JPH0155877B2

JPH0155877B2 -

Info

Publication number: JPH0155877B2
Application number: JP60143518A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-06-29
Filing date: 1985-06-29
Publication date: 1989-11-28
Also published as: JPS6225977A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明はバジルス属細菌の生産する新規なアミ
ラーゼに関するものである。〔従来技術〕澱粉をグルコースあるいはマルトースに分解す
るグルコアミラーゼ、β−アミラーゼやαーアミ
ラーゼは自然界に広く存在することが知られてい
るが、より分子量の大きい、例えば、マルトトリ
オースG3、マルトテトラオースG4、マルトペン
タオースG5、マルトヘキサオースG6などのオリ
ゴ糖単位で切断するアミラーゼについての報告は
少ない。これらオリゴ糖は、食品の増量剤、賦形剤ある
いは甘味調整剤として注目されいる。特に、G4
〜G7の各オリゴ糖は、診断用アミラーゼの活性
測定用基質としても注目されている。〔目的及び効果〕本発明者は、これらオリゴ糖の製法を確立する
ことを目的として、広く自然界より微生物の検索
を行つてきた結果、アミロース、アミロペクチ
ン、澱粉などのα−グルカンを特異的にマルトテ
トラオースG4に加水分解する新規なアミラーゼ
がバシルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）と同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。澱粉からマルトテトラオースを生成するアミラ
ーゼとしては、シユードモナススツツエリ
（Pseudomonas stuzeri）の生産するアミラーゼ
が、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端
からマルトテトラオース単位で加水分解すること
が知られている。しかし、この酸素はアミロペクチンやグリコー
ゲンからは高分子量のリミツトデキストリンを残
すと報告されている。〔アーカイブバイオケミ
ストリーアンドバイオフイジクス（Archive
Biochemistry and Biophysics）145巻105頁
（1971）〕。そして、この酵素による澱粉からのマ
ルトテトラオースの収量は約55％、アミロペクチ
ンからの収量は52％、と報告されている〔アメリ
カ合衆国特許USP3654082（1972）、アミラーゼ
シンポジウム、６巻、31頁（1971）〕。しかるに、本発明のバシルス属細菌の生産する
アミラーゼは、澱粉から約65％〜75％の極めて高
い収量でマルトテトラオースを生成することが認
められた。マルトテトラオースの収量は、使用す
る澱粉の種類、液化度DE、酵素量などにより影
響されるが、通常、グルコース１〜５％、マルト
ース５〜15％

〔構成〕

本発明は、澱粉から主成分としてマルトテトラ
オースを約65〜75％の収量で生成する新規なアミ
ラーゼG4に関するものである。以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明す
る。本発明により生産される酵素は、下記の酵素的
性質を有する。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオー
スを主成分とする分解物に分解する。本酵素は
エンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約65〜
75％の収量でマルトテトラオースが得られる。 (2) 作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性
澱粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き約75℃まで作用し、最適作用温度は約50℃で
ある。（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH；約４〜約12の広
い範囲に作用する。第２表及び第１図ｂから明
らかなように、本酵素の最適作用PHは6.5〜7.5
であることが認められる。

【表】（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶性
澱粉下で作用、）。 (4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の下
で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約40％
失活し、55℃、10分間の加熱で約85％失活した
〔第１図ｃ〕。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH６〜９範囲ので安定であつた〔第１図
ｄ〕。 (6) 安定化；カルシウムイオンが存在するとき、
熱安定性の増加が認められた〔第１図ｃの破
線〕。 (7) 阻害剤；本酵素は、５×10^-3MのHgCl₂、
CuSo₄、ZnSO₄、AgNO₃により、それぞれ、
約100％、約95％、約50％、約30％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、DEAE−セフアロース
（Sepharose）カラムクロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）A0.5ｍカラムクロマ
トグラフイー及び同ゲルによる再クロマトグラ
フイーにより電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。 (9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5ｍを用
いたゲル濾過法により側定した分子量は約１万
であつた。 (10) 力価側定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で１分間に1μモルのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位と
した。以上の酵素的性質について、本発明依前に知ら
れているシユードモナススツツエリのマルトテ
トラオース生成アミラーゼと比較すると(1)最適作
用PHは、本発明の酵素はPH６〜8.5の広いPH範囲
にあるのに対し、シユードモナススツツエリ酵
素はPH８付近にあること、(2)本発明の酵素を澱粉
に作用させたとき、約65〜75％の収量でマルトテ
トラオースが得られるのに対し、シユードモナス
スツツエリの酵素の場合は約55％であること、
(3)本発明の酵素の分子量は１万前後にあるのに対
し、シユードモナススツツエリの酵素は、
48000と58000にある〔バイオケミストリーアン
ドバイオフイジクスアクタ（Biochemistry
and Biophysics Acta）566巻、88頁（1979））な
ど、本発明の酵素とシユードモナススツツエリ
の酵素とは、澱粉からのマルトテトラオースの収
量、最適作用PH、分子量などの性質において、顕
著な違いのあるものであり、新規な酵素というこ
とができる。本発明の酵素を生産する例示菌として、バシル
スサーキユランス（Bacillus circulanc）Ｇ−
４を挙げる。本菌の菌学的性質は下記に示す通り
であり、微工研条寄第８２０号として工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；桿菌、巾0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。 (2) 胞子；通常、末端近くに１個、胞子曩のふく
らみは認められない。 (3) 肉汁；混濁、沈降する。 (4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及
び表面凹凸あり。 (5) グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐
色。 (6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。 (7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。 (8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり
良くない。淡黄〜黄褐色。 (9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。 (10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。 (11) インドール；生成しない。 (12) カタラーゼ；生成する。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) 硫化水素；生成しない。 (15) クエン酸；利用する。 (16) 硝酸塩の還元；陰性。 (17) クエン酸；利用する。 (18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生育
し、10％食塩でも少し生育する。 (19) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−リボース、マルトース、シユークロー
ス、澱粉などから酸を生成するが、ガスの生成
はない。Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−ソル
ボースの利用性は良くない。 (20) 最適生育温度；26℃前後。 (21) 最高生育温度；約60℃。 (22) 死滅温度；100℃で30分間加熱しても死滅
しない。以上の菌学的性質について、バージエイスマ
ニユアルオブデタミネーテイブバクテリオ
ロジー（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版〔ザウイ
リアムスアンドウイルキンスカンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、
（1957年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス
サーキユランス（Bacillus circulans）の一種
と同定し、バシルスサーキユランスＧ−４と命
名した。本発明によるアミラーゼG4を生産するための
培養は、窒素源として肉エキス、ペプトン、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕など、通常、微生物の培養に対し良く
用いられる有機窒素源が使用され、炭素源して
は、澱粉、デキストリン、マルトース、グルコー
ス、シユークロースなどが使用される。そして、
これに補足する栄養源として、無機窒素源、リン
塩酸、マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が
用される。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好気
的に行われる。アミラーゼG4は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。必要により濃縮
し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、
または、アセトン、イソプロパノール、ェタノー
ル、メタノールなどの有機溶培を加えて、酵素を
沈澱物として収得し、乾操、保存する。アミラー
ゼG4を用いて、澱粉を糖化する反応は次のよう
にして行う。澱粉は、酸または、α−アミラーゼ
により駅化される。液化度はマルトテトラオース
の収量に影響するので、望ましくはDE20以下の
液化澱粉が使用される（DEは固形物中の還元力
をグルコースとして表した百分率）。基質濃度は、
通常、５〜40％で行われる。反応PHは、通常５〜
９、温度は40〜60である。本酵素は、カルシウム
イオンの存在により、著しく熱安定化されるの
で、糖化反応に際して、５×10^-4〜２×10^-5M程
度のカルシウム塩が添加される。アミラーゼG4による、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンなどα−１、６−グルコシド結合の
分岐をもつ基質を用いる糖化反応においては、イ
ソアミラーゼ、プルナラーゼなどのα−１、６−
グルシダーゼの存在下で反応を行うと、糖化反応
を促進するため、アミラーゼG4を節減したり、
また、マルトテトラオースの収量を増加すること
ができる。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１ポリペプトン１％、リン酸２カリ0.3％、硫酸
マグネシウム（７水塩）0.1％、可溶性澱粉１％
からなる培地30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で10分間殺菌したのち、バチルス・サーキ
ユランスG4（微工研条寄第８２０号）を接種し、
30℃で４日間振盪培養（160rpm）した。培養後、遠心分離して得た上澄液について生産
されたアミラーゼG4を測定した結果、培地１ml
あたり6.4単位であつた。実施例２実施例１で得られた酵素液を使用して、澱粉の
糖化を行つた。基質としては、DE4.2の液化澱粉100mg（固形
分）に、塩化カルシウム５×10^-3Mとアミラーゼ
G4を基質１ｇ当たり２単位加えたもの、及びこ
れにクレブシラ（Klebsiella）属のプルラナーゼ
（ナガセ生化学製）を基質１ｇ当たり、２単位ま
たは５単位加え、水で全量１mlとして、50で反応
させた。反応開始後、20時間目と44時間目に一定
量を採り、生成したマルトテトラオースを高速液
体クロマトグラフ法により定量した。結果を第３
表に示す。

【表】表から明らかなように、アミラーゼG4を用い
て、澱粉を糖化する反応において、プルラナーゼ
を共存させて糖化反応を行うと、糖化反応が促進
され、アミラーゼG4単独の場合よりも、マルト
テトラオース含量の高い糖化物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄはそれぞれ、アミラーゼ
G4の最適作用温度、最適作用PH、熱安定性とPH
安定性を示す。第２図は、高速液体クロマトグラ
フにより分離した糖化物の糖組成を示す。１；グ
ルコース、２；マルトース、３；マルトトリオー
ス、４；マルトテトラオース。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有するバチルス属に属
する微生物由来の新規なアミラーゼG4 (1) 作用：α−グルカンをマルトテトラオースを
主成分とする分解物に分解し、エンド型の分解
様式を持つ。 (2) 最適PH：PH6.5〜7.5 (3) 分子量：約１万