JP2002101876A - 新規なβ−グルコシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規β−グルコシダーゼを提供すると共に食
品分野、飼料分野、医薬分野等における該酵素の有効な
利用法を提供すること。 【解決手段】 アクレモニウム属糸状菌由来の、請求項
１に記載の特性（ａ）〜（ｇ）を有するβ−グルコシダ
ーゼ活性を示す酵素並びに該酵素を含有して成る酵素組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なβ−グルコ
シダーゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セル
ロリティカスに由来する新規なβ−グルコシダーゼ、及
びそれを含有する酵素組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロースは、高等植物細胞の主要な構
成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、グ
ルコースがβ−1,４−グルコシド結合により重合した高
分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状、あるい
は非結晶状態で存在しており、さらには他の成分、例え
ばリグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などとも複
雑に結合して植物組織を構築している。

【０００３】セルラーゼは、セルロースをセロオリゴ
糖、セロビオース、最終的にはグルコースにまで分解す
る反応を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式に
よって、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β
−グルコシダーゼなどに大別される。それらの作用様式
を詳細に比較すると、種々の作用様式を示す複数の酵素
が互いに補い合い、相乗効果を発現することにより、植
物細胞壁の主成分であるセルロースを分解するものと考
えられている。

【０００４】β−グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セ
ロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシ
ル結合をする配糖体からグルコースを遊離させる反応を
触媒すると考えられ、セルロースの糖化系の最終段階及
び配糖体からのグルコースの遊離において重要な酵素で
ある。

【０００５】β−グルコシダーゼの各分野への応用例と
して、飼料分野としては、飼料に添加することにより家
畜の増体及び／又は飼料効率を改善できる。また、サイ
レージ用酵素剤として、牧草のサイロへの詰め込みの際
に添加し、その発酵品質を改善せしめて良質なサイレー
ジを調製する目的で、各種のセルラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、アミラーゼをそれぞれ単剤もしくは合剤で含む製
剤、さらに、それら酵素の効果を高めることを目的とし
て、これら酵素と乳酸菌との合剤が既に市販されてい
る。しかし、さらにβ−グルコシダーゼを強化すること
により、セルロースの糖化効率が向上し、より良質なサ
イレージを調製することができる。また、食品分野とし
ては、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清
澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去、醸造、製パン
における発酵歩合の向上などに利用できる。医薬分野と
しては、臨床検査用試薬に利用される。その他の分野と
しては、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促
進や、セルロース製品の廃棄物の処理効率の向上に利用
できる。

【０００６】糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス
（Acremonium cellulolyticus)の生産する酵素に関して
言えば、セルラーゼは糖化力の強いことが特徴であり、
飼料用途やサイレージ用途での有効性が報告されている
（特開平４−１１７２４４号公報、特開平７−２３６４
３１号公報）。また、含有されているセルラーゼ成分に
ついても報告されている（Agric. Biol. Chem., 52, 24
93〜2501（1988）、同誌53, 3359〜3360（1989）、同誌
54, 309 〜317 （1990））。さらに、β−グルコシダー
ゼに関しては、従来よく知られている、例えばトリコデ
ルマ・レーゼイ（Tricoderma reesei)等のセルラーゼに
比べて著しく活性が高いことなどが報告されている（特
公昭６０−４３９５４号公報）。しかし、β−グルコシ
ダーゼの精製は不十分であり、従って酵素の諸性質につ
いては詳細な検討はされておらず、産業上有効利用する
ことができなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】β−グルコシダーゼを
産業上有効利用するためには、該酵素を単離、精製し、
酵素的、物理的性質を明らかにすることが不可欠であ
る。すなわち、本発明は、新規なβ−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼを含有してなる酵素組成物、及びこ
の酵素組成物による植物又は植物由来物の加工及び／又
は利用効率を向上させる方法の提供を目的とするもので
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスの
セルラーゼ系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭
意検討した。その結果、これら酵素群の中から３種の新
規β−グルコシダーゼを見出した。さらに、種々の植物
もしくは植物由来物に対するβ−グルコシダーゼの作用
効果を検討し、本発明を完成するに至った。

【０００９】請求項１記載の本発明は、アクレモニウム
（Acremonium）属糸状菌由来の、下記の特性を有するβ
−グルコシダーゼ活性を示す酵素である。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
る。 （ｃ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．０〜８．７の範囲で安定
である。 （ｄ）作用最適温度：５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．１〜４．７（ポリアクリルアミ
ドゲル等電点電気泳動による） （ｇ）分子量：７７，５００〜９６，０００（ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）

【００１０】請求項２記載の本発明は、糸状菌アクレモ
ニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有す
るβ−グルコシダーゼ１である。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）
を基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適
ｐＨは４．８であり、４℃、２４時間処理においてはｐ
Ｈ３．４〜８．４の範囲で安定であり、４５℃、２時間
処理においてはｐＨ３．４〜５．９の範囲で安定であ
る。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ４．
８、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．３（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動による） （ｇ）分子量：９２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による）

【００１１】請求項３記載の本発明は、糸状菌アクレモ
ニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有す
るβ−グルコシダーゼ２である。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質とし
たｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．
５であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ４．０〜
８．７の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理におい
てはｐＨ４．０〜６．２の範囲で安定である。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ４．
５、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動による） （ｇ）分子量：９６，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による）

【００１２】請求項４記載の本発明は、糸状菌アクレモ
ニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有す
るβ−グルコシダーゼ３である。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質とし
たｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは５．
１であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．０〜
７．２の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理におい
てはｐＨ３．５〜６．５の範囲で安定である。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ５．
１、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．１（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動による） （ｇ）分子量：７７，５００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による）

【００１３】請求項５記載の本発明は、請求項１〜４の
いずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含有して成
る酵素組成物である。請求項６記載の本発明は、酵素組
成物が、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率
を向上させるためのものである請求項５記載の酵素組成
物である。請求項７記載の本発明は、請求項５又は６記
載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、
プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ア
ラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナー
ゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、
ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポ
リガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは
二以上の酵素を含有することを特徴とする酵素組成物で
ある。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のβ−グルコシダーゼを含
むセルラーゼ系を生産する微生物としては、アクレモニ
ウム属の糸状菌があり、具体的にはアクレモニウム・セ
ルロリティカスＹ−９４株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ
−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ
株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５）などがある。
これらの微生物によるβ−グルコシダーゼの製造につい
ては、既知の方法、例えば特公昭６０−４３９５４号公
報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に
従って行えば良く、上記微生物の培養物からβ−グルコ
シダーゼを採取できる。上記微生物の培養終了後、培養
物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素とし
て用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾
過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素と
するか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵
素とする。

【００１５】本発明に係るβ−グルコシダーゼは、これ
ら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて、部分精製又は
高度に精製して用いることができる。精製方法として
は、常法、即ち硫酸アンモニウムなどによる塩析法；ア
ルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；イオン
交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体な
どを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合
わせて用いることができる。

【００１６】本発明に係る酵素は、β−グルコシダーゼ
活性を示す酵素、すなわちβ−Ｄ−Glucoside glucohyd
rolase EC3.2.1.21であり、具体的にはセロオリゴ糖、
セロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノ
シル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グル
コースを生成する酵素を意味する。

【００１７】本発明の第一の態様によれば、アクレモニ
ウム属糸状菌由来の、前記請求項１に記載の特性を有す
るβ−グルコシダーゼ活性を示す新規酵素が提供され
る。本発明の第二の態様によれば、上記β−グルコシダ
ーゼ活性を示す酵素は、アクレモニウム・セルロリティ
カス由来のβ−グルコシダーゼ１、β−グルコシダーゼ
２、及びβ−グルコシダーゼ３の３種類が存在し、これ
らはそれぞれ前記請求項２、３及び４に記載の特性を有
するβ−グルコシダーゼ活性を示す。

【００１８】さらに、本発明の別の態様によれば、上記
の本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を含んでなる酵
素組成物が提供される。この酵素組成物は、本発明に係
るβ−グルコシダーゼ酵素を、酵素組成物に一般的に含
まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリ
ウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等と共に
混合し、製造することができる。また、本発明の酵素組
成物は、所望により、適当な形状、例えば粉末又は液体
状等に適宜調製することができる。

【００１９】本発明に係るβ−グルコシダーゼは、グル
コース遊離能に優れており、セルロース、セロオリゴ
糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グル
コピラノシル結合をする配糖体を含有する植物又は植物
由来物の加工や利用性向上に適している。すなわち、本
発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセ
ルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグ
リコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を
加水分解することにより、植物又は植物由来物を加工及
び／又は利用効率を向上させることができる。すなわ
ち、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素
組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び
／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をす
る配糖体を加水分解することを特徴とする、該セルロー
ス、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコン
とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植
物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させ
るための酵素組成物が得られる。さらに、この酵素組成
物を用いて、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオー
ス及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結
合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工した酵
素処理物を得ることができる。

【００２０】上記の植物としては、全ての植物、又はそ
の切断物等に適用でき、植物由来物としては、細胞壁、
表皮組織等の植物組織、植物組織由来物、細胞内容物、
種々の糖タンパクや糖脂質、芳香成分や色素等といった
抽出成分など全ての植物由来物に適用できる。具体的に
は、飼料分野、食品分野では、牧草、野菜、果実等が対
象となり、これらを加工した果汁、ピューレ、ペース
ト、絞り粕、抽出粕にも適用することができる。また、
本発明のβ−グルコシダーゼは、セルロースバイオマス
のグルコースへの糖化促進や、紙等セルロースを含有す
る製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。

【００２１】上記のアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノ
シル結合をする配糖体としては、広く植物界に分布する
種々のフェノール配糖体、ニトリル配糖体、クマリン配
糖体、アントラセン配糖体、ステロイド配糖体（サポニ
ン物質）、テルペン配糖体、苦味配糖体、フラボン配糖
体、イソフラボン配糖体、フラボノール配糖体、フラバ
ノン配糖体、ペラルゴニジン配糖体、シアニジン配糖
体、デルフィニジン配糖体、トリテルペノイド配糖体、
強心配糖体等が挙げられる。

【００２２】さらに本発明によれば、β−グルコシダー
ゼ酵素又は酵素組成物に、さらにセルラーゼ、キシラナ
ーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナー
ゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガ
ラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチ
ルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロン
酸リアーゼのいずれか一もしくは二以上の成分を含有さ
せてなる酵素組成物が提供される。この酵素組成物は、
β−グルコシダーゼ酵素を単独で含んでなる酵素組成物
に比べて、植物又は植物由来物の加工、利用効率をより
一層向上させることが期待できる。

【００２３】なお、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵
素、又は酵素組成物を、動物飼料中に配合して用いるこ
とにより、飼料中のβ−グルカンの消化能を改善するこ
とができる。あるいは、本酵素でβ−グルカンを分解す
ることにより、飼料中に蓄積されているタンパク質の利
用を促進させることができる。従って、本発明によれ
ば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含有す
る飼料添加物、さらには、この飼料添加物を飼料に添加
する方法が提供される。この方法は、本発明に係るβ−
グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物により飼料成分を
処理する工程を包含する。

【００２４】また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵
素、又は酵素組成物を、サイレージに添加することによ
り、有意にサイレージの発酵品質を改善できることが見
出された。従って、本発明によれば、β−グルコシダー
ゼ酵素、又は酵素組成物を含むサイレージ用酵素剤が提
供される。なお、このサイレージ用酵素剤は、必要に応
じて、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコ
ッカス、又はペディオコッカス属の乳酸菌等から成る製
剤及び／又はプロピオニバクテリウム属等の酸生成菌か
ら成る製剤と併用することができる。この場合には、相
乗作用による一層の品質改善効果が期待できる。

【００２５】さらに本発明によれば、上記のサイレージ
用酵素剤を用いてサイレージを製造する方法、及びこの
方法により製造することを特徴とするサイレージが提供
される。ここで、サイレージ原料としては、通常のサイ
レージに用いられる牧草、飼料作物、食品等の製造副産
物、農業副産物、飼料等の全てが対象となる。牧草とし
ては、例えばイネ科牧草としては、チモシー、オーチャ
ードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグ
ラス、メドウフェスク、ギニアグラス等を用いることが
でき、マメ科牧草としては、アルファルファ、クローバ
等を用いることができる。次に、飼料作物としては、ト
ウモロコシ、ソルガム、大麦、ライムギ、ライコムギ等
を用いることができる。また、製造副産物としては、廃
糖蜜、酢粕、ビール粕、トウフ粕、ミカン粕、焼酎粕等
を用いることができる。さらに、農業副産物としては、
麦藁、ビートトップ、ビートパルプ等を用いることがで
きる。また、サイレージ原料としての飼料は、通常、発
酵飼料に使用される単味飼料及び配合飼料や濃厚飼料、
これら飼料と粗飼料とを混合した混合飼料等を用いるこ
とができる。

【００２６】本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又
は酵素組成物を食品の加工に用いることにより、ジュー
ス、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低
下、色味の改善、苦味除去などの他、醸造や製パン等に
おける発酵歩合の向上などの効果が得られる。従って、
本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組
成物を含む食品加工用酵素剤が提供される。さらには、
この食品加工用酵素剤を用いて食品を加工する方法、及
びこの方法によって製造されることを特徴とする食品が
提供される。

【００２７】また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵
素、又は酵素組成物はβ−Ｄ−グルコシドを加水分解す
る活性が高いため、アミラーゼ活性測定用の臨床検査用
試薬に利用することが可能である。

【００２８】本酵素並びに酵素組成物の使用方法として
は、上記の各種利用分野で通常採用されるｐＨ、温度な
どの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ
３〜６．５、温度１０〜８０℃の範囲で用いることが適
当である。酵素使用量については、時間と共にそれぞれ
の目的が達成されるような条件で使用すれば、十分な効
果を得ることができる。

【００２９】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

【００３０】実施例１ β−グルコシダーゼの精製 （１）酵素原末の調製 アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ原末
を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。
培地は、すべて以下の組成からなる培地を常法により加
熱滅菌したものを用いた。

【００３１】〔培地組成〕綿実油粕２％、セルロース２
％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１
％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウ
ム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１
％、硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）。

【００３２】上記培地５００ｍＬに、アクレモニウム・
セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を接
種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、
この培養液をシードとして、培地を１５Ｌにスケールア
ップし、さらにスケールアップを続けて最終的に６００
Ｌ容タンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養
を７日間行った。

【００３３】得られた培養液をフィルタープレスで濾過
した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇ
を添加してスプレードライにより粉末化した。この方法
で得られたβ−グルコシダーゼ原末は５．０ｋｇであっ
た。

【００３４】（２）β−グルコシダーゼの精製 上記（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。
得られた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した
方法で精製した。

【００３５】（ａ）強塩基性陰イオン交換クロマトグラ
フィー：ＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー（株）
製）に上清を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で
吸着させた後、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）
中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．０４Ｍ、０．１５Ｍ、０．
５Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行
い、０Ｍ、０．１５Ｍで溶出されるβ−グルコシダーゼ
活性画分（ＦＩ、ＦIII画分）を分取した。

【００３６】（ｂ）弱塩基性陰イオン交換クロマトグラ
フィー：ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー（株）
製）に上記（ａ）で分取したＦＩ画分を酢酸緩衝液
（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液
（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、
０．２Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出
を行ってβ−グルコシダーゼ活性を示した画分（ＰIII
、ＰIV画分）を分取した。

【００３７】（ｃ）疎水クロマトグラフィー：ブチルト
ヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得
た分取ＰIII 画分を０．５Ｍ （ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む酢
酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸
緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄
の濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたもの
を用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダー
ゼ活性を示した画分を分取した。

【００３８】（ｄ）疎水クロマトグラフィー：ブチルト
ヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得
た分取ＰIV画分を０．５Ｍ （ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む酢酸
緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩
衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄の
濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを
用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ
活性を示した画分を分取した。

【００３９】（ｅ）疎水クロマトグラフィー：ブチルト
ヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ａ）で得
た分取ＦIII 画分を０．７Ｍ （ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む酢
酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸
緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄
の濃度が０．７Ｍ、０．５Ｍ、０．４Ｍ、０Ｍとなるよ
うに溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行
い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。

【００４０】（ｆ）強塩基性イオン交換クロマトグラフ
ィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に
上記（ｃ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩
衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝
液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍか
ら０．２Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グ
ルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ
１）を分取した。

【００４１】（ｇ）疎水クロマトグラフィー：Ａｌｋｙ
ｌ−Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ ＨＲ５／５（ファルマシアバ
イオテク社製）に上記（ｄ）で得たβ−グルコシダーゼ
活性画分を０．５Ｍ （ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む酢酸緩衝液
（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液
（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １．
０Ｍから０Ｍを含むリニアグラジェント溶出を行い、β
−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダー
ゼ２）を分取した。

【００４２】（ｈ）ゲル濾過クロマトグラフィー：バイ
オゲルP-100 (Bio-Rad社製）に上記（ｅ）で得たβ−グ
ルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ
５．０）で通過させ、β−グルコシダーゼ活性を示した
画分を分取した。

【００４３】（ｉ）強塩基性イオン交換クロマトグラフ
ィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に
上記（ｈ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩
衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝
液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍか
ら０．１５Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−
グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ
３）を分取した。

【００４４】実施例２ β−グルコシダーゼの酵素的、
タンパク質的諸性質 （１）基質特異性、作用特性 実施例１で得た精製β−グルコシダーゼ（β−グルコシ
ダーゼ１、２、３）の各種基質に対する活性を調べた。
その結果、ｐＮＰＧを基質としたときの分解活性は順
に、３１．２、２３．１及び１０．２単位／ｍｇタンパ
ク質であり、セロビオースを基質としたときの分解活性
は順に、１９．５、１７．８及び９．０単位／ｍｇタン
パク質であった。このことから、これら３種のβ−グル
コシダーゼのセロビオース加水分解能は、ｐＮＰＧ加水
分解能よりも低いことがわかった。

【００４５】ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の
定義については以下の通りである。 ・ｐＮＰＧ分解活性 ｐＨ５．０、３０℃で、０．８５ｍＭ ｐＮＰＧ溶液に
酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェ
ノールを生成する酵素量を１単位と定義した。

【００４６】・セロビオース分解活性 ｐＨ５．０、３０℃で、１．０ｍＭ セロビオース溶液
に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコースを
生成する酵素量を１単位と定義した。

【００４７】（２）至適ｐＨ、ｐＨ安定性 実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダー
ゼ１、２、３）の３０℃における至適ｐＨを図１に示
す。これら酵素は、McIlvain緩衝液で、順にｐＨ４．
８、ｐＨ４．５、ｐＨ５．１のときに最大の活性を示し
た。また、これら酵素の４℃、２４時間におけるｐＨ安
定性を図２（Ａ）に示し、４５℃、４時間におけるｐＨ
安定性を図２（Ｂ）に示した。なお、図１中の○、△、
◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。ま
た、図２（Ａ）、（Ｂ）中の○、△、□はβ−グルコシ
ダーゼ１、２、３（McIlvain緩衝液）を示し、●、▲、
◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３（Britton-Robinson
緩衝液）を示す。

【００４８】（３）至適温度、温度安定性 実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダー
ゼ１、２、３）の作用最適温度を調べるため、ｐＮＰＧ
分解活性を測定したところ、図３に示すように、至適温
度は共に５５℃（各至適ｐＨ）であった。次に、これら
酵素の温度安定性を各至適ｐＨ、１０分の条件下で測定
したところ、図４に示したように、いずれも５０℃以下
で安定であった。なお、図３、４中の○、△、◆はβ−
グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。

【００４９】（４）分子量 実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダー
ゼ１、２、３）の分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ゲル）を行っ
た。その結果、β−グルコシダーゼ１の分子量は約９
２，０００、β−グルコシダーゼ２の分子量は約９６，
０００、β−グルコシダーゼ3 の分子量は約７７，５０
０と算出された。なお、この試験に用いた標準サンプル
の分子量は、以下の通りである。

【００５０】

【表１】第 １ 表

【００５１】（５）等電点 実施例１で得られたβ−グルコシダーゼ（β−グルコシ
ダーゼ１、２、３）の等電点（ｐＩ）を決定するため
に、ＬＫＢ両性等電点電気泳動装置を用いてポリアクリ
ルアミドゲル等電点電気泳動を行った。その結果、β−
グルコシダーゼ１の等電点は４．３、β−グルコシダー
ゼ２の等電点は４．７、β−グルコシダーゼ３の等電点
は４．１と算出された。なお、この試験に用いた標準サ
ンプルの等電点は以下の通りである。

【００５２】

【表２】第 ２ 表

【００５３】

【発明の効果】本発明により、糸状菌アクレモニウム属
微生物由来のβ−グルコシダーゼ並びに当該β−グルコ
シダーゼを含有する酵素組成物が提供される。この酵素
又は酵素組成物は、セルロースやセロオリゴ糖及び／又
はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配
糖体を含む植物や該植物由来物を加工し、利用するのに
適しており、食品分野、飼料分野、医薬分野などにおけ
る広範な利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの３０℃
における至適ｐＨを示す図である。

【図２】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼのｐＨ安
定性を示す図であり、（Ａ）は４℃、２４時間の、
（Ｂ）は４５℃、4 時間の結果である。

【図３】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの至適温
度を示す図である。

【図４】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの温度安
定性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャンサーン スパンニー 静岡県静岡市宮竹２−24−20（Ｂ) (72)発明者 江田 みさ子 埼玉県越谷市上間久里345−105 (72)発明者 河野 敏明 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 山辺 倫 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 CC08 DD03 FF05E FF11E FF12E LL02

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム（Acremonium）属糸状菌
   由来の、下記の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を
   示す酵素。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
   Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
   加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
   とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
   る。 （ｃ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．０〜８．７の範囲で安定
   である。 （ｄ）作用最適温度：５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．１〜４．７（ポリアクリルアミ
   ドゲル等電点電気泳動による） （ｇ）分子量：７７，５００〜９６，０００（ＳＤＳ−
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
2. 【請求項２】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
   スに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ
   １。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
   Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
   加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
   とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
   る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐ−ニトロフェニル
   −β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）
   を基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適
   ｐＨは４．８であり、４℃、２４時間処理においてはｐ
   Ｈ３．４〜８．４の範囲で安定であり、４５℃、２時間
   処理においてはｐＨ３．４〜５．９の範囲で安定であ
   る。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
   フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ４．
   ８、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．３（ポリアクリルアミドゲル等
   電点電気泳動による） （ｇ）分子量：９２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動による）
3. 【請求項３】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
   スに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ
   ２。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
   Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
   加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
   とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
   る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質とし
   たｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．
   ５であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ４．０〜
   ８．７の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理におい
   てはｐＨ４．０〜６．２の範囲で安定である。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
   フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ４．
   ５、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等
   電点電気泳動による） （ｇ）分子量：９６，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動による）
4. 【請求項４】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
   スに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ
   ３。 （ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−
   Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で
   加水分解し、グルコースを生成する。 （ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコン
   とβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用す
   る。 （ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質とし
   たｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは５．
   １であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．０〜
   ７．２の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理におい
   てはｐＨ３．５〜６．５の範囲で安定である。 （ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロ
   フェノール生成活性では、５５℃である。 （ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ５．
   １、１０分間）。 （ｆ）等電点：ｐＩ４．１（ポリアクリルアミドゲル等
   電点電気泳動による） （ｇ）分子量：７７，５００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動による）
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のβ
   −グルコシダーゼを含有して成る酵素組成物。
6. 【請求項６】 酵素組成物が、植物又は植物由来物を加
   工及び／又は利用効率を向上させるためのものである請
   求項５記載の酵素組成物。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載の酵素組成物が、さ
   らにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラク
   タナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビ
   ノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナ
   ーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラ
   ーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアー
   ゼのうちのいずれか一もしくは二以上の酵素を含有する
   ことを特徴とする酵素組成物。