JPS5937957B2 - アミラ−ゼｇ３によるマルトトリオ−スの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉からマルトトリオースを主成分とする糖
化物の製造方法に関するものである。

従来、アミラーゼとしては、澱粉をその非還元性末端か
らグルコース単位に分解するグルコアミラーゼ、マルト
ース単位に分解するβ−アミラーゼや、澱粉をその内部
銀から切断するα−アミラーゼが知られ、グルコースや
マルトースの工業的製造に使用されている。

そして、最近はより分子量の大きい、例えば、マルトト
リオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マル
トペンタオース（Ｇ５） 、マルトヘキサオース（Ｇ６
）などのオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらのオリゴ糖は食品の増量剤、賦形剤、包接剤なと
、食品、医薬及び工業製品に広く製造できるものと考え
られているが、末だ製法は確立されていないと云っても
過言ではない。

本発明者は、これらオリゴ糖の製法を開発するこきを目
的として、澱粉よりこれらオリゴ糖を特異的に生産する
アミラーゼの探索を行ってきた結果、バチルス属の微生
物が、澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖化物に
分解するアミラーゼを生産することを認めた。

澱粉からマルトトリオースを特異的に生成するアミラー
ゼとしてはｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓ
ｅｕｓの生産するＮ−Ａ４６８酵素（特公昭５７−６９
１５、特開昭１１００４９、澱粉化学、第２３巻、第３
号、第１７５〜１８１頁（１９７９））が知られている
。

しかし、この酵素は、β−アミラーゼと同様に、澱粉を
マルトトリオース単位でｅｘｏ型で分解するアミラーゼ
であり、反応生成物中の糖は殆んどマルトトリオースの
みであると報告されている。

しかるに、本発明の酵素は分解生成糖がα−糖であるこ
とがらα−アミラーゼの一種であり、澱粉を最終的には
法度反応が殆んど消失するまで、主としてマルトトリオ
ースを含む分解物に分解するアミラーゼあり、ポテト澱
粉糖化物の糖組成の一例は第１表に示す通りである。

この他、酵素の最適温度、熱安定性、ｐｎ安定性分子量
などの酵素的性質においても著しい差異が認められるも
のである。

また、従来知られている多くのα−アミラーゼは澱粉分
解産物の一つさしてマルトトリオースを生成するが、マ
ルトトリオースのみを特異的に大量生成するものではな
い。

本発明のアミラーゼは、第１表から明らかなように、マ
ルトトリオースを６０％以上の高収量で生産するという
極めて特徴のあるアミラーゼであって、本発明者はこの
酵素をアミラーゼＧ３と老令した。

以下に本酵素の酵素的性質を記載する。アミラーゼＧ３
の酵素的性質 （１）作用；澱粉、アミローズ、アミロペクチン、デデ
キストリンなどのグルカンをマルトトリオースを主成分
きする分解物に分解する。

生成糖はα−型であって、本酵素はα−アミラーゼの一
種と考えられるものである。

澱粉及び液化でん粉からのマルトトリオースの収量は約
５０〜約６５％である。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約５０°Ｃである（１％澱粉濃度
、最適作用ｐＨで３０分間反応、第１図ｂ）。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐ）Ｉ約４〜
約１１の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６〜７、（第１
図ａ） （４）熱安定性、０．０５Ｍトリス緩衝液（［）Ｈ７，
０）の存在下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱
で約７０％失活し、６０℃、１０分間の加熱で９０％以
上失活する。

（第１図ｅの白抜き丸）。

（５） ｐＨ安定性；０．１Ｍ緩衝液の下で、室温（
２５℃）で３時間放置後、残存活性を測定したその結果
、ｐＨ約６〜約９の範囲で安定であった。

（第１図ｄ）。

（６）安定化；カルシウムイオンの存在下で熱安定性の
増加が認められた（第１図Ｃの黒丸）。

（７）阻害剤；本酵素は５Ｘ１０ ＭのＨｇＣ］□。

ＡｇＭＯ３＋ Ｃｕ５Ｏ、ＦｅＳＯ４，の存在下で、そ
れぞれ、約９８％、約９７％、約９５％、約６０％阻害
された。

（８）精製方法；本酵素は液体培養物の遠心上澄液から
、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー（ＫＣＩ濃度Ｏ〜０．２Ｍでグラジェント溶出
）、次いで、セファデックスＧ−１００カラムクロマト
グラフイー及び同カラムによる再クロマトグラフィーに
より、クロット的及び電気泳動的にはヌ゛均一にまで精
製された。

（９）分子量：セファデツクスＧ−１００を用いるゲル
過法により測定された本酵素の分子量は約２５０００で
あった。

（１０）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解さ
せた１％可溶性澱粉液（ｐＨ７，０） ０．５ｆｌに適
量の酵素を加え、水で全量１ｒｎｌとし、４０℃で反応
させる。

この条件で１時間に１■のグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量を１単位とした。

本酵素を生産する例示菌として、パシルス・ＹＴ−１０
０４を挙げる。

本微生物の菌学的性質は下記に示す通りであり、微工研
菌寄第５８５４号として、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

（１）形態；短桿菌、大きさ、巾０．５〜０．７μ×１
．７〜２．４μ、単桿菌、非運動性、ダラム陰性又はダ
ラム バリアプル （２）胞子；胞子前細胞のふくらみはあっても非常に少
ない、球形〜楕円形の胞子を形成する。

（３）ゼラチン；ゆっくり液化する。

（４）肉汁寒天；生育良好、表面スムース、黄色を帯び
る。

（５）グルコース肉汁寒天；肉汁寒天よりも生育不良
淡黄色 （６）グルコース硝酸寒天；生育わずか （７）肉汁；少し混濁、沈降する。

（８）食塩肉汁；食塩の存在は生育を促進する。

１０％食塩でも生育する。

（９）クエン酸寒天；生育わずか。

（１０）チロシン寒天；生育良好、黄色、チロシナーゼ
陰性 （１１）グルコース−アスパラギン寒天；生育わずか。

（１２）インドール；生成しない。

（１３）ミルク；ゆっくりと凝固、ペプトン化。

（１４）ポテト；生育わずか。

（１５）アセチルメチルカルビノール；生成する。

（１６）硫化水素；生成する。

（１７）硝酸塩の還元；陰性 （１８）ウレアーゼ；生成しない。

（１９）カラターゼ；生成する。

（２０） 澱粉の加水分解；陽性 停）炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、シュークロース、ラクトース、
マルトース、澱粉、グリコーゲンなどから生成するがガ
スの生成はなし。

［相］ 生育温度；最適生育温度３８〜４６℃、最高生
育温度約５０℃。

以上の菌学的諸性質について、Ｂ ｅｒｇｅｙ ’ｓＭ
ａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第７版及び第８版（ＴｈｅＷ
ｉｌｌｉａｍｓ ＆ＷｉｌｋｉｎｓＣｏｍｐａｎｙ、
１９５７年及び１９７４年）を参照し、同定した結果、
半画はバシルス ズブチーリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉＪｉｓ ）の変種の一種き考えられる。

本菌株は、アミラーゼＧ３の他にα−１，６−グルコシ
ダーゼ（プルラナーゼ）を同時に生産する能力があり、
この酵素がアミロペクチンの分岐結合であるα−１，６
−グルコシド結合を分解するため、澱粉やアミロペクチ
ンなどの分岐結合のある基質に対し、アミラーゼＧ３と
共同して作用し、澱粉からマルトトリオースを収量よく
生産するのに重要な役割をしている。

例えば、半画の生産するα−１，６−グルコシダーゼと
同時に反応を行った場合、マルトトリオースの収量は基
質の種類によっても異なるが、通常１０〜２５％増加す
る。

半画の生産するα−１，６−グルコシダーゼの酵素的性
質は下記に示す通りである。

（１）作用；プルランに存在するα−１，６−グルコシ
ド結合を分解し、マルトトリオースを生成する。

また、澱粉、アミロペクチングリコーゲン又はその派生
物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約６０℃（１％プルラン、０．０
５ＭＩ−ＩＪス緩衝液のもとて３０分間反応、第２図ｂ
）。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ約４〜約
１０の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６〜７にある（１
％プルラン、０．０５Ｍ緩衝液の下で４０℃で反応、第
２図ａ） （４）熱安定性；０．０５Ｍｔ−リス緩衝液（ｐＨ７，
０）のもとで、各温度で１０分間加熱後、残存活性を測
定した。

その結果、５０℃、１０分間の加熱では殆んど失活せず
、６０°Ｃ１１０分間の加熱で約７０％失活した。

（第２図Ｃ白抜き丸）（５） ５ ｐＨ安定性；ｐＨ約
５〜約１０で安定（０，１Ｍ緩衝液の下で室温（２５℃
）で放置後、残存活性を測定、第２図ｄ） （６）阻害剤；本酵素は５Ｘ１０”−３ＭのＨｇＣ］□
、ＡｇＮＯ３、ＣｕＳＯ４などにより、それぞれ約９８
％、約９８％、約８７％阻害された。

（７）安定化；カルシウムイオンの存在は本酵素の熱安
定性を増加する（第２図Ｃの黒丸） （８）精製方法；本酵素は液体培養物の上澄液から硫安
分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィ
ー（ＫＣ１０〜０．５Ｍでグラジェント溶出）、その後
セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイーに
よりクロマト的且つ電気泳動的にはゾ均一まで精製する
ことができる。

（９）分子量；セファデックスＧ−２００ゲル沢過法に
より測定された分子量は約５５万であった。

（１０）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解さ
せた１％プルラン液（ｐＨ７，０）０．５−に適量の酵
素を加え、水で全量１ｙｄとし４０℃で反応させる。

この条件で１時間に１７ｎ９のマルトトリオースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

本発明によるアミラーゼＧ３生産のための培養は、窒素
源さして、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
、コーン・ステイブ・リカー、大豆粕など通常に用いら
れる有機窒素源が使用され、また炭素源としては、澱粉
、デキストリン、マルトース、グルコース、シュークロ
ースなどが使用され、そして、これに補足する栄養源と
して無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩と各種金属
塩を含む培地が使用される。

培養はｐＨ約５〜９、温度２５〜５５℃で好気的に行な
われる。

アミラーゼＧ３及びプルラナーゼは菌体外に生産される
酵素であるので、培養終了後、ｒ過又は遠心分離して除
菌し、上澄液を回収する。

そして必要に応じ、濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムなど
による塩析によるか、又はアセトン、イソプロパツール
、エタノール、メタノールなどの有機溶剤を加えて、酵
素を沈澱物として収得、乾燥、保存する。

次に、本酵素による澱粉又はその派生物の糖化条件につ
いて記載する。

澱粉、アミロース、アミロペクチンはアミラーゼＧ３に
より糖化するに際し、ます液化される。

液化は酸又は液化酵素を用いて、常法に従い行なわれる
が、澱粉の液化度はマルトトリオースの収量に影響する
ので、マルトトリオース含量が高く且つマルトースやグ
ルコース含量の少ない糖化物を得るためには、液化澱粉
のＤＥ（液化度、固形分中の還元力をグルコースとして
表わした百分率）は小さい方、望ましくはＤＥ約２０以
下が望ましい。

このようなりＥの小さい液化澱粉を使用するとき、マル
トトリオースは５５〜６０％の収量で得ることかぎでき
る。

基質濃度は、通常５〜４０％で行なわれる。

反応−及び温度は、通常ｐＨ５〜７、温度４０−６０°
Ｃである。

本酵素はカルシウムイオンの存在により熱安定性が著し
く増加するので、糖化反応に際し、例えば塩化カルシウ
ムを５Ｘ１０ ’〜２Ｘ１０−２Ｍ程度添加する。

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 １ ２００ｍ容三角フラスコに、Ｋ２ＨＰＯ４０，３％、Ｍ
ｇ Ｓ ０４・７ Ｈ２Ｏ０，１％、魚肉エキス３％、
可溶性澱粉１％、硫酸マンガン５Ｘ１０ ’Ｍからな
る液体培地を入れ、常法により殺菌後、バシルス属菌株
（微工研菌寄第５８５４号）を接種し、３０℃で２日間
振盪培養した。

培養後、遠心分離機で除菌し、得られた上澄液について
、生産されたアミラーゼＧ３を測定した結果、培地−当
り８０．９単位であった。

そして、同時に生産されたプルラナーゼは培地−当り１
１．５単位であった。

培養上澄液に硫安を６０％飽和になるように加えて、沈
澱区分を集め、乾燥保存した。

本酵素剤にはアミラーゼＧ３の他にプルラナーゼが存在
しているので、アミラーゼＧ３は次の操※作で精製した
。

前記酵素剤を水に溶解後、遠心分離した上澄液について
、蒸留水に対して透析後、２．５Ｘ１０−３Ｍトリス緩
衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに吸着
後、同緩衝液で洗滌後、同緩衝液を含むＫＣＩ溶液でＯ
０〜０．５Ｍまでリニヤ−グラジェントにより溶出した
。

この結果、プルラナーゼを含まないアミラーゼＧ３を得
ることができた。

硫安沈澱物からの収量は約３０％であった。

該精製酵素液０．３１単位をＤＥ４．３の液化ポテト澱
粉溶液（固形分５０２■）に加え、塩化カルシウムを５
Ｘ１０−３Ｍ添加し、全量１ｒｎｌとして５０℃で反応
させた。

得られた糖化物の一部をペーパークロマトグラフ法によ
り３重展開（溶媒；ピリジン／ｎ−ブタノール／水−４
／６／３ ）後、各糖区分を切抜き、水で抽出後、フェ
ノール−硫酸法により定量した。

その結果、グルコース２．８％、マルトース１２．１％
、マルトトリオース５５．３％、マルトテトラオース４
．４％、その他のオリゴ糖２５．４％であった。

半画の生産するアミラーゼＧ３とα−１，６−グルコシ
ダーゼを分離せず、複合酵素として、ＤＥ４．３の液化
澱粉に加え、同様に反応させた結果、得られた糖化物の
糖組成は、グルコース５．３％、マルトース２０．０％
、マルトトリオース７０．０％、その他の糖４．７％で
あった。

実施例 ２ 澱粉、アミロース（平均重合度１７）、アミロペクチン
、グリコーゲン各１０■に０．７−の水を加え、加熱糊
化後、塩化カルシウム１×１０−２Ｍ、アミラーゼＧ３
１．７単位を加え、全量１ｒ／ｌｌとし、５０℃で２４
時間反応を行った。

得られた糖化物の糖組成を実施例１に従い定量した結果
、第２表に示す通りであった。

実施例 ３ ポテト澱粉をバシルス属の澱粉液化酵素（α−アミラー
ゼ、大和化成■製りライスターゼＫＭ）を用い、常法に
より液化し得られたＤＥｌ、４６、２．３８．４．２５
．５．８１．８，０５．１２．６及び２７．２の各液化
澱粉（乾物として５０２■）に、塩化カルシウム５Ｘ１
０−３Ｍ、 α−１，６−グルコシダーゼを分離した
精製アミラーゼＧ３ ３．３単位を加え、全量１ｒｒＬ
ｅ（ｐＨ７，０）とし、５０℃で４８時間反応させた反
応後、得られた糖化物について糖組成を定量した結果、
第１図に示す通りであった。

図から明らかなように、ＤＥ約１５以下の液化澱粉を使
用したときマルトトリオースは約５０％〜約６０％の収
量で得ることができた。

しかし、Ｄ Ｅ ２７．２の液化澱粉を使用したときの
マルトトリオースの収量は約４４．４％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂ、ｃとｄは、それぞれアミラーゼＧ３の最
適ｐＨ１最適温度、熱安定性とｐＨ安定性を示している
。 第２図は各種ＤＥの液化澱粉をアミラーゼＧ３で糖化し
たときの糖化物中のグルコース、マルトース、マルトト
リオースさマルトテトラオ・−ス含量を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 澱粉からマルトトリオースを生成するバシルス属ア
   ミラーゼＧ３を澱粉、アミロース、アミロペクチン、グ
   リコーゲン又はこれらの部分分解物に作用させることを
   特徴とするアミラーゼＧ３によるマルトトリオース含有
   糖液の製造法。