JPS5917983A - アミラ−ゼｇ３の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖化
物に分解するアミラーゼの製造方法に関するものである
。

従来、アミラーゼとしては澱粉を、その非還元生木端か
らグルコース単位に分解するグルコアミラーゼ、マルト
ース単位に分解するβ−アミラーゼや澱粉をその内部組
から切断するα−アミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの工業的製造に便用さｎている。

そして最近は、より分子型の大きい、例えば、マルトト
リオース（０３人マルトテトラオース（Ｇやマルトペン
タオース（ＵＳ）、マルトヘキサオース（Ｇりなどのオ
リゴ糖製造技術の開発が要望されている。これらのオリ
ゴ糖は食品の増撤剤、賦形剤、包接剤など食品、医薬及
び工業製品に広く製造できるものと考えられているが、
末だ製法は確立されていないと云っても過昌°ではない
。

本発明者は、谷檀オリゴ糖の製法を開発することを目的
として、澱粉よりこれらオリゴ糖を特異的に生産するア
ミラーゼの探索を行ってきた結果バチルス属の微生物が
澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖化物に分解す
るアミラーゼを生産することを認めた。

軟扮からマル）　トＩＪ　、１−スを特異的に生成する
アミラーゼとしては、８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃａｓ　ｇｒ
ｉａｅｕａ　の生産するＮ−Ａ　４６８酵素（特公昭５
７−６９１５　、特開昭１１００４９　、澱粉化学、第
２３巻、第３号、第１７５〜１８１貞（１９７９））が
知られている。しかしこの酵素は、β−アミラーゼと同
様に澱粉をマルトトリあると報告されている。

しかるに、本発明の酵ふは分解生成糖がα−糖であるこ
とがらα−アミラーゼの一柚であり、澱粉を最終的には
法度反応が殆んど消失するまで、生としてマルトトリオ
ースを含む分解物に分解するアミラーゼであり、ボテｌ
扮抛化物の糖組成の一例は第１表に示す通りである。

第１衣 この他、酵素の最適温度、熱安廻性、ｐＨ安疋性、分子
輩なとの酵素的性質においても著しい差異が認められる
ものである。また、従来、知られている多くのα−アミ
ラーゼは澱粉分解物の−っとしてマルトトリオースを生
成するか、マルトトリオースのみを将兵的に大鼠生成す
るものではない。

本発つ」のアミラーゼは、第１表がら明らがなように、
マルトトリオースを６０９６以上の高収量で生産すると
いう、極めて特徴のあるアミラーゼであって、本光明者
はこの酵素をアミラーゼＧ３と１０名した。以下に本酵
素の酵素的性質を記載する。　アミラーゼＧ３の酵素的
性質 （１）作用；澱粉、アミロース、アミロペクチン、デキ
ストリン、グリコーゲ／などのグル力／をマルト）　Ｉ
Ｊオースを主成分とする分解物に分解する。生成糖はα
−型であって、不酵素はα−アミラーゼの一棟と考えら
れるものである。ｈｍ及びｌｌｋ化でん粉からのマルト
トリオースの収量は約５０〜約６５％である。

（２）　　作用温度範囲及び最遇作用温度；約７０シま
で作用し、最逸作用温反は約５０℃である（１９６澱粉
濃度、最適作用ｐＨで３０分間反応、第１図（ｂｌ　Ｊ （３１作用ｐＪＪｌ範囲及び最適作用ｐＨ；　ｐＨ約４
〜約１１の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６〜７、（第
１図ｔａｌ　Ｊ （４）熱安定１１；　０．０５　ｆｖｌ　トリス緩ｍ１
ｌｌ！Ｉ＜　ｐＨ７，０ン９の存在ドで加熱した場合、
５０′シ、１０分間の加熱で約７０％失活し、６０Ｃ１
１０分間の加熱で９０％以上失活する（第１図（Ｃ１の
白抜き丸） １５１　　ｐＨ女定性；　０．Ｉ　Ｍ緩衝液の下で、室
温（２５’Ｃ）で３時間放置後、残イＩ活沙をｍｌり定
した。その結果、ｐＨ約６〜約９の範囲で女ボであった
（第１図（ｄ）） ＋６１　　女足化；カルシウムイオンの存在下で熱安定
性の増加が認められた（Ｗ第１図ｔｃ］の黒丸１（１）
１１１１害剤：不酵素は５Ｘ１０−３ＭのＨｇＣ１２、
ＡｇＮ０３、Ｃｕ５Ｏ４、Ｚｎ５Ｏ４、Ｆｅ５０　＋の
存在下で、それぞれ約９８％、約８０％、約９７％、約
９５％、約６０％阻害された。

＋８１　　精製方法；本酵素は液体培養物の遠心上澄液
から、硫安分画、ＤｇＡＥ−セファロースカラムクロマ
トグラフィー（ＫＣＩ濃度Ｏ〜０，２Ｍでグラジェント
溶出）、次いでセファデックスＧ−１００カラムクロマ
トグラフイー及び同カラムによる再クロマトグラフィー
により、クロマト的及び電気泳動的にはゾ均一にまで精
製された。

（９）分子坩；セファデックスＧ−１００を用いるゲル
ｒ過法により測定された本酵素の分子量−は約２５００
０であった。

ｄｏｉ　　力価測定法；　０．Ｉ　Ｍ　ＩＪ　７酸緩衝
液に溶解させた１％ｉｉＪ溶性澱粉液（ｐＨ７，０）　
０．５−に通亙の酵素を加え、水で全Ｍ１ｒｎ１．とし
、４０゛Ｃで反応させる。この条件で１時間に１ｍｇの
グルコースに相当する還ノじ力を生成する酵素量を１単
位とした。

不酔糸を生産するｆｙｐｒ指、＋として、パシルス・Ｙ
Ｔ−１００４を挙げる。本命生物の菌学的１４Ｌ賀は下
記にノ」（ず辿りであり、１取工１ｔｌｌ菌肖第５８５
４　ｓ３として工業技術院畝生物工業技術研兇Ｊ９ｒに
奇ｉＬされている。

（１）　　形態；短桿菌、大きさ、１１１０．５〜０．
７１１Ｘ１．７〜２．４μ、単桿菌、非運動性、グラム
隘姓又はダラム　バリアプル （２）胞子；胞子、がｔ細胞のふくらみはあっても非常
に小さい、球形〜楕円形の胞子を形ｊ戊するｔ３＋　　
ゼラチン；　ゆ−ンくりｌ皮孔する。

（４）肉汁基天；生向良好、衣面スノ・−ス、黄色を化
・ひる。

（５）グルコース肉汁基天；肉汁寒天よりも生育不良、
淡黄色 （６）　　グルコース硝酸寒天；生育わずか（７）肉汁
：少し混濁、沈降する。

（８）良塩肉汁；食場の存在は生育を促進する。

１０％錠塩でも生育する。

（９）クエン酸球大−生向わずか け０）　チロシン寒天；生青艮好、黄色、チロシナーゼ
１勢注 Ｕυ　グルコース−アスパラギン寒天；生育わずかｕ７
Ｊ　　インドール；生成しない。

ｕＪミルク；ゆっくりと凝固、ペプトン化圓　ポテト；
生育わずか ｕ５１　　アセチルメチルカルビノール；生成する。

ｕｌｌｉｌＩ・、硫化水素；生成する。

Ｌ１７１　　（ＩＦｊ酸塩の還）し；１裟性ｑ８１　　
ウレアーゼ；生成しない。

（１９１カタラーゼ；生成する。

■）　澱粉の加水分解；陽性 （２１１炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−７ラク
トース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト−ろ、Ｄ−キノ
ロース、Ｌ−アラヒノース、ツユ−クロース、ラクトー
ス、マルトース、澱粉グリコーゲンなどから生成するが
カスの生成はなし。

（支）生前ｒｉ、Ａ度；最超生育温度３８〜４６Ｃ１最
商生＋４１ｉ＋１″ｉｄ斐約　５０゛し。

以上の菌学的諸匪買について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｉ３ａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第７ｊＪ１（及び第８版（’ｌ’
ｂｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆、Ｗｉｌｋｉｎｓ’　Ｃｏ
ｒ川ｔ用ｓｌｙ、　１９５７年及び］９９７４年を参照
し同定した結果、本国はバシルス　ズブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｉｓ　）の友柚の一］！■と
角えるのが女当と思われた。

本菌株はアミラーゼＧ３の他にα−１，６−グルコシダ
ーゼ（プルラナーゼ）を同時に生Ａ！ａする口し力があ
り、この酵素がアミロペクチンの分岐結合であるα−１
，６−グルコシド結合を分解するため、澱粉やアミロペ
クチ７などの分岐結合のある＆［に対し、アミラーゼＧ
３と共同して作用し澱粉からマルトトリオースを収量よ
く生産するのに重要な役割をしている。例えば、本菌の
生産するα−１，６−グルコシダーゼと同時に反応を行
った場合、マルトトリオースの収量は基質の種類によっ
てもことなるが、通常１０〜２５％増加する。

本菌の生産するα−１，６−グルコシダーゼの酵素１′
す性質は下記に示す辿りである。

（１）作用ニブルランに存在するα−１，６−グルコシ
ド結合を分解し、マルトトリオースを生成する。また、
澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン又はその派生物の
α−１，６−グルコシド結合を分解する。

（２）作用温度鴨聞及び最適作用温度；約７０’Ｃまで
作用し、最適作用温度は約６０℃（１％プルラン、０．
０５　Ｍ　）リス級価液のもとて３０分間反応） ｔ、３＋　　１１；用ｐＨ郵囲及び最８１′に用ｐｉ−
ｉ；　ｐＨ約４〜約１０の範囲に作用し、最通作用ｐｉ
−１は６〜７にある（１％プルラン、０．０５　Ｍ緩衝
液の下で４０シて反応） （４）熱安定性；　０．０５　Ｍ　ｈ　＋７　ｘ緩４ｉ
ｉｉｔｋ（ｐＨ７，０）のもとで、各温度で１０分間加
熱後、残イｒ活性を測定した。その結果、５０　Ｃ，１
０分間の加熱では殆んど失活ぜず、６０　’Ｕ、１０分
間の加熱で約７０％失活した。

（５）ｐＨ女定性、　ｐＨ約５〜約１０で安定（０，１
〜１緩働液の下で室温（２５℃）で放置後、残存存活性
をＪｌり定Ｊ ｔｔ３）　　ｔｉｎ害剤；本酵素ｌｅｔ　５Ｘ１０−　
’　（７）ＨｇＯｌ　１、ＡｇＮ０３ＣｕＳＯ４などに
より、それぞれ約９８％、約　９８％、約８７％阻害さ
れた。

ｍ　女定化；カルシウムイオンの存在は本酵素の熱表疋
性を増加する。

由１指製方法；本酵素は液体培食物の上澄液からｍ’Ａ
Ｆ分画、１）ＥＡＲ−セノアロースカラムクロマトグラ
フイー（ＫＣＩ　Ｏ，〜０．５Ｍでグラジェント溶出入
　その後セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラ
フイーによりクロマト的且つ電気泳動的にはり均一まで
精製することができる。

（９）分子蓋：セソアデックスａ　−２００ゲル濾過法
により６＋１１定された分子血は約５５万であった。

（１０１力価測定法；　０．Ｉ　Ｍ　！Ｉン酸緩衝液に
溶解させた１％プルラン液（ｐＨ７，０）　０．５ｍｌ
に適量の酵素を加え、水で全Ｍ　１　ｎｌとし。

４０　Ｃで反応させる。この条件で１時間に１　＃ｌ、
のマルトトリオースに相当する還元力を生成する酵素鼠
を１単位と した。

本発明によるアミラーゼＧ３生産のための培貢は、屋索
源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン、
コーン・ステイブ・リカー、大豆粕など通常に用いられ
る（１機窒索諒が使用されまた、炭素源としては誠粉、
゛デキストリン、マルトース、クルコース、シュークロ
ースなどが使用され、そして、これに袖垣する栄養鯨と
して無像電蓄ゐ覧、リン酸塩、マグネンウム塩と各４４
１！金属塩を宮む培地が使用される。培養はｐＨ約５〜
９゜ｎＡ度２６〜５５（で好気的に行なわれる。

アミラーゼＧ３及びプルラナーゼは菌体外に生産される
酵素であるので、培養終了後、ｐ過又は遠心分離して除
菌し、」ニバを液を回収する。そして、必要に応じ、濃
縮し、硫安、硫酸すトリウム１などによる塩折によ・る
か、又はアセト／、インプロパツール、エタノール、メ
タノールなどの４１機俗Ａｌｌを加えて、酵素を沈澱物
として収得、乾燥、保存する。

本酵素による澱粉の糖化は、通常５〜４０％の液化澱粉
の下で、ｐ）１５．５〜８、温度４０〜６０゛Ｃで行な
われる。

以下に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ ２０〇−容三角フラスコに、Ｋ　ｔＨＰｏ　４０．３％
、Ｍｇ５Ｏ４，７Ｈ２００，１％、魚肉エキス３％、可
溶性澱粉１％、硫酸マンガ１５Ｘ１０−５Ｍからなる液
体培地を入れ、常法により殺菌後、バシルス属菌株（微
工研菌寄第５８５４号）を接種し、３０゛０で２日間振
盪培資した。培女俊、辿心分離機で除菌し、得られた上
澄液について、生産されたアミラーゼＧ３を測定した結
果、培地−当り８０．９単位であった。そして、同時に
生産されたプルラナーゼは培地−当り１１．５単位であ
った。

培養上澄液に硫安を６０２６飽和になるように加えて、
沈澱区分を集め、乾燥保存した。

本酵素剤にはアミラーゼＧ３の他にプルラナーゼが存在
しているので、アミラーゼＧ３は次の操作で精製した。

６１ｊ記酵素剤を水に溶解後、遠心分離した上澄液につ
いて、蒸留水に則して透析後、２．５Ｘ１０”　３　Ｍ
トリス緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セソアロース力ラ
ムに吸着後、同緩衝液で洗滌後、同緩衝液を含むＫＣＩ
溶液、で０〜０．５Ｍまでリニヤ−グラジェントにより
溶出した。この結果、プルラナーゼを含まないアミラー
ゼＧ３を得ることができた。

硫安沈澱物からの収量は約３０％であった。

該精製酵素液３．３．単位をＤＢ　４．３の液化澱粉溶
液（固形分５０■）に加え、塩化カルシウムを５Ｘ１０
−３Ｍ添加し、全ｉｊｋ　１　ｍｔとして５０℃で反応
させた。得られた糖化物の一部をペーパークロマトグラ
フ法により３重展開（溶媒；ピリジ／／ｎ−ブタノール
／水＝４７６／Ｂ）後、各糖凶分を切抜き、水で抽出後
、フェノール−硫酸法により定電した。その結果、グル
コース２．８　％、マルトース１２．１％、マルトトリ
オース５５．３％、マルトテトラオース４．４％、その
他のオリゴ糖２５．４％であった。

実施例　２ 実施例１において、培地としてＫ　ｔ　ＨＰＯ４０，３
％、Ｍｇ５Ｏｓ、７Ｈ】ＯＯ，１％、魚肉エキス３％、
ｉＪ溶性緻粉２％、ＭｎＣ１！　　２．５８１０−６　
Ｍ、　ＣａＣ１１１ｘｌＯ−”　Ｍ、　ＺｎＳＯ４１Ｘ
ＩＯ−４Ｍ、　ＣｕＳＯ４５ｘｌＯ−’Ｍを含む液体培
地を使用し、３０Ｃで４日間振盪培養した。その結果、
生産されたアミラーゼＧ３は培地−当り１５２．４単位
であった。又、同時に生産されたプルラナーゼは培地−
当り１７．３単位であった。

【図面の簡単な説明】

第１図１ａｌ、ｔｂｌ、ＩｃＩとｔｄｌは、ソレソレハ
シルス鵜アミラーゼＧ３の駄適ｐＨ，最Ｊ！！温反、熱
安定延性とｐＨ安定性をボしている。 第２図１８１、ｔＬ＋ｌ、ｔｅｌとｔｄｌは、それぞれ
ノくシルス属α−１，６−グルコシダーゼの最適ｐＨ１
最適温反、熟女定性とｐＨ安定性を示している。 ヤ２ （ａ） Ｈ （ｃ） 速度 温度 手続補正書（白ｋ） 昭和　５８年＋　月　７７日 特許庁長官殿 一１− １、事件の表示　昭和　５７　　年特許願第　／ｚｒ１
０１１　　号２、発明の名称 アミラーセＧ３の製造法 ３、補正を１−る者 事件との関係、特許出願人 住　所　東京都千代田区霞が関ＩＶ目３番１シン氏　　
名　　（１１４）工業技術院長　石　坂　誠　−６補正
により増ＤＩ＋する発明の数　　な　し７、補正の対象 次の字句を挿入する。 を削除し、次の文章を挿入する。 ｒｐＨ約４〜約１０の広いｐＨ範囲に作用し、ｐＨ５付
近とｐＨ７〜７．５付近に作用極大が認められる。 （１９６プルラン、０．０５　Ｍ緩衝液（酢酸緩衝液ｐ
Ｈ３，５〜５．５、リン酸緩衝液ｐＨ５，５〜１０）の
下での字句を挿入する。 句を挿入する。 （８）第２図≠を別紙のとおり訂正する。 肯２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）バシルス鵬に属しアミラーゼＧ３を生産する微生物
   を培養し、培養物からアミラーゼＧ３を採取することを
   特徴とするバシルス属アミラーゼＧ３の製造孝法。 ２）ハシルス属に鵬し、アミラーゼＧ３とα−ＩＪ３−
   グルコシダーゼを同時に生産する微生物を培養し、培養
   物からアミラーゼＧ３とα−１，６−グルコシダーゼを
   採取することを特徴とするバシルス縞アミラーゼＧ３と
   α−１，６−グルコシダーゼの製造方法。