JPS594119B2

JPS594119B2 - アミラ−ゼｇ４，５によるオリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JPS594119B2
Application number: JP3753682A
Authority: JP
Inventors: 義幸高崎
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-03-09
Filing date: 1982-03-09
Publication date: 1984-01-27
Also published as: JPS58170492A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はでん粉からマルトテトラオースとマルトペンタ
オースを主成分とする糖化物の製造方法に関するもので
ある。

従来、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼなどでん粉に対する分解様式
を異にする種々のアミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの製造に釦用されてきた。

そして、最近は、より分子量の太きい、例えば、マルト
トリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マ
ルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６
）などのオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらの糖は食品の甘味料、増量剤、賦形剤、包接剤と
して食品、薬品及び種々の工業製品に広く利用できると
考えられているが、未だ製法は確立されていない。

本発明者は、これらオリゴ糖生産能の強い微生物を求め
て、広く土壌中より微生物の検索を行ってきた結果、バ
シルス属の微生物が、でん粉をマルトテトラオース（Ｇ
４）とマルトペンタオース（Ｇ５）を主成分とする糖
化物に分解するアミラーゼを菌体外に生産することを認
めた。

マルトテトラオースを生成する酵素としては、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ５ｔｕｚｅｒｉの生産するアミ
ラーゼが、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端
からマルトテトラオースを生成することが知られている
（ＡｒｃｈｉｖｅｏｆＢｉｏｅｈｅｍｉ−ｓｔ
ｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ第１４５巻、１０
５〜１１４頁（１９７１））が、この酵素はマルトペン
タオースを生成しナイ。

一方、マルトペンタオースを生成するアミラーゼとして
は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
の生産する耐熱性α−アミラーゼかでん粉からＧ５を主
成分とする糖化物を生産することが報告されているが、
この酵素のマルトテトラオースの生成能はマルトペンタ
オースの生成能に比べ著しく少なく％程度である。

また、この酵素はＧ１−Ｇ１２の各成分も同時に生成す
る酵素である（ＡｒｃｈｉｖｅｏｆＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ第１５
５巻、２９０〜２９８（１９７３））。

この他、Ｂａｃｉｌｌｕｓ５ｕｂｔｉｌｉｓのα−
アミラーゼもでん粉からマルトテトラオースやマルトペ
ンタオースを含んだ種々の糖の混合物を生成するがマル
トテトラオースやマルトペンタオースが主成分をなすも
のでないために、これら糖の製造には適していない。

しかるに、本発明のアミラーゼにより生産されるでん粉
分解物の糖組成は、使用するでん粉のＤＥや糖化時の反
応条件（でん粉濃度、ｐＨ１酵素濃度）によっても異な
るが、通常、マルトテトラオースは１５〜３５％、マル
トペンタオースは１５〜３０％を占めており、これら糖
の合計は加〜６０％に達する。

第１表に典型的な糖化物の糖組成を示す。

このように、本発明の生産するアミラーゼはでん粉から
マルトテトラオースとマルトペンタオースを主成分とす
る糖化物を生成するアミラーゼであり、このような特徴
のある酵素はいま〜で知られておらず、全く新規な酵素
であり、本発明者はこの酵素をアミラーゼＧ４，５と命
名した。

以下に本酵素の性質を記載する。

（１）作用；でん粉、アミロース、アミロペクチン、デ
キストリンなどのグルカンをマルトテトラオースとマル
トペンタオースの単位で分解し、これら糖を主成分とす
る糖化物を生成する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は５０〜５５℃（１％でん粉濃度、
最適作用ｐＨで３０分間反応、第１図ａ）。

（３）最適ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ：ｐＨ４，５〜
１１の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６．５〜７．５（
第１図ｂ）。

（４）熱安定性；０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，０
）の存在下で加熱した場合、５０℃１０分間の加熱で７
０〜９０％失活する（第１図Ｃ）。

（５）ｐＨ安定性；０．０５Ｍ緩衝液で、室温で３時間
放置後、残存活性を測定した。

その結果、ｐＨ約６〜約１０の範囲で安定であった（第
１図ｄ）（６）安定化：カルシウムイオンの存在により
熱安定性の増加が認められた。

（力阻害剤；本酵素は５Ｘ１０ＭのＨｇＣ１２
ｔＺｎＳＯａｓＣｕｐＣ４１ＦｅＳ０４ｓ
ＣｏＣ１２ｌＡｇＮＯ３などにより９５％以上失活し
声。

（８）精製方法及び分子量；本酵素は液体培養物のｒ液
から、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマ
トグラフィー（ＫＣＩ０．２〜０．６Ｍでグラジェ
ント溶出）、セファデックスＧ−２００カラムクロマト
グラフイーとセファデックスＧ−１００カラムクロマト
グラフイーなどにより、クロマト的に単一まで精製され
る。

セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイーに
より、分子量が約４万と約１１万の２つのアイソマー分
離されるが、通常、分子量の小さい成分が主成分を占め
ている。

そして、両者の酵素的性質には大きな差は認められない
。

（９）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解させ
た１％可溶性でん粉液（ｐＨ７，０）０．５ｍｌに適
量の酵素を加え、水で全量１７７１７！とじ、４０℃で
反応させる。

この条件で１時間に１■のグルコースに相当する還元力
を生成する酸素量を・１単位とした。

本酵素を生産するバシルス属菌の例示菌として、バシル
スサーキュランスを挙げる。

本菌株の菌学的性質は下記の通りであり、本菌株は微工
研菌寄第６２３７号として、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。

（１）形態；桿菌、大きさ、巾０．７〜０．８μ×長さ
２．５〜５μ、２〜３個連なったものが多い。

非運動性、ダラム陰性。

（２）胞子；胞子嚢細胞はふくらみ、球形〜楕円形の胞
子を形成する。

（３）ゼラチン；液化する。

（４）肉汁寒天；生育良好、黄味がかった薄褐色。

（５）グルコース肉汁寒天；生育不良、淡黄色。

（６）グルコース硝酸塩寒天；わずかに生育、半透明。

（７）肉汁；わずかに混濁、白濁、沈降する。

（８）食塩肉汁：１〜１０％食塩濃度食塩束育、１〜５
％で生育促進。

（９）ミルク：分解力強くないが、凝固、その後ペプト
ン化する、リドマス還元。

Ｃｌ０）ポテト：生育普通、色素の生成なし。

αυ チロシン寒天：生育かなり良好、淡黄色、チロシ
ナーゼ陰性。

Ｃ３グルコースアスパラギン寒天；殆ど生育しな（１゜０インドール；生成しない。

■ アセチルメチルカルビノール；生成しない。

αＱ硫化水素：弱いが生成する。

（１６）硝酸塩の還元；陽性。

（１７）ウレアーゼ；生成しない。

（１８）カタラーゼ；陽性。

ｄｌでん粉の加水分解；陽性。

（２０）炭水化物の利用；グルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラ
ビノース、シュークロース、マルトース、Ｌ−ンルボー
ス、マンニトール、テン粉ヲ利用、生成するが、ガスの
発生なし。

ラクトース、ラフィノース、ソルビット、イヌリンから
生成は弱いか殆どなし。

（２Ｉ）メチレンブルー；還元する。

（２つクエン酸；利用しない。

（２３）生育温度；最適生育温度は約３０’Ｃ，最高生
育温度は５０〜５７℃。

（２４）死滅温度、１００℃で１０分間加熱しても死滅
しない。

（２■ 最適生育ｐＨ；７．５〜８．５゜以上の菌学
的性質について、ＢｅｒｇｅｙｓＭａｎｎｕａｌ
ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔ
ｅ−ｒｉｏｌｏｇｙの第７版及び第８版（ＴｈｅＷｉｌ
ｌｉａｍｓ＆ＷｉｉｋｉｎｓＣｏｍｐａｎｙ１９
５７年及び１９７４年）を参照し、本微生物は、パルシ
スサーキュランス（Ｂａｃｉｌ１ｕｓｃｉｒｃ
ｕｌａｎｓ）に近縁の微生物であると同定した。

本菌株はアミラーゼＧ４，５と同時にプルラナーゼを生
産し、両酵素は共同して、でん粉、アミロペクチンなど
分岐結合（α−１，６−グルコシド結合）のある基質か
らマルトテトラオースとマルトペンタオースを収量よ（
生産するのに重要な役割をしている。

本菌の生産するプルラナーゼの酵素的性質は下記に示す
通りである。

（１）作用；プルランに存在するα−１，６−ゲルコン
ド結合を分解し、マルトトリオースを生成′する。

また、でん粉、アミロペクチン、グリコーゲン又はその
派生物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は５０〜５５℃（１％プルラン、０
．０５ＭトＩＪス緩衝液のもとで３０分間反応）。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ；ｐＨ約５〜約
９の範囲に作用し、最適作用ｐＨは７付近にある（１％
プルラン、０．０５Ｍトリス緩衝液の下で４０℃で反応
）。

（４）熱安定性；０．０５Ｒ１リス緩衝液（ｐＨ７，０
）のもとで、各温度で１０分間加熱後、残存活性を測定
した。

その結果、５０℃、１０分間の加熱で約７３％失活し、
５５℃、１０分間の加熱で約９７％失活した。

（５）ｐＨ安定性；ｐＨ約６〜約９で安定（０，１Ｍ酢
酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下で、室温（２５℃）で放
置後、残存活性を測定）。

（６）阻害剤；本酵素はＣｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｇ＋。

Ｈｇ２＋ｇＦｅ２＋などにより強（阻害される。

（７）安定化；カルシウムイオンは本酵素の熱安定性を
増加する。

（８）精製方法；本酵素は培養ｆ液から、硫安分画、Ｄ
ＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー（ＫＣ
Ｉｏ、２〜０．５Ｍでグラジェント溶出することにより
、アミラーゼＧ４，５と分離できその後、セファデック
スＧ−２００カラムクロマトグラフイーによりクロマト
的に均一まで精製できる。

（９）分子量：セファデツクスＧ−２００ゲルｆ過法に
よる分子量は約７万であった。

（１０）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解さ
せた１％プルラン液（ｐＨ７，０）０．５１ｒＬｌに
適量の酵素を加え、水で全量１１ｎｌとし、４０℃で反
応させる。

この条件で１時間に１７ｑのマルトトリオースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。

本発明による酵素生産のための培養は、通常、用いられ
る固体培地又は液体培地が使用され、液体培養のための
培地の窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン、コーン°ステイープ、リカーなどが使用
され、炭素源としてはでん粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シュークロースなどが使用される。

そしてこれに補足する栄養源として、無機窒素源、リン
酸塩、マグネシウム塩、金属塩を含む培地が使用される
。

培養はｐＨ６〜９、温度２５〜５５°Ｃで２〜３日間好
気的に行なわれる。

アミラーゼＧ４，５及びプルラナーゼは、いずれも菌体
外に生産されるので培養後、濾過又は遠心分離した上澄
液について有機溶剤又は塩析による沈澱回収するか、前
記の精製方法に従い酵素を精製する。

次に酵素によるでん粉の糖化条件について記載する。

アミロース、アミロペクチンやでん粉は糖化に際して液
化される。

液化は酸又はα−アミラーゼを用いて、常法に従い行な
われるが、でん粉の液化度はマルトテトラオースとマル
トペンタオースの収量に著しく影響するので、これらオ
リゴ糖の生産のための望ましいでん粉の液化度ＤＥ（ｄ
ｅｘｔｒｏｓｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔの略で、固
形分中の還元糖量なグルコースとして表わした百分率）
は１５以下であり、このような液化でん粉を使用した場
合、マルトテトラオースとマルトペンタオースの収量は
約４０〜６０％になる。

基質濃度は通常５〜４０％で行なわれる。

糖化時のｐＨは、特にマルトペンタオースの収量に影響
する。

すなわち、糖化時のｐＨが約７以下では、一旦生成した
マルトペンタオースがマルトースとマルトトリオースに
分解されやすい。

そしてこの分解反応を抑制するためには、反応時のｐＨ
は約７．５以上望ましくは約８以上に維持することが望
ましい。

反応温度は通常、４０〜６０℃で行なわれる。

本酵素はカルシウムイオンにより熱安定性が著しく増加
するので、糖化反応に際して、例えば塩化カルシウムを
５Ｘ１０Ｍ〜２Ｘ１０Ｍ程度添加する。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１２１の三角フラスコに、ポリペプトンＳ（大豆製、和光
純薬工業株式会社販売）４％、Ｋ２ＨＰＯ４０，３％、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、可溶性でん粉１％と硫
酸アンモニウム０．１％からなる液体培地（ｐＨ７，０
）４００ｒＩＬｌを入れ、常法ニヨル殺菌後、バシルス
サーキュランスＧ４５（微工研菌寄第６２３７号）を
接種し、３０℃で２日間振盪培養した。

培養後遠心分離機で除菌し、得られり上澄液について生
産されたアミラーゼＧ４，５を測定した結果、培地罰当
り６．１単位であった。

本培養液中には同時にプルラナーゼが生産されているた
め、培養濾過から、硫安９０％で沈澱する区分を集め、
蒸溜水で透析後、０．２ＭＫＣｌを含む０．０２５Ｍ
トリス緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースカラ
ムに吸着させ、０．２ＭＫＣＩから０．５ＭＫＣ
Ｉまでグラジェントに溶出することによりプルラナーゼ
を含まないアミラーゼ区分を得た（６７単位１０Ｄ２６
□ｍμ）。

ＤＥ８．０５の液化でん粉１ｔに、該酵素液２０単位と
塩化カルシウムを５Ｘ１０−３Ｍ量添加し。

全量１０ｒｆＬｌにし、５０℃で２４時間反応させた。

そして、得られたでん粉糖化物中の糖組成を、高速液体
クロマトグラフ（カラム；昭和電工（株）ＮＨｐａｃｋ
Ｊ −４１１、溶出液；アセトニトリル６５％；水
３５％）で分離定量を行った結果、グルコース４．５％
、マルトース１０．７％、マルト！トリオース１１，２％、マルトテトラオース２３．６％
、マルトペンタオース２８％、マルトヘキサオース６．
０からなる糖組成であった。

実施例２ポテトでん粉をバシルス属のα−アミラーゼ（大和化成
（株）製りライスターゼＫＭ）で液化して得られたＤＥ
２．３８、４．２５、５．８１。

８．０５、１２．６と２７．２の各液化でん粉液（乾物
量として１００■）に、塩化カルシウム５Ｘ１０−Ｍ量
と酵素２単位を添加し全量ＩＴＩＬｌとして、５０℃で
２４時間反応させた。

反応後、得られた糖化物について糖組成を定量した結果
、第２図に示す通りであった。

図から明らかなように、マルトテトラオースとマルトペ
ンタオースの生産のためには、ＤＥ約１５以下が適当で
あることがわかった。

実施例３実施例１と同様にして調製したアミラーゼＧ４゜５とプ
ルラナーゼ、それぞれ２０単位と３０単位及び塩化カル
シウムをｉｘｉｏ−２Ｍ量をＤＥ４３の液化でん粉液（
固形物として１グ）に添加し、ｐＨを７．５に調整し、
全量１０ｄとして５０℃で２４時間反応させた。

反応後、得られた糖化物の糖組成を分析した結果は第１
表に示す通りであった。

表から明らかなように、プルラナーゼの存在下で反応を
行うことにより、マルトテトラオースとマルトペンタオ
ースの含量の高い糖化物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂ、ｅとｄはそれぞれアミラーゼＧ４．５に
よるでん粉分解反応の最適温度、最適ｐＨ熱安定性とｐ
Ｈ安定性を示している。第２図は各種のＤＥの液化ポテトでん粉をアミラーゼＧ
４５で糖化した時の糖化物中のＧｌ（グルコース）、Ｇ
２（マルトース）、Ｇ３（マルトトリオース）、Ｇ４（
マルトテトラオース）と０５（マルトペンタオース）の
含量を示している。

Claims

【特許請求の範囲】

１でん粉又はその部分分解物からマルトテトラオース
とマルトペンタオースを生成スるバシルス属のアミラー
ゼＧ４，５を、でん粉、アミロース、アミロペクチン又
はその部分分解物に作用させることを特徴とするバシル
ス属アミラーゼＧ４，５によるマルトテトラオースとマ
ルトペンタオース含有糖液の製造方法。