JPS6339234B2

JPS6339234B2 -

Info

Publication number: JPS6339234B2
Application number: JP14352085A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-06-29
Filing date: 1985-06-29
Publication date: 1988-08-04
Also published as: JPS6225992A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明はバシルス属細菌の生産する新規なアミ
ラーゼによるマルトテトラースの製造方法に関す
るものである。〔従来技術〕澱粉をグルコースに分解するグルコアミラー
ゼ，マルトースに分解するβ―アミラーゼやα―
アミラーゼは自然界に広く存在することが知らて
いるが、より分子量の大きい、例えば、マルトト
リオースＧ３，マルトテトラオースＧ４，マルト
ペンタオースＧ５マルトヘキサオースＧ６などの
オリゴ糖単位で切断するアミラーゼについての報
告は少ない。これらオリゴ糖は、食品の増量剤、賦形剤ある
いは甘味調整剤として注目されている。特に、Ｇ
４〜Ｇ７の各オリゴ糖は、診断用アミラーゼの活
性測定用基質としても注目されている。〔目的及び効果〕本発明者は、これらオリゴ糖の製造を確立する
ことを目的として、広く自然界より微生物の検索
を行つてきた結果、アミロース，アミロペクチ
ン，澱粉などのα―グルカンを特異的にマルトテ
トラオースＧ４に加水分解する新規なアミラーゼ
がバシルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）と同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。澱粉からマルトテトラオースを生成するアミラ
ーゼとしては、シユードモナススツツエリ
（Pseudomonas stuzeri）の生産するアミラーゼ
が、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端
からマルトテトラオース単位で加水分解すること
が知られている。しかし、この酵素はアミロペクチンやグリコー
ゲンからは高分子量のリミツトデキストリンを残
すと報告されている。〔アーカイブバイオケミ
ストリーアンドバイオフイジクス（Archive
Biochemistry and Biophysics）145巻105頁
（1971）〕。そして、この酵素による澱粉からのマ
ルトテトラオースの収量は約55％、アミロペクチ
ンからの収量は52％、と報告されている〔アメリ
カ合衆国特許USP3654082，（1972）、アミラーゼ
シンポジウム、６巻，31頁（1971）〕。しかるに、本発明のバシルス属細菌の生産する
アミラーゼは、澱粉から約65％〜75％の極めて高
い収量でマルトテトラオースを生成することが認
められた。マルトテトラオースの収量は、使用す
る澱粉の種類、液化度（DE）、酵素量などにより
影響されるが、通常、グルコース１〜５％，マル
トース５〜15％

〔構成〕

本発明は、澱粉からマルトテトラオースを主成
分として生成するアミラーゼＧ４を、澱粉，アミ
ロース，アミロペクチン，グリコーゲンまたは、
このらの部分分解物に作用させることを特徴とす
る。バシルス属アミラーゼＧ４によるマルトテト
ラオースの製造法に関するものである。以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明す
る。本発明により、生産される酵素は下記の酵素的
性質を有する。 (1) 作用；アミロース，アミロペクチン，グリコ
ーゲンなどのα―グルカンをマルトテトラオー
スを主成分とする分解物に分解する。本酵素は
エンド型の分解様式を持つα―アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約65〜
75％の収量でマルトテトラオースが得られる。 (2) 作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性
澱粉，0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適作用温度は約50℃
である。（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH；約４〜約12の広
い範囲に作用する。最適作用PHは６〜8.5であ
る（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶
性澱粉下で作用，第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の下
で加熱した場合、50℃，10分間の加熱で約40％
失活し、55℃，10分間の加熱で約85％失活した
〔第１図Ｃ〕。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH６〜９の範囲で安定であつた〔第１図
ｄ〕。 (6) 安定化；カルシウムイオンが存在するとき、
熱安定性の増加が認められた〔第１図Ｃの破
線〕。 (7) 阻害剤；本酵素は、５×10^-3MのHgCl₂，
CuSO₄，ZnSO₄，AgNO₃により、それぞれ、
約100％，約95％，約50％，約30％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、DEAE―セフアロース
（Sepharose）カラムクロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）A0.5mカラムクロマト
グラフイー及び同ゲルによる再クロマトグラフ
イーにより電気泳動的に均一まで精製すること
ができる。 (9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5mを用い
たゲル濾過法により測定した分子量は約１万で
あつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で１分間に1μモルのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位と
した。以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れているシユードモナススツツエリのマルトテ
トラオース生成アミラーゼと比較すると(1)最適作
用PHは、本発明の酵素はPH６〜8.5の広いPH範囲
にあるのに対し、シユードモナススツツエリの
酵素はPH８付近にあること、(2)本発明の酵素を澱
粉に作用させたとき、約65〜75％の収量でマルト
テトラオースが得られるのに対し、シユードモナ
ススツツエリの酵素の場合は約55％であるこ
と、(3)本発明の酵素の分子量は１万前後にあるの
に対し、シユードモナススツツエリの酵素は、
48000と58000にある〔バイオケミストリーアン
ドバイオフイジクスアクタ（Biochemistry
and Biophysics Acta）566巻，88頁（1979）〕な
ど、本発明の酵素とシユードモナススツツエリ
の酵素とは、澱粉からのマルトテトラオースの収
量、最適作用PH、分子量などの性質において、顕
著な違いのあるものであり、新規な酵素というこ
とができる。本発明の酵素を生産する例示菌として、バシル
スサーキユランス（Bacillus circulans）Ｇ―
４を挙げる。本菌の菌学的性質は下記に示す通り
であり、微工研条寄第820号として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；桿菌、巾0.5〜１×５〜6μ，運動性な
いし、グラム陰性。 (2) 胞子；通常、末端近くに１個、胞子嚢のふく
らみは認められない。 (3) 肉汁；混濁、沈降する。 (4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及
び表面凹凸あり。 (5) グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐
色。 (6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。 (7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。 (8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり
良くない。淡黄〜黄褐色。 (9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。 (10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。 (11) インドール；生成しない。 (12) カラターゼ；生成する。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) 硫化水素；生成しない。 (15) クエン酸；利用する。 (16) 硝酸塩の還元；陰性。 (17) クエン酸；利用する。 (18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生育
し、10％食塩でも少し生育する。 (19) 炭水化物の利用；Ｄ―グルコース，Ｄ―フ
ラクトース，Ｄ―マンノース，Ｌ―アラビノー
ス，Ｄ―リボース，マルトース，シユークロー
ス，澱粉などから酸を生成するが、ガスの生成
はない。Ｄ―キシロース，Ｌ―ラムノース，Ｌ
―ソルボースの利用性は良くない。 (20) 最適生育温度；26℃前後。 (21) 最高生育温度；約60℃ (22) 死滅温度；100℃で30分間加熱しても死滅
しない。以上の菌学的性質について、バージエイスマ
ニユアルオブデタミネーテイブバクテリオ
ロジー（Bergey's Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版〔ザウイ
リアムスアンドウイルキンスカンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、
（1957年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス
サーキユランス（Bacillus circulans）の一種
と同定し、バシルスサーキユランスＧ―４と命
名した。本発明によるアミラーゼＧ４を生産するための
培養は、窒素源として肉エキス，ペプトン，酵母
エキス，カゼイン，コーン・ステイープ・リカ
ー，大豆粕など、通常、微生物の培養に対し良く
用いられる有機窒素源が使用され、炭素源として
は、澱粉，デキストリン，マルトース，グルコー
ス，シユークロースなどが使用される。そして、
これに補足する栄養源として、無機窒素源，リン
酸塩，マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が
使用される。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好
気的に行われる。アミラーゼＧ４は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。必要により濃縮
し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、
または、アセトン，イソプロパノール，エタノー
ル，メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵素を
沈澱物として収得し、乾燥、保存する。アミラーゼＧ４を用いて、澱粉を糖化する反応
は次のようにして行う。澱粉は、酸または、α―
アミラーゼにより液化される。液化度はマルトテ
トラオースの収量に影響するので、望ましくは
DE20以下の液化澱粉が使用される（DEは固形分
中の還元力をグルコースとして表した百分率）。
基質濃度は、通常、５〜40％で行われる。反応PH
は、通常５〜９、温度は40〜60℃である。本酵素
は、カルシウムイオンの存在により、著しく熱安
定化されるので、糖化反応に際して、５×10^-4〜
２×10^-2M程度のカルシウム塩が添加される。アミラーゼＧ４による、澱粉、アミロペクチ
ン、グリコーゲンなどα―1.6―グルコシド結合
の分岐をもつ基質を用いる糖化反応においては、
イソアミラーゼあるいは、プルナラーゼなどのα
―1.6―グルシダーゼの存在下で反応を行うと、
糖化反応を促進するため、アミラーゼＧ４を節減
したり、また、マルトテトラオースのの収量を増
加することができる。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１ポリペプトン１％，リン酸２カリ0.3％，硫酸
マグネシウム（７水塩）0.1％，可溶性澱粉１％
からなる培地30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で10分間殺菌したのち、バチルス・サーキ
ユランスＧ４（微工研条寄第820号）を接種し、
30℃で４日間振盪培養（160rpm）した。培養後、遠心分離して得た上澄液について生産
されたアミラーゼＧ４を測定した結果、培地１ml
当たり6.4単位であつた。実施例２実施例１で得られた酵素液を使用して、澱粉の
糖化を行つた。基質としては、DE4.2の液化澱粉100mg（固形
分）に塩化カルシウム５×10^-3MとアミラーゼＧ
４を第２表に記載の通り、基質１ｇ当たり0.5〜
４単位加え、全量１mlとして、50℃で44時間反応
した。反応後、生成したマルトテトラオースを、
高速液体クロマトグラフ法により定量した結果は
第２表に示す通りであつた。

【表】酵素量4u／ｇ基質で、44時間目における糖化
物の糖組成は、グルコース0.0％，マルトース4.6
％，マルトトリオース0.0％，マルトテトラオー
ス72.6％，その他の糖22.8％であつた。実施例３実施例２において、アミラーゼＧ４の他に、ク
レブシラ（Klebsiella）属のプルラナーゼ（天野
製薬製）の共存下で反応を行つた。得られた結果
を第３表に示す。

【表】表から明らかなように、アミラーゼＧ４を用い
て澱粉を糖化するのに際し、プルラナーゼを共存
させて反応を行うと、糖化が促進され、マルトテ
トラオース含量の高い糖化物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄはそれぞれ、アミラーゼ
Ｇ４の最適作用温度、最適作用PH、熱安定性とPH
安定性を示す。第２図は、高速液体クロマトグラ
フにより分離した糖化物の糖組成を示す。１；グルコース、２；マルトース、３；マルト
トリオース、４；マルトテトラオース。

Claims

【特許請求の範囲】

１澱粉から、マルトテトラオースを主成分とし
て生成するバシルス属アミラーゼＧ４を、アミロ
ース、アミロペクチン、グリコーゲンまたは、こ
れらの部分分解物に作用させることを特徴とする
アミラーゼＧ４によるマルトテトラオースの製造
法。