弃掉前1倍柱体积35vol%乙醇洗脱液，收集第3-6倍柱体积的35vol%乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得到秦皮醇提物的酶解纯化产物。

洗脱率计算公式为：Y（%）= Q2/Q1×100%；其中：Y为对各成分的洗脱率(%)；Q1为树脂未经洗脱前的秦皮乙素或秦皮素的吸附容量，单位mg•g^-1；Q2为树脂经过洗脱剂一次洗脱后秦皮乙素或秦皮素的洗脱量，单位mg•g^-1。

结果表明，秦皮醇提物的酶解纯化产物中总香豆素含量为68.0±3.4%，以秦皮乙素和秦皮素为主要成分，含量分别为41.6±2.3%和15.8±0.8%，二者总含量为57.4%±1.3%。其中秦皮甲素和秦皮苷的含量分别为0.4%和0.7%。

对照例对照秦皮提取物的制备工艺

(1) 秦皮乙醇提取物的制备与纯化

称取 100g 秦皮药材，加入8倍量（800ml）75%乙醇水溶液加热回流提取 2 次，每次 2 小时，提取液减压回收乙醇并减压浓缩至133 mL（0.75 g生药/ml）。之后进行大孔树脂纯化，上样体积为0.8倍柱体积（BV），以2BV/h体积流量过已处理好的（用95%乙醇水溶液冲至无浑浊，再蒸馏水冲至无醇味）ADS-7大孔树脂，2倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的25%乙醇水溶液洗脱，弃掉前1倍柱体积洗脱液，收集第2-6倍柱体积的25vol%乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩干燥，得到对照秦皮提取物。

经测定，秦皮提取物中总香豆素含量为81.4±1.3%，其中以秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素为主要成分，含量分别为32.1±1.1%、3.4±1.8%、26.5±2.1%和0.8±0.1%，它们的总含量为62.8%±3.8%。

⑵ 酶解与纯化

取上述秦皮乙醇提取物纯化物，混悬200 ml水溶液中，加入至600 ml醋酸-醋酸钠缓冲液（PH4.5）中，加入适量的酶（木聚糖酶和纤维素酶复合酶比例为2:1），50摄氏度，185rpm/min摇速控温搅拌反应3小时。离心取上清液，浓缩到合适体积（120ml），加入3倍95%乙醇水溶液，充分搅拌，离心弃去沉淀，浓缩至适量体积，4℃冰箱放置，备用。测定秦皮提取物的酶解物中秦皮甲素和秦皮苷的酶解转化率分别为91.2%和92.4%。

取酶解液，采用已处理好的HPD500大孔树脂柱进行吸附洗脱，以2BV/h速度进行吸附洗脱，采用3倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的35%乙醇水溶液洗脱，弃掉前1倍柱体积35%乙醇水溶液洗脱液，收集第3-6倍柱体积的35%乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩干燥，得到秦皮香豆素提取物的酶解纯化物。经测定:其中总香豆素含量为65.2±1.7%，以秦皮乙素和秦皮素为主要成分，含量分别为43.2±1.9%和15.8±1.4%，二者总含量为59.0%±1.2%。其中秦皮甲素和秦皮苷的含量较低，难以准确测定含量。

第二部分：药理活性研究

实验例：秦皮醇提物的酶解纯化产物对小鼠角膜碱烧伤模型中淋巴管新生的作用活性研究

⑴ 构建小鼠眼角膜碱烧伤模型：

首先应用舒泰（75 mg/kg体重）和盐酸赛拉嗪注射液（10 mg/kg体重）麻醉小鼠，麻醉剂腹腔注射。将直径2mm的圆形滤纸片于1 mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡30s后取出，吸走表面多余氢氧化钠溶液，将滤纸片置于小鼠眼角膜中央30s，产生急性碱烧伤区域，取走滤纸片，用生理盐水冲洗眼睛，洗去残留氢氧化钠溶液。

⑵ 药物的制备

秦冰滴眼液来源于上海中医药大学附属龙华医院；冰片购自上海万仕诚国药制品有限公司，其中龙脑含量不低于55%；环孢素滴眼液（田可明，3ml，30mg CypA）购自京东普生集大药房旗舰店；舒泰®50购自维克贸易（上海）有限公司；盐酸赛拉嗪注射液购自吉林省华牧动物保健品有限公司；小鼠购自上海中医药大学实验动物中心（北京维通利华实验动物技术有限公司）；

氢氧化钠、PFA、Triton X-100购自上海泰坦科技股份有限公司；生理盐水购自华裕（无锡）制药有限公司；PBS购自GE Healthcare；山羊血清购自上海碧云天生物技术有限公司。

秦皮提取物（上述对照例制备，下文简称为TQW，）：采用TQW按照秦冰滴眼液中秦皮药材1/2的量和冰片配制滴眼液。计为10.85 mg/ml TQW+0.75 mg/ml BP。

秦皮提取物的酶解纯化物（称为CHW）：采用实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物，按照秦冰滴眼液中秦皮药材1/4的量和冰片配制新的秦冰滴眼液。计为5.825 mg/mlCHW+0.75 mg/ml BP。[说明：在原有秦冰滴眼液配制过程中，存在秦皮总香豆素因溶解度较低，不溶解的情况，制备过程中采用超滤去除了不溶物，本实验过程中，考虑到秦皮乙素和秦皮素溶解性差，在此制备了低药物浓度的秦皮TQW和CHW滴眼液]。

⑶ 测定药物对碱烧伤角膜淋巴管新生的抑制作用：

以秦冰滴眼液和0.1% CypA（环孢素滴眼液稀释10倍）作为对照。

实验分组为对照组（Ctrl，角膜未经碱烧伤）、模型组（Model，碱烧伤，用含1% DMSO的生理盐水滴眼）、秦冰滴眼液组（DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼）、5.825 mg/ml秦皮醇提物的酶解纯化产物（实施例1）添加0.75 mg/ml冰片组（5.825 mg/ml CHW + 0.75 mg/mlBP，碱烧伤）、10.85 mg/ml上述对照例中制备的对照秦皮提取物添加0.75 mg/ml冰片组（10.85 mg/ml TQW + 0.75 mg/ml BP，碱烧伤），和阳性对照组（0.1% CpyA，碱烧伤，用0.1%CpyA滴眼）。每组小鼠8只。

给药方式为滴眼，10μl/次，4次/天，给药七天。

给药七天后处死小鼠，摘取眼球，进行角膜免疫荧光染色。用4%的PFA（多聚甲醛溶液）固定眼球1小时后，取出角膜，将角膜置入4% PFA溶液中固定过夜，PBS清洗角膜，去除残留PFA。角膜于阻断缓冲液（5 ml山羊血清 + 500 μl Triton X-100 + 94.5 ml PBS）中孵育2小时，使组织通透，随后加入一抗（Mouse LYVE-1 MAb，R＆D systems，5 μg/ml）孵育过夜，洗涤除去未结合的一抗后，于二抗（Anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor® 488Conjugate，Cell Signaling Technology，1:1000）中孵育2小时，将角膜从周围向中心做四个切口（蝴蝶状），平铺于载玻片上，用50%甘油封片，应用荧光显微镜进行拍照。照片采用ImageJ 1.52a软件进行处理，并计算其中新生淋巴管的面积，结果如图3所示。

从图3可以看出，秦冰滴眼液组（DYY）和阳性对照组（0.1% CpyA）能够显著抑制角膜中新生淋巴管的形成。由于本次实验是按照秦冰滴眼液中秦皮药材1/2量的对照秦皮提取物及其酶解纯化产物配制的滴眼液（10.85 mg/ml TQW + 0.75 mg/ml BP和5.825 mg/mlCHW + 0.75 mg/ml BP），发现对照秦皮提取物组（10.85 mg/ml TQW + 0.75 mg/ml BP）对角膜淋巴管新生的抑制作用弱于秦冰滴眼液组（DYY），但是，经过酶解转化，本发明的秦皮醇提物的酶解纯化产物与冰片的组合，即秦皮醇提物的酶解纯化产物组（5.825 mg/ml CHW+ 0.75 mg/ml BP）对角膜淋巴管新生的抑制作用优于对照秦皮提取物组（10.85 mg/mlTQW + 0.75 mg/ml BP），与秦冰滴眼液和环孢素A相当。实验结果表明，秦皮醇提物的酶解纯化产物对角膜淋巴管新生的抑制作用强于对照秦皮提取物，表明本申请中通过酶解处理可以很好地提高药物活性，在实际应用中具有很大的临床意义，另外，本申请的秦皮提取物在低剂量浓度下即可达到与现有技术的药物相当的药物活性，因此，本申请的秦皮提取物还具有很大的经济意义。

第三部分：药物制剂

1. 秦皮提取物酶解物和冰片滴眼液制备

称取实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物16.3g用重蒸馏水溶解，得到秦皮提取物酶解物溶液；另取硼酸6g，硼砂4.5g，硫代硫酸钠0.75g，羟苯乙酯0.225g，加注射用水300ml加热使溶解，搅匀，加入上述秦皮提取物溶液，放冷，得到溶液A；再取冰片0.563g，加二甲亚砜7.5g，搅拌使溶解，缓缓加至溶液A中，边加边搅拌，加注射用水至7500ml，搅匀，过滤，取滤液蒸汽灭菌30分钟，放冷，无菌分装。

2. 秦皮提取物和冰片颗粒制备

称取实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物163g和冰片5.63g，加适量糊精和蔗糖可溶性淀粉（酶解纯化产物：糊精：可溶性淀粉重量比1:40:60），用乙醇制软材，16目筛制颗粒，60℃以下干燥，得到颗粒。

3. 秦皮提取物和冰片咀嚼片制备

称取实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物16.3g和冰片0.563 g, 分别加入微晶纤维素85g、甘露醇40g，搅拌均匀，放入干燥箱内120℃烘干，研磨，细粉过100目筛，加入单晶冰糖细粉30g，搅拌均匀，过筛，在制好的颗粒中加入千分之一的硬脂酸镁，压片，0.8g/片，得到咀嚼片。

4. 秦皮提取物和冰片泡腾片制备

称取实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物16.3g和冰片0.563g、淀粉112.5g，碳酸氢钠112.5 g，柠檬酸112.5g，甜蜜素6.75g，混合后用无水乙醇制粒，干燥后压制成片，0.8g/片，得到泡腾片。

5. 秦皮提取物和冰片胶囊的制备

称取实施例1制备的秦皮醇提物的酶解纯化产物163g和冰片5.63g，与淀粉按照重量比1:10混匀，装入1号空心胶囊，即得胶囊剂。

以上各实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：在没有脱离本发明权利要求所限定的精神和实质的范围内，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换仍然在本发明权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种秦皮提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 以中药秦皮饮片或者秦皮药材为原料，用浓度为50-75vol%的乙醇水溶液加热回流提取，浓缩，制得秦皮醇提物；

(2) 酶解：将步骤(1)制得的秦皮醇提物用生物酶处理，经酶解反应制备得到秦皮醇提物的酶解物，其中，所述生物酶选自β-葡萄糖苷酶以及木聚糖酶和纤维素酶的复合酶，在所述木聚糖酶和纤维素酶的复合酶中，木聚糖酶与纤维素酶的重量比为5:1至1:3；所述酶解反应的pH为3.5至5.5，以及所述酶解反应的温度为45-55℃；

(3) 大孔树脂纯化：将步骤(2)制得的秦皮醇提物的酶解物采用大孔树脂吸附法分离，其中，采用选自D101、D301R、HPD100、ADS-7和HPD500的大孔树脂柱进行吸附洗脱，用30-40vol%的乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱；

其中，基于秦皮提取物的总重量，所述秦皮提取物中秦皮乙素和秦皮素的总含量在50wt%以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，用35vol%的乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，

所述酶解反应的pH为3.8-4.8，以及

所述酶解反应的温度为50℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，以2BV/h速度进行吸附洗脱，采用水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的35 vol %乙醇水溶液洗脱，弃掉前1倍柱体积35vol%乙醇水溶液洗脱液，收集第3-6倍柱体积的35 vol %乙醇水溶液洗脱液。