JP5069576B2 - 高濃度のセロビオースを蓄積できる酵素組成物、及びそれを用いたセロオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Description
これらの製造方法では、セロビオース製造工程に混入するβ-グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、β−グルコシダーゼ以外の酵素成分の活性の制御については、記載も示唆もなく、これらの方法により、それらを制御することは困難である。また、これらの方法は、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となるため、プロセスが複雑となる問題があった。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
(2) 前記結晶セルロース分解活性(MCC−ase)が9.0U/mL以上である、(1)に記載の酵素組成物。
(3) 前記セルラーゼ生産菌が、Tricoderma属に属する菌株である、(1)又は(2)に記載の酵素組成物。
(4) 前記セルラーゼ生産菌が、Tricoderma reesei NBRC31329株及び/又はTricoderma reesei NBRC31329株から変異させて得られる変異株である、(1)から(3)の何れかに記載の酵素組成物。
(5) 前記セルラーゼ生産菌が、Trichoderma reesei AKC−015株(受託番号FERM BP−10839)である、(1)から(3)の何れかに記載の酵素組成物。
(6) セルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性(CMC−ase)と結晶セルロース分解活性(MCC−ase)との活性比(CMC−ase/MCC−ase)が8.0以下であり、β−グルコシダーゼ活性(β−Glucosidase)と結晶セルロース分解活性(MCC−ase)との活性比(β−Glucosidase/MCC−ase)が0.016以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することを含む、(1)から(5)の何れかに記載の酵素組成物の製造方法。
(7) (1)から(5)の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
本発明のCMC−aseは、水溶性セルロースを分解するセルラーゼ活性のことであり、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を分解する酵素活性(U/mL)として測定される。このCMC−ase活性は、セルロース系物質を酵素分解する際に、非晶質の分解が促進する。このため、本発明のセルラーゼは、この活性を有することが必要である。好ましい範囲としては、0.001U/mL以上である。
上述のCMC−ase、MCC−ase及びβ−グルコシダーゼにおける、それぞれの活性の絶対値は、後述する培養方法において、培養液の上澄み1mL中に含まれる活性量のことを差す。ただし、本発明でいう酵素活性比は、上述の培養液の上澄みに限らず、培養液を濃縮・分離・乾燥等の加工を施したものを用いて測定してもよい。
(1)CMC−ase活性
20mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に溶解した1%カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を480μl用意する。これに適当に希釈した酵素液20μlを加え、40℃で30分間反応させる。95℃、15分間加熱して反応を停止させた後、3,5−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
50mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に懸濁した1.25質量%の結晶性セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名:セオラスPH−101を水分60%として、三英製作所製、商品名:万能攪拌混合機でフック羽根により、90分間、126rpmで混練攪拌したもの)の基質液0.4mlに適当に希釈した酵素液を0.1ml添加し、40℃で30分間反応後、95℃で15分間加熱して反応を停止させた後、3,5−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
200mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に溶解した2.0質量%のセロビオース(Aldrich製:特級グレード)の基質液0.3mlに酵素液0.3mlを添加し、40℃で30分間反応後、95℃で15分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット(グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製)を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。1分間に1μmolのグルコースを遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
本発明で使用されるセルラーゼ生産菌は、酵素を分泌し、その酵素がセルロース系物質を分解するものであれば、その菌種は特に限定されない。セルラーゼの起源は、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物として以下のものがある。トリコデルマ(Tricoderma)属、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pse−udomonas)属、ペニシリウム(Penicillium)属、アエロモナス(Aeromonus)属、イルペックス(Irpex)属、スポロトリクム(Sporotrichum)属、フミコーラ(Humicola)属等の「セルラーゼ」(講談社サイエンティフィック発行(1987))、「セルロースの事典」(朝倉書店発行(2000))に記載される菌が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の菌由来の酵素に限らず、新規の菌由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
Trichoderma reesei GL−1株またはAKC−015株を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で28℃、3〜10日間培養する。生成した胞子を生理的食塩水に100,000〜100,000,000 個/mlになるよう懸濁し、EMS(ethyl methane sulfonate)で変異処理を施す(100〜500μg/ml、pH7.0、28℃、5〜24時間)。セロオリゴ糖生産性の高いセルラーゼを分泌する菌株の選択は、この変異誘発処理胞子の懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、グルコースなどを炭素源として培養し、培養物の酵素活性を公知の方法で測定することで達成される。例えば、各変異処理菌株の培養物を用いて、セロビオースまたは結晶セルロースを基質として酵素分解し、生成した還元糖を定量してもよく、公知の発色基質を使用し培養物と酵素反応させることで定性的に目的の菌株を選択してもよい。
培養には通常の通気撹拌培養装置あるいは固体培養装置が用いられ、前記培地を使用して、温度20〜40℃で培養すれば、3〜10日間でセルラーゼ活性は最高となる。次いで、培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上澄液を得る。この上澄液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
本発明でいうTricoderma reeesei NBRC31329株、GL−1株、AKC−015株、またはそれらの変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、緩衝液中で、温度50〜70℃、pH3.0〜8.0の範囲で行うことが好ましい。
但し、上述の酵素分解方法において、反応系内のセルロース系物質の濃度を高濃度にすることは、セロビオース蓄積をより高める上で重要である。好ましいセルロース系物質濃度は、反応液中に2質量%以上であり、より好ましくは5質量%以上であり、さらに好ましくは7.5質量%以上である。この濃度は高いほど、セロビオースの蓄積濃度を高められるため、上限は特に設定されないが、通常の反応系で、均一攪拌が得られる範囲としては、30質量%以下が好ましい。上述のセルロース系物質の濃度は、バッチ式反応においては、仕込み時の濃度として設定してもよく、連続式の反応系では、分解に伴い減少したセルロース分を、適宜、添加(追加)して反応系内のセルロース系物質濃度を高めてもよい。
Tricoderma reesei AKC−015株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製):0.5g、KH2PO4:0.20g、(NH4)2SO4:0.15g、MgSO4・7H2O:0.030g、CaCl2・2H2O:0.030g、アデカノールLG109:0.10mL、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.10mlに水を加え全量を99.0gに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、300ml容三角フラスコに導入し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101)1.0gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
実施例1から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を4.0%、綿実粕濃度を2.0%に変更し、それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表1に示す。(pH=3.0)
〔実施例3〕
実施例1から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を2.0%、綿実粕濃度を1.0%に変更し、28℃、0.6vvmで、500rpmで攪拌(水を用いたKLaの測定結果は230)それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表1に示す。(pH=3.14)
Tricoderma reesei GL−1株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製):0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03ml、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101)0.3gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
培養後は、実施例1と同様に、各種活性を測定した。結果を表1に示す。
Tricoderma reesei由来の市販酵素「スミチームCS:粉末グレード(新日本化学製)」を用いて、10%濃度で水に懸濁し、それを用いて、各酵素活性を測定した。結果を表1に示す。
実施例1〜4、比較例1〜3で得られた酵素液を用いて、実際に、セルロース系物質として前処理した結晶セルロースを分解し、生成した糖をHPLCで定量する方法で、セロビオースの蓄積濃度を測定した。
市販の結晶セルロース「セオラスPH−101(旭化成ケミカルズ製)」を7.5質量%濃度で水に懸濁し、市販のビーズミルを用いて、湿式で微粉砕した。粉砕装置は、アシザワファインテック製ビーズミル「スターミル2L容」を用いて、ビーズ径φ0.5mmのジルコニアビーズを、80容積%充填し、所定時間循環することで、平均径(D50)で4μm以下に微粉砕した。
上記で得られた微粉砕セルローススラリー、及び各実施例、比較例で得られた上澄液を、100mL容の三角フラスコに全量25gとなるように導入し、酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で希釈し、スターラー攪拌しながら、55℃の水浴中で4時間反応した。4時間反応後は、反応を停止し、遠心分離により得られた上澄み液を、HPLCで測定し、セロビオース濃度を測定した。結果を表1に示す。ここでセルロース濃度は、5質量%、反応液1mL当たりのMCC−aseが4Uになるように、各実施例及び比較例で得た培養液を添加した。
セルロース系物質として、市販の結晶セルロース「セオラスPH−101(旭化成ケミカルズ製)」を、15%濃度の水酸化ナトリウム水溶液中で、10質量%濃度で懸濁し、30分間攪拌した。攪拌後、遠心式ろ過装置(1μm)で、固形分を回収し、水洗した後、10質量%で水懸濁液を作成し、酢酸水溶液で中和した。中和後、上述と同様にろ過し、基質を調製した(水分66.3%)。
実施例3と同様の操作で、基質を調製し、セルロース系物質濃度を15質量%にする以外は、実施例3と同様の操作で酵素反応を行った。結果より、セロビオース蓄積濃度は、3.66%であった。
Claims (6)
- セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性(CMC−ase)と結晶セルロース分解活性(MCC−ase)との活性比(CMC−ase/MCC−ase)が8.0以下であり、β−グルコシダーゼ活性(β−Glucosidase)と結晶セルロース分解活性(MCC−ase)との活性比(β−Glucosidase/MCC−ase)が0.016以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
- 前記結晶セルロース分解活性(MCC−ase)が9.0U/mL以上である、請求項1に記載の酵素組成物。
- 前記セルラーゼ生産菌が、トリコデルマ(Tricoderma)属に属する菌株である、請求項1又は2に記載の酵素組成物。
- 前記セルラーゼ生産菌が、トリコデルマ リーセイ(Tricoderma reesei) NBRC31329株及び/又はトリコデルマ リーセイ(Tricoderma reesei) NBRC31329株から変異させて得られる変異株である、請求項1から3の何れかに記載の酵素組成物。
- 前記セルラーゼ生産菌が、トリコデルマ リーセイ(Tricoderma reesei) AKC−015株(受託番号FERM BP−10839)である、請求項1から3の何れかに記載の酵素組成物。
- 請求項1から5の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
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