CN1408879A - 中性β—甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵和酶工程，提供一种中性β－甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖技术，通过在选定的培养基中接种Bacillus sp.M10种子液，在优化产酶条件下发酵得到粗酶液，再将该粗酶液用于酶解魔芋精粉，得到葡甘露低聚糖糖浆产品，本技术具有酶活力高，产酶稳定，酶解工艺简单、产品生理活性物质含量高和收率高等优点。
Description
本发明涉及微生物发酵和酶工程，属于功能性低聚糖酶法生产技术。低聚糖是指2至10个单糖基通过糖苷键连接而成的直链或分支链的一类糖的总称。近年来的研究发现葡甘露低聚糖(或称甘露寡糖)除具有双歧因子功能外，尚具有吸附、粘着和清除人和动物肠道病原菌，增强人和动物非特异性免疫具助剂活性，并有促进肝脏分泌甘露结合蛋白的独特生物学特性。应用于保健品作为疗效食品和食品添加剂、应用于饲料工业作为微生态促进剂替代抗生素的作用和应用于农业作为一种新型激素以调控植物的生长、发育、繁殖、防病和抗病。它的优异功能和应用开发前景引起了国内外学者对β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase；EC 3.2.1.78)和葡甘露低聚糖生产研究的兴趣。美国生产的β-甘露聚糖酶商品名为“和美酵素”已进入我国市场。功能性低聚糖的生产，日本起步较早，产量和品种位居世界前列。国内在该领域的研究报道有中国科学院微生物研究所以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BMG602产生的中性β-甘露聚糖酶，在适宜条件下酶活力为96IU/mL，云南大学进行了从土壤中筛选K3-14 β-甘露聚糖酶产生菌的分离筛选及产酶特性的研究。南开大学报导了由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)诱变选育的菌株NK-27产生的中性β-甘露聚糖酶，经纯化后纯酶降解1％魔芋精粉生产功能性葡甘露低聚糖。以嗜碱芽孢杆菌产生β-甘露聚糖酶的研究，中国科学院微生物研究所报导的用Alkalophilic Bacillus sp.N16-5发酵生产β-甘露聚糖酶，酶活力160U/mL，并用该酶降解魔芋精粉生产甘露寡糖的产业化报道。在这些研究中，或是存在酶活力不高、不稳定，或是工艺复杂、成本高，如用碱性β-甘露聚糖酶，酶解工艺在pH9～10的缓冲系统中进行，在碱性条件下加热葡甘露聚糖有可能变成不可逆凝胶，酶解产物需用酸中和，产物中盐分含量高，增加脱盐工艺的难度，同时影响产品的口感。
本发明之目的在于寻求一种工艺简单、成本低的以魔芋精粉生产葡甘露低聚糖的新技术。
本发明可通过以下方式得以实现：
在选定的培养基中接种Bacillus sp.M10种子液，在适宜产酶条件下发酵得到粗酶液，再将该粗酶液用于酶解魔芋精粉，反应一定时间后升温终止酶解反应，过滤弃沉淀，滤液经活性炭脱色后进行二次离子交换脱盐、脱色、过滤灭菌，得到葡甘露低聚糖糖浆产品，将糖浆喷雾干燥后得到葡甘露低聚糖粉状产品。
下面结合附图详细介绍本工艺：
发酵产酶培养基组成：魔芋精粉40.0g，酵母粉30.0g，Na2HPO4 4.0g，KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 10.0g，Na2CO3 3.5g，CaCl2 2.0g，MgCl2·6H2O0.6g，CoCl2·6H2O 0.01g，MnCl2·4H2O 1.0g，加H2O至1升。
产酶工艺：在产酶培养基中，加入2％培养18h的Bacillus sp.M10种子液，30～32℃，180r/min振荡培养48h，产酶达到高峰，发酵液离心或过滤，上清液或滤液即为粗酶液，DNS法测定酶活力，酶的最适反应温度和pH分别为50℃和6.0。Fe3+、Al3+、EDTA、Hg2+对酶有抑制作用，而Ba2+、Mn2+对酶有激活作用。粗酶液以60％饱和度(NH4)2SO4沉淀，4000xg冷冻离心20分钟，即得到粗酶沉淀，可在室温保存备用，粗酶泥经透析除盐后使用。
将上述得到的粗酶液根据测得的酶活力加水稀释，按照1克魔芋精粉加入150u酶量的比例(加入酶液与魔芋精粉的体积重量比为5比1)加入稀释后的酶液，使底物浓度为20％，在40-50℃，pH5.0-7.0条件下酶解2小时，升温至70-75℃15分钟以终止酶解反应，板框或硅藻土过滤并弃去沉淀，滤液经活性炭脱色，二次离子交换脱盐、脱色、过滤灭菌得到葡甘露低聚糖糖浆产品，将糖浆喷雾干燥后得到葡甘露低聚糖粉状产品。
20％底物浓度的酶解产物经精制后高压液相色谱层析显示组成糖份的相对含量为：单糖4.26％、二糖12.17％、三糖20.39％、四糖17.08％、五糖20.47％、六糖以上低聚糖15.63％、葡甘露聚糖10％，二～五糖含量达到70.11％。
葡甘露低聚糖浆以85℃、100℃、121℃分别处理6h、1h和15min，85℃加热处理6h处理液的还原糖量未发生变化，在100℃和121℃条件下，处理液的还原糖量减少2％，颜色无变化——无色透明，低聚糖未发生降解而仅有轻的氢化反应(醛基→醇基)，对酸碱稳定，常温下在pH1-12，放置7天后测定葡甘露低聚糖浆中还原糖量无变化。
本发明具有以下优点：
1、酶活力高、产酶稳定、发酵周期短，不易感染杂菌；
2、酶解工艺简单，酶解在中性反应系统中进行；
3、产品收率75％以上，产品中低聚糖相对含量80-90％，生理活性高，热和酸碱稳定性好；
4、工艺流程短，成本低。
实施例1
在两个1000ml的三角瓶中装入发酵培养基100ml，接种量为2％培养18～20h的种子液，30～32℃，180r/min振荡培养48h，DNS法测定酶活力分别为301.87u/mL、307.16u/mL。
实施例2
称取魔芋精粉20.0g，以150u/g酶量，加入稀释的粗酶液，使浓度为20.0％，pH6.0、40-50℃，间歇搅拌，酶解2h，升温终止酶解反应。酶解产物过滤，滤液经活性炭脱色，二次离子交换脱盐，可得产品15.0g，高压液相色谱层析结果表明：产品中组成糖份的相对含量为单糖4.26％、二糖12.17％、三糖20.39％、四糖17.08％、五糖20.47％、六糖以上低聚糖15.63％、葡甘露聚糖10％，二～五糖含量达到70.11％。。
Claims (5)
1、用中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖技术，其特征是：在选定的培养基中接种Bacillus sp.M10种子液，在适宜产酶条件下发酵得到粗酶液，再将该粗酶液用于酶解魔芋精粉，反应一定时间后升温以终止酶解反应，过滤弃沉淀，滤液经活性炭脱色后进行二次离子交换脱盐、脱色、过滤灭菌，得到葡甘露低聚糖糖浆产品，将糖浆喷雾干燥后得到葡甘露低聚糖粉状产品。
2、根据权利要求书1所述的中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖的技术，其特征是：发酵产酶培养基组成为：魔芋精粉40.0g，酵母粉30.0g，Na2HPO4 4.0g，KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 10.0g，Na2CO3 3.5g，CaCl2 2.0g，MgCl2·6H2O 0.6g，CoCl2·6H2O 0.01g，MnCl2·4H2O 1.0g，加H2O至1升。
3、根据权利要求1所述的中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖的技术，其特征是：发酵产酶条件为30～32℃、pH7.0-7.5、180r/min振荡培养48h。
4、根据权利要求3所述的中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖的技术，其特征是：酶的性质为最适反应温度和pH分别为50℃和6.0。Fe3+、Al3+、EDTA、Hg2+对酶有抑制作用，而Ba2+、Mn2+对酶有激活作用。
5、根据权利要求3所述的中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖的技术，其特征是：酶解条件为20％底物浓度、150u/g酶量、40-50℃、pH5.0-7.0、反应2小时。
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