JP4689807B2 - 新規なβ−グルコシダーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なβ−グルコシダーゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来する新規なβ−グルコシダーゼ、及びそれを含有する酵素組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは、高等植物細胞の主要な構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、グルコースがβ−1,４−グルコシド結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状、あるいは非結晶状態で存在しており、さらには他の成分、例えばリグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などとも複雑に結合して植物組織を構築している。
【０００３】
セルラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖、セロビオース、最終的にはグルコースにまで分解する反応を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどに大別される。それらの作用様式を詳細に比較すると、種々の作用様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロースを分解するものと考えられている。
【０００４】
β−グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体からグルコースを遊離させる反応を触媒すると考えられ、セルロースの糖化系の最終段階及び配糖体からのグルコースの遊離において重要な酵素である。
【０００５】
β−グルコシダーゼの各分野への応用例として、飼料分野としては、飼料に添加することにより家畜の増体及び／又は飼料効率を改善できる。また、サイレージ用酵素剤として、牧草のサイロへの詰め込みの際に添加し、その発酵品質を改善せしめて良質なサイレージを調製する目的で、各種のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼをそれぞれ単剤もしくは合剤で含む製剤、さらに、それら酵素の効果を高めることを目的として、これら酵素と乳酸菌との合剤が既に市販されている。
しかし、さらにβ−グルコシダーゼを強化することにより、セルロースの糖化効率が向上し、より良質なサイレージを調製することができる。
また、食品分野としては、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去、醸造、製パンにおける発酵歩合の向上などに利用できる。医薬分野としては、臨床検査用試薬に利用される。その他の分野としては、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、セルロース製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
【０００６】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus)の生産する酵素に関して言えば、セルラーゼは糖化力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレージ用途での有効性が報告されている（特開平４−１１７２４４号公報、特開平７−２３６４３１号公報）。また、含有されているセルラーゼ成分についても報告されている（Agric. Biol. Chem., 52, 2493〜2501（1988）、同誌53, 3359〜3360（1989）、同誌54, 309 〜317 （1990））。
さらに、β−グルコシダーゼに関しては、従来よく知られている、例えばトリコデルマ・レーゼイ（Tricoderma reesei)等のセルラーゼに比べて著しく活性が高いことなどが報告されている（特公昭６０−４３９５４号公報）。
しかし、β−グルコシダーゼの精製は不十分であり、従って酵素の諸性質については詳細な検討はされておらず、産業上有効利用することができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
β−グルコシダーゼを産業上有効利用するためには、該酵素を単離、精製し、酵素的、物理的性質を明らかにすることが不可欠である。すなわち、本発明は、新規なβ−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼを含有してなる酵素組成物、及びこの酵素組成物による植物又は植物由来物の加工及び／又は利用効率を向上させる方法の提供を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。その結果、これら酵素群の中から３種の新規β−グルコシダーゼを見出した。
さらに、種々の植物もしくは植物由来物に対するβ−グルコシダーゼの作用効果を検討し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
請求項１記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ１である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）を基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．８であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．４〜８．４の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．４〜５．９の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ４．８、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１１】
請求項２記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ２である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．５であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ４．０〜８．７の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ４．０〜６．２の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ４．５、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９６，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１２】
請求項３記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ３である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは５．１であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．０〜７．２の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．５〜６．５の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ５．１、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．１（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：７７，５００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１３】
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含有して成る酵素組成物である。
請求項５記載の本発明は、酵素組成物が、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるためのものである請求項４記載の酵素組成物である。
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５記載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは二以上の酵素を含有することを特徴とする酵素組成物である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ系を生産する微生物としては、アクレモニウム属の糸状菌があり、具体的にはアクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５）などがある。これらの微生物によるβ−グルコシダーゼの製造については、既知の方法、例えば特公昭６０−４３９５４号公報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に従って行えば良く、上記微生物の培養物からβ−グルコシダーゼを採取できる。
上記微生物の培養終了後、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とするか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
【００１５】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて、部分精製又は高度に精製して用いることができる。
精製方法としては、常法、即ち硫酸アンモニウムなどによる塩析法；アルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明に係る酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す酵素、すなわちβ−Ｄ−Glucoside glucohydrolase EC3.2.1.21であり、具体的にはセロオリゴ糖、セロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する酵素を意味する。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、アクレモニウム属糸状菌由来の、前記に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す新規酵素が提供される。
本発明の第二の態様によれば、上記β−グルコシダーゼ活性を示す酵素は、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ１、β−グルコシダーゼ２、及びβ−グルコシダーゼ３の３種類が存在し、これらはそれぞれ前記請求項１、２及び３に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す。
【００１８】
さらに、本発明の別の態様によれば、上記の本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を含んでなる酵素組成物が提供される。この酵素組成物は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を、酵素組成物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等と共に混合し、製造することができる。
また、本発明の酵素組成物は、所望により、適当な形状、例えば粉末又は液体状等に適宜調製することができる。
【００１９】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、グルコース遊離能に優れており、セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含有する植物又は植物由来物の加工や利用性向上に適している。すなわち、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することにより、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させることができる。
すなわち、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することを特徴とする、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物が得られる。
さらに、この酵素組成物を用いて、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工した酵素処理物を得ることができる。
【００２０】
上記の植物としては、全ての植物、又はその切断物等に適用でき、植物由来物としては、細胞壁、表皮組織等の植物組織、植物組織由来物、細胞内容物、種々の糖タンパクや糖脂質、芳香成分や色素等といった抽出成分など全ての植物由来物に適用できる。
具体的には、飼料分野、食品分野では、牧草、野菜、果実等が対象となり、これらを加工した果汁、ピューレ、ペースト、絞り粕、抽出粕にも適用することができる。また、本発明のβ−グルコシダーゼは、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、紙等セルロースを含有する製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
【００２１】
上記のアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体としては、広く植物界に分布する種々のフェノール配糖体、ニトリル配糖体、クマリン配糖体、アントラセン配糖体、ステロイド配糖体（サポニン物質）、テルペン配糖体、苦味配糖体、フラボン配糖体、イソフラボン配糖体、フラボノール配糖体、フラバノン配糖体、ペラルゴニジン配糖体、シアニジン配糖体、デルフィニジン配糖体、トリテルペノイド配糖体、強心配糖体等が挙げられる。
【００２２】
さらに本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物に、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロン酸リアーゼのいずれか一もしくは二以上の成分を含有させてなる酵素組成物が提供される。
この酵素組成物は、β−グルコシダーゼ酵素を単独で含んでなる酵素組成物に比べて、植物又は植物由来物の加工、利用効率をより一層向上させることが期待できる。
【００２３】
なお、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を、動物飼料中に配合して用いることにより、飼料中のβ−グルカンの消化能を改善することができる。あるいは、本酵素でβ−グルカンを分解することにより、飼料中に蓄積されているタンパク質の利用を促進させることができる。
従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含有する飼料添加物、さらには、この飼料添加物を飼料に添加する方法が提供される。この方法は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物により飼料成分を処理する工程を包含する。
【００２４】
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を、サイレージに添加することにより、有意にサイレージの発酵品質を改善できることが見出された。従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含むサイレージ用酵素剤が提供される。なお、このサイレージ用酵素剤は、必要に応じて、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、又はペディオコッカス属の乳酸菌等から成る製剤及び／又はプロピオニバクテリウム属等の酸生成菌から成る製剤と併用することができる。この場合には、相乗作用による一層の品質改善効果が期待できる。
【００２５】
さらに本発明によれば、上記のサイレージ用酵素剤を用いてサイレージを製造する方法、及びこの方法により製造することを特徴とするサイレージが提供される。ここで、サイレージ原料としては、通常のサイレージに用いられる牧草、飼料作物、食品等の製造副産物、農業副産物、飼料等の全てが対象となる。
牧草としては、例えばイネ科牧草としては、チモシー、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、メドウフェスク、ギニアグラス等を用いることができ、マメ科牧草としては、アルファルファ、クローバ等を用いることができる。
次に、飼料作物としては、トウモロコシ、ソルガム、大麦、ライムギ、ライコムギ等を用いることができる。また、製造副産物としては、廃糖蜜、酢粕、ビール粕、トウフ粕、ミカン粕、焼酎粕等を用いることができる。さらに、農業副産物としては、麦藁、ビートトップ、ビートパルプ等を用いることができる。
また、サイレージ原料としての飼料は、通常、発酵飼料に使用される単味飼料及び配合飼料や濃厚飼料、これら飼料と粗飼料とを混合した混合飼料等を用いることができる。
【００２６】
本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を食品の加工に用いることにより、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去などの他、醸造や製パン等における発酵歩合の向上などの効果が得られる。
従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含む食品加工用酵素剤が提供される。さらには、この食品加工用酵素剤を用いて食品を加工する方法、及びこの方法によって製造されることを特徴とする食品が提供される。
【００２７】
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物はβ−Ｄ−グルコシドを加水分解する活性が高いため、アミラーゼ活性測定用の臨床検査用試薬に利用することが可能である。
【００２８】
本酵素並びに酵素組成物の使用方法としては、上記の各種利用分野で通常採用されるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ３〜６．５、温度１０〜８０℃の範囲で用いることが適当である。酵素使用量については、時間と共にそれぞれの目的が達成されるような条件で使用すれば、十分な効果を得ることができる。
【００２９】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１ β−グルコシダーゼの精製
（１）酵素原末の調製
アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ原末を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、すべて以下の組成からなる培地を常法により加熱滅菌したものを用いた。
【００３１】
〔培地組成〕
綿実油粕２％、セルロース２％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１％、硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）。
【００３２】
上記培地５００ｍＬに、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を接種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして、培地を１５Ｌにスケールアップし、さらにスケールアップを続けて最終的に６００Ｌ容タンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。
【００３３】
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたβ−グルコシダーゼ原末は５．０ｋｇであった。
【００３４】
（２）β−グルコシダーゼの精製
上記（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法で精製した。
【００３５】
（ａ）強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー（株）製）に上清を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させた後、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．０４Ｍ、０．１５Ｍ、０．５Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、０Ｍ、０．１５Ｍで溶出されるβ−グルコシダーゼ活性画分（ＦＩ、ＦIII 画分）を分取した。
【００３６】
（ｂ）弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー（株）製）に上記（ａ）で分取したＦＩ画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．２Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行ってβ−グルコシダーゼ活性を示した画分（ＰIII 、ＰIV画分）を分取した。
【００３７】
（ｃ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得た分取ＰIII 画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００３８】
（ｄ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得た分取ＰIV画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００３９】
（ｅ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ａ）で得た分取ＦIII 画分を０．７Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．７Ｍ、０．５Ｍ、０．４Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００４０】
（ｆ）強塩基性イオン交換クロマトグラフィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に上記（ｃ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍから０．２Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ１）を分取した。
【００４１】
（ｇ）疎水クロマトグラフィー：Ａｌｋｙｌ−Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ ＨＲ５／５（ファルマシアバイオテク社製）に上記（ｄ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4 １．０Ｍから０Ｍを含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ２）を分取した。
【００４２】
（ｈ）ゲル濾過クロマトグラフィー：バイオゲルP-100 (Bio-Rad社製）に上記（ｅ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．０）で通過させ、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００４３】
（ｉ）強塩基性イオン交換クロマトグラフィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に上記（ｈ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍから０．１５Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ３）を分取した。
【００４４】
実施例２ β−グルコシダーゼの酵素的、タンパク質的諸性質
（１）基質特異性、作用特性
実施例１で得た精製β−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の各種基質に対する活性を調べた。その結果、ｐＮＰＧを基質としたときの分解活性は順に、３１．２、２３．１及び１０．２単位／ｍｇタンパク質であり、セロビオースを基質としたときの分解活性は順に、１９．５、１７．８及び９．０単位／ｍｇタンパク質であった。このことから、これら３種のβ−グルコシダーゼのセロビオース加水分解能は、ｐＮＰＧ加水分解能よりも低いことがわかった。
【００４５】
ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の定義については以下の通りである。
・ｐＮＰＧ分解活性
ｐＨ５．０、３０℃で、０．８５ｍＭ ｐＮＰＧ溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位と定義した。
【００４６】
・セロビオース分解活性
ｐＨ５．０、３０℃で、１．０ｍＭ セロビオース溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１単位と定義した。
【００４７】
（２）至適ｐＨ、ｐＨ安定性
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の３０℃における至適ｐＨを図１に示す。これら酵素は、McIlvain緩衝液で、順にｐＨ４．８、ｐＨ４．５、ｐＨ５．１のときに最大の活性を示した。また、これら酵素の４℃、２４時間におけるｐＨ安定性を図２（Ａ）に示し、４５℃、４時間におけるｐＨ安定性を図２（Ｂ）に示した。なお、図１中の○、△、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。また、図２（Ａ）、（Ｂ）中の○、△、□はβ−グルコシダーゼ１、２、３（McIlvain緩衝液）を示し、●、▲、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３（Britton-Robinson緩衝液）を示す。
【００４８】
（３）至適温度、温度安定性
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の作用最適温度を調べるため、ｐＮＰＧ分解活性を測定したところ、図３に示すように、至適温度は共に５５℃（各至適ｐＨ）であった。次に、これら酵素の温度安定性を各至適ｐＨ、１０分の条件下で測定したところ、図４に示したように、いずれも５０℃以下で安定であった。なお、図３、４中の○、△、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。
【００４９】
（４）分子量
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ゲル）を行った。
その結果、β−グルコシダーゼ１の分子量は約９２，０００、β−グルコシダーゼ２の分子量は約９６，０００、β−グルコシダーゼ3 の分子量は約７７，５００と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの分子量は、以下の通りである。
【００５０】
【表１】
第 １ 表
【００５１】
（５）等電点
実施例１で得られたβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の等電点（ｐＩ）を決定するために、ＬＫＢ両性等電点電気泳動装置を用いてポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動を行った。
その結果、β−グルコシダーゼ１の等電点は４．３、β−グルコシダーゼ２の等電点は４．７、β−グルコシダーゼ３の等電点は４．１と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの等電点は以下の通りである。
【００５２】
【表２】
第 ２ 表
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、糸状菌アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ並びに当該β−グルコシダーゼを含有する酵素組成物が提供される。この酵素又は酵素組成物は、セルロースやセロオリゴ糖及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物や該植物由来物を加工し、利用するのに適しており、食品分野、飼料分野、医薬分野などにおける広範な利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの３０℃における至適ｐＨを示す図である。
【図２】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼのｐＨ安定性を示す図であり、（Ａ）は４℃、２４時間の、（Ｂ）は４５℃、4 時間の結果である。
【図３】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの至適温度を示す図である。
【図４】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なβ−グルコシダーゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来する新規なβ−グルコシダーゼ、及びそれを含有する酵素組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは、高等植物細胞の主要な構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、グルコースがβ−1,４−グルコシド結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状、あるいは非結晶状態で存在しており、さらには他の成分、例えばリグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などとも複雑に結合して植物組織を構築している。
【０００３】
セルラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖、セロビオース、最終的にはグルコースにまで分解する反応を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどに大別される。それらの作用様式を詳細に比較すると、種々の作用様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロースを分解するものと考えられている。
【０００４】
β−グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体からグルコースを遊離させる反応を触媒すると考えられ、セルロースの糖化系の最終段階及び配糖体からのグルコースの遊離において重要な酵素である。
【０００５】
β−グルコシダーゼの各分野への応用例として、飼料分野としては、飼料に添加することにより家畜の増体及び／又は飼料効率を改善できる。また、サイレージ用酵素剤として、牧草のサイロへの詰め込みの際に添加し、その発酵品質を改善せしめて良質なサイレージを調製する目的で、各種のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼをそれぞれ単剤もしくは合剤で含む製剤、さらに、それら酵素の効果を高めることを目的として、これら酵素と乳酸菌との合剤が既に市販されている。
しかし、さらにβ−グルコシダーゼを強化することにより、セルロースの糖化効率が向上し、より良質なサイレージを調製することができる。
また、食品分野としては、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去、醸造、製パンにおける発酵歩合の向上などに利用できる。医薬分野としては、臨床検査用試薬に利用される。その他の分野としては、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、セルロース製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
【０００６】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus)の生産する酵素に関して言えば、セルラーゼは糖化力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレージ用途での有効性が報告されている（特開平４−１１７２４４号公報、特開平７−２３６４３１号公報）。また、含有されているセルラーゼ成分についても報告されている（Agric. Biol. Chem., 52, 2493〜2501（1988）、同誌53, 3359〜3360（1989）、同誌54, 309 〜317 （1990））。
さらに、β−グルコシダーゼに関しては、従来よく知られている、例えばトリコデルマ・レーゼイ（Tricoderma reesei)等のセルラーゼに比べて著しく活性が高いことなどが報告されている（特公昭６０−４３９５４号公報）。
しかし、β−グルコシダーゼの精製は不十分であり、従って酵素の諸性質については詳細な検討はされておらず、産業上有効利用することができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
β−グルコシダーゼを産業上有効利用するためには、該酵素を単離、精製し、酵素的、物理的性質を明らかにすることが不可欠である。すなわち、本発明は、新規なβ−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼを含有してなる酵素組成物、及びこの酵素組成物による植物又は植物由来物の加工及び／又は利用効率を向上させる方法の提供を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。その結果、これら酵素群の中から３種の新規β−グルコシダーゼを見出した。
さらに、種々の植物もしくは植物由来物に対するβ−グルコシダーゼの作用効果を検討し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
請求項１記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ１である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）を基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．８であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．４〜８．４の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．４〜５．９の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ４．８、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１１】
請求項２記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ２である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．５であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ４．０〜８．７の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ４．０〜６．２の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ４．５、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９６，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１２】
請求項３記載の本発明は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ３である。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは５．１であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．０〜７．２の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．５〜６．５の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ５．１、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．１（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：７７，５００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
【００１３】
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含有して成る酵素組成物である。
請求項５記載の本発明は、酵素組成物が、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるためのものである請求項４記載の酵素組成物である。
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５記載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは二以上の酵素を含有することを特徴とする酵素組成物である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ系を生産する微生物としては、アクレモニウム属の糸状菌があり、具体的にはアクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５）などがある。これらの微生物によるβ−グルコシダーゼの製造については、既知の方法、例えば特公昭６０−４３９５４号公報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に従って行えば良く、上記微生物の培養物からβ−グルコシダーゼを採取できる。
上記微生物の培養終了後、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とするか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
【００１５】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて、部分精製又は高度に精製して用いることができる。
精製方法としては、常法、即ち硫酸アンモニウムなどによる塩析法；アルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明に係る酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す酵素、すなわちβ−Ｄ−Glucoside glucohydrolase EC3.2.1.21であり、具体的にはセロオリゴ糖、セロビオース、又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する酵素を意味する。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、アクレモニウム属糸状菌由来の、前記に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す新規酵素が提供される。
本発明の第二の態様によれば、上記β−グルコシダーゼ活性を示す酵素は、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ１、β−グルコシダーゼ２、及びβ−グルコシダーゼ３の３種類が存在し、これらはそれぞれ前記請求項１、２及び３に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す。
【００１８】
さらに、本発明の別の態様によれば、上記の本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を含んでなる酵素組成物が提供される。この酵素組成物は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を、酵素組成物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等と共に混合し、製造することができる。
また、本発明の酵素組成物は、所望により、適当な形状、例えば粉末又は液体状等に適宜調製することができる。
【００１９】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、グルコース遊離能に優れており、セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含有する植物又は植物由来物の加工や利用性向上に適している。すなわち、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することにより、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させることができる。
すなわち、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することを特徴とする、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物が得られる。
さらに、この酵素組成物を用いて、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工した酵素処理物を得ることができる。
【００２０】
上記の植物としては、全ての植物、又はその切断物等に適用でき、植物由来物としては、細胞壁、表皮組織等の植物組織、植物組織由来物、細胞内容物、種々の糖タンパクや糖脂質、芳香成分や色素等といった抽出成分など全ての植物由来物に適用できる。
具体的には、飼料分野、食品分野では、牧草、野菜、果実等が対象となり、これらを加工した果汁、ピューレ、ペースト、絞り粕、抽出粕にも適用することができる。また、本発明のβ−グルコシダーゼは、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、紙等セルロースを含有する製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
【００２１】
上記のアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体としては、広く植物界に分布する種々のフェノール配糖体、ニトリル配糖体、クマリン配糖体、アントラセン配糖体、ステロイド配糖体（サポニン物質）、テルペン配糖体、苦味配糖体、フラボン配糖体、イソフラボン配糖体、フラボノール配糖体、フラバノン配糖体、ペラルゴニジン配糖体、シアニジン配糖体、デルフィニジン配糖体、トリテルペノイド配糖体、強心配糖体等が挙げられる。
【００２２】
さらに本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物に、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロン酸リアーゼのいずれか一もしくは二以上の成分を含有させてなる酵素組成物が提供される。
この酵素組成物は、β−グルコシダーゼ酵素を単独で含んでなる酵素組成物に比べて、植物又は植物由来物の加工、利用効率をより一層向上させることが期待できる。
【００２３】
なお、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を、動物飼料中に配合して用いることにより、飼料中のβ−グルカンの消化能を改善することができる。あるいは、本酵素でβ−グルカンを分解することにより、飼料中に蓄積されているタンパク質の利用を促進させることができる。
従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含有する飼料添加物、さらには、この飼料添加物を飼料に添加する方法が提供される。この方法は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物により飼料成分を処理する工程を包含する。
【００２４】
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を、サイレージに添加することにより、有意にサイレージの発酵品質を改善できることが見出された。従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含むサイレージ用酵素剤が提供される。なお、このサイレージ用酵素剤は、必要に応じて、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、又はペディオコッカス属の乳酸菌等から成る製剤及び／又はプロピオニバクテリウム属等の酸生成菌から成る製剤と併用することができる。この場合には、相乗作用による一層の品質改善効果が期待できる。
【００２５】
さらに本発明によれば、上記のサイレージ用酵素剤を用いてサイレージを製造する方法、及びこの方法により製造することを特徴とするサイレージが提供される。ここで、サイレージ原料としては、通常のサイレージに用いられる牧草、飼料作物、食品等の製造副産物、農業副産物、飼料等の全てが対象となる。
牧草としては、例えばイネ科牧草としては、チモシー、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、メドウフェスク、ギニアグラス等を用いることができ、マメ科牧草としては、アルファルファ、クローバ等を用いることができる。
次に、飼料作物としては、トウモロコシ、ソルガム、大麦、ライムギ、ライコムギ等を用いることができる。また、製造副産物としては、廃糖蜜、酢粕、ビール粕、トウフ粕、ミカン粕、焼酎粕等を用いることができる。さらに、農業副産物としては、麦藁、ビートトップ、ビートパルプ等を用いることができる。
また、サイレージ原料としての飼料は、通常、発酵飼料に使用される単味飼料及び配合飼料や濃厚飼料、これら飼料と粗飼料とを混合した混合飼料等を用いることができる。
【００２６】
本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を食品の加工に用いることにより、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去などの他、醸造や製パン等における発酵歩合の向上などの効果が得られる。
従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物を含む食品加工用酵素剤が提供される。さらには、この食品加工用酵素剤を用いて食品を加工する方法、及びこの方法によって製造されることを特徴とする食品が提供される。
【００２７】
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素、又は酵素組成物はβ−Ｄ−グルコシドを加水分解する活性が高いため、アミラーゼ活性測定用の臨床検査用試薬に利用することが可能である。
【００２８】
本酵素並びに酵素組成物の使用方法としては、上記の各種利用分野で通常採用されるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ３〜６．５、温度１０〜８０℃の範囲で用いることが適当である。酵素使用量については、時間と共にそれぞれの目的が達成されるような条件で使用すれば、十分な効果を得ることができる。
【００２９】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１ β−グルコシダーゼの精製
（１）酵素原末の調製
アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ原末を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、すべて以下の組成からなる培地を常法により加熱滅菌したものを用いた。
【００３１】
〔培地組成〕
綿実油粕２％、セルロース２％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１％、硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）。
【００３２】
上記培地５００ｍＬに、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を接種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして、培地を１５Ｌにスケールアップし、さらにスケールアップを続けて最終的に６００Ｌ容タンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。
【００３３】
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたβ−グルコシダーゼ原末は５．０ｋｇであった。
【００３４】
（２）β−グルコシダーゼの精製
上記（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法で精製した。
【００３５】
（ａ）強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー（株）製）に上清を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させた後、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．０４Ｍ、０．１５Ｍ、０．５Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、０Ｍ、０．１５Ｍで溶出されるβ−グルコシダーゼ活性画分（ＦＩ、ＦIII 画分）を分取した。
【００３６】
（ｂ）弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー（株）製）に上記（ａ）で分取したＦＩ画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．２Ｍ含有せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行ってβ−グルコシダーゼ活性を示した画分（ＰIII 、ＰIV画分）を分取した。
【００３７】
（ｃ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得た分取ＰIII 画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００３８】
（ｄ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得た分取ＰIV画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．５Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００３９】
（ｅ）疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ａ）で得た分取ＦIII 画分を０．７Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4の濃度が０．７Ｍ、０．５Ｍ、０．４Ｍ、０Ｍとなるように溶解せしめたものを用い、ステップワイズ溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００４０】
（ｆ）強塩基性イオン交換クロマトグラフィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に上記（ｃ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍから０．２Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ１）を分取した。
【００４１】
（ｇ）疎水クロマトグラフィー：Ａｌｋｙｌ−Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ ＨＲ５／５（ファルマシアバイオテク社製）に上記（ｄ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を０．５Ｍ （ＮＨ4)2ＳＯ4を含む酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）中に（ＮＨ4)2ＳＯ4 １．０Ｍから０Ｍを含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ２）を分取した。
【００４２】
（ｈ）ゲル濾過クロマトグラフィー：バイオゲルP-100 (Bio-Rad社製）に上記（ｅ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５．０）で通過させ、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００４３】
（ｉ）強塩基性イオン交換クロマトグラフィー：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に上記（ｈ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）で吸着させ、酢酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ６．０）中にＮａＣｌを各０Ｍから０．１５Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼ３）を分取した。
【００４４】
実施例２ β−グルコシダーゼの酵素的、タンパク質的諸性質
（１）基質特異性、作用特性
実施例１で得た精製β−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の各種基質に対する活性を調べた。その結果、ｐＮＰＧを基質としたときの分解活性は順に、３１．２、２３．１及び１０．２単位／ｍｇタンパク質であり、セロビオースを基質としたときの分解活性は順に、１９．５、１７．８及び９．０単位／ｍｇタンパク質であった。このことから、これら３種のβ−グルコシダーゼのセロビオース加水分解能は、ｐＮＰＧ加水分解能よりも低いことがわかった。
【００４５】
ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の定義については以下の通りである。
・ｐＮＰＧ分解活性
ｐＨ５．０、３０℃で、０．８５ｍＭ ｐＮＰＧ溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位と定義した。
【００４６】
・セロビオース分解活性
ｐＨ５．０、３０℃で、１．０ｍＭ セロビオース溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１単位と定義した。
【００４７】
（２）至適ｐＨ、ｐＨ安定性
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の３０℃における至適ｐＨを図１に示す。これら酵素は、McIlvain緩衝液で、順にｐＨ４．８、ｐＨ４．５、ｐＨ５．１のときに最大の活性を示した。また、これら酵素の４℃、２４時間におけるｐＨ安定性を図２（Ａ）に示し、４５℃、４時間におけるｐＨ安定性を図２（Ｂ）に示した。なお、図１中の○、△、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。また、図２（Ａ）、（Ｂ）中の○、△、□はβ−グルコシダーゼ１、２、３（McIlvain緩衝液）を示し、●、▲、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３（Britton-Robinson緩衝液）を示す。
【００４８】
（３）至適温度、温度安定性
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の作用最適温度を調べるため、ｐＮＰＧ分解活性を測定したところ、図３に示すように、至適温度は共に５５℃（各至適ｐＨ）であった。次に、これら酵素の温度安定性を各至適ｐＨ、１０分の条件下で測定したところ、図４に示したように、いずれも５０℃以下で安定であった。なお、図３、４中の○、△、◆はβ−グルコシダーゼ１、２、３をそれぞれ示す。
【００４９】
（４）分子量
実施例１で得たβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ゲル）を行った。
その結果、β−グルコシダーゼ１の分子量は約９２，０００、β−グルコシダーゼ２の分子量は約９６，０００、β−グルコシダーゼ3 の分子量は約７７，５００と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの分子量は、以下の通りである。
【００５０】
【表１】
第 １ 表
（５）等電点
実施例１で得られたβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ１、２、３）の等電点（ｐＩ）を決定するために、ＬＫＢ両性等電点電気泳動装置を用いてポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動を行った。
その結果、β−グルコシダーゼ１の等電点は４．３、β−グルコシダーゼ２の等電点は４．７、β−グルコシダーゼ３の等電点は４．１と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの等電点は以下の通りである。
【００５２】
【表２】
第 ２ 表
【発明の効果】
本発明により、糸状菌アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ並びに当該β−グルコシダーゼを含有する酵素組成物が提供される。この酵素又は酵素組成物は、セルロースやセロオリゴ糖及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物や該植物由来物を加工し、利用するのに適しており、食品分野、飼料分野、医薬分野などにおける広範な利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの３０℃における至適ｐＨを示す図である。
【図２】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼのｐＨ安定性を示す図であり、（Ａ）は４℃、２４時間の、（Ｂ）は４５℃、4 時間の結果である。
【図３】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの至適温度を示す図である。
【図４】 実施例１で得たβ−グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。
Claims (6)
- 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ１。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）を基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．８であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．４〜８．４の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．４〜５．９の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ４．８、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による） - 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ２。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは４．５であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ４．０〜８．７の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ４．０〜６．２の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ４．５、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：９６，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による） - 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来し、下記の性質を有するβ−グルコシダーゼ３。
（ａ）作用：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用する。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、至適ｐＨは５．１であり、４℃、２４時間処理においてはｐＨ３．０〜７．２の範囲で安定であり、４５℃、２時間処理においてはｐＨ３．５〜６．５の範囲で安定である。
（ｄ）作用最適温度：ｐＮＰＧを基質としたｐ−ニトロフェノール生成活性では、５５℃である。
（ｅ）温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ５．１、１０分間）。
（ｆ）等電点：ｐＩ４．１（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｇ）分子量：７７，５００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による） - 請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含有して成る酵素組成物。
- 酵素組成物が、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるためのものである請求項４記載の酵素組成物。
- 請求項４又は５記載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは二以上の酵素を含有することを特徴とする酵素組成物。
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