JPS62126994A

JPS62126994A - マルト−スの製造方法

Info

Publication number: JPS62126994A
Application number: JP60265859A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; 高崎　義幸
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1987-06-09
Also published as: JPH0253034B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、新規なアミラーゼによるマルトースの製造方
法に関するものである。

〔従来技術〕

現在、マルトースは液化澱粉に植物、バシルス起源のβ
−アミラーゼを作用させるか、あるいはアスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）７ｊＣなどの微生物の生産
する糖化型α−アミラーゼを作用させることにより製造
されている。これらの酵素はアミロペクチンのα−１，
６−グルコシド結合は分解することができないため、ア
ミロペクチンやこれを含む液化澱粉からのマルトースの
収量は、通常５０〜６０％である。そして、これ以上に
収量よくマルトースを得るためには、α−１，６−グル
コシド結合を分解する、プルラナーゼやイソアミラーゼ
などのα−１，６−グルコシダーゼが併用される。

〔目　　的〕

本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生成する新
規なアミラーゼを求めて微生物の検索を行ってきた結果
、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｃｇ
ａｔ、ｃｒｉｕｍ）と同定した細菌が澱粉をその非還元
性末端からマルトース単位で切断し、α−マルトースを
生成する新規なアミラーゼを生成することを認め、この
酵素をアミラーゼＧ２と命名した。

本酵素と従来、マルトースを特異的に生成する酵素とし
て知られているβ−アミラーゼとの比較は第１表に示す
通りである。

両酵素の最も大きな違いは、β−アミラーゼがβ−マル
トースを生成する加水分解を行うのに対し、アミラーゼ
Ｇ２はα−マルトースを生成する加水分解を行うことで
ある。この切断様式の違いのため、アミラーゼＧ２によ
りアミロペクチンまたはこれを含む澱粉の糖化を行うと
き、β−アミラーゼに比べて２〜３％マルトース収量が
高くなることがわかった。しかし、この酵素はアミロペ
クチンのα−１，６−グルコシド結合を分解することは
できないため、澱粉がらのマルトースの収量は６０％前
後である。そして、これ以上に高い収量でマルトースを
得るためには、アミロペクチンのα−１゜６−グルコシ
ド結合を分解するイソアミラーゼやプルラナーゼと併用
する必要があった。しかるに、本発明者は、先に発明し
た澱粉がらマルトテトラオースを特異的に生成する新規
なアミラーゼＧ４（特許出願中）をアミラーゼＧ２と併
用して用いるとき、澱粉から７０％以上の収量でマルト
ースが得られることを認めた。本発明は、この知見に基
づいてなされたものである。

〔構　　成〕本発明は、澱粉又はその派生物である液化澱粉に、バシ
ルス属細菌の生産するアミラーゼＧ２とアミラーゼＧ４
を作用させることを特徴とするマルトースの製造方法に
関するものである。

以下に、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明において使用されるアミラーゼＧ２とアミ
ラーゼＧ４の酵素的性質を記載する。

（Ａ）アミラーゼＧ２の酵素的性質（１）作用；　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その非還元性末
端からマルトース単位で加水分解する。生成糖はα−マ
ルトースであることからα−アミラーゼの一種と考えら
れるが。

エンド型の分解作用を示さず、アミロペクチン、グリコ
ーゲンからはリミットデキストリンを残す。サイクロデ
キストリンを分解せず、またマルトトリオースの分解力
も弱い。生成糖がα−型であることを除けば、植物や細
菌のβ−アミラーゼに似ているが、アミロペクチンやこ
れを含む澱粉に対する分解限度は２〜３％高い。

（２）作用温度範囲及び最適温度；　１％可溶性澱粉、
０．０５Ｍリン酸ａ衝液の下で作用させたとき、約７５
℃まで作用し、最適温度は約６０’Ｃである（第１図（
ａ））。

（３）作用ｐＨ範聞及び最適ＰＨ；　　約３〜約１１の
広いｐｌ！範囲に作用する。最適ｐＨは約７〜７．５で
ある（０．０５Ｍリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の下で
作用、（第１図（ｂ））。

（４）熱安定性；　　０．０５Ｍ　トＩＪ　ス緩衝液（
ｐ＋＋７．０）ノ下で加熱した場合、５０℃、１０分間
の加熱までは失活が認められない。６０”Ｃ１０分間の
加熱で約１０％失活し、６５℃１０分間の加熱で約７０
％失活し、そして、６０℃１０分間の加熱で９０％以上
失活した（第１図（Ｃ））。

（５）ｐＨ安定性；　　０．１Ｍ緩衝液（７）下、室温
（３０℃）テ３時間放置後、残存活性を測定した。その
結果、ｐＨ４，５〜８の範囲で安定であった〔第１図（
ｄ）〕。

（６）安定化；　カルシウムイオンによる熱安定性の増
加は認められなかった。

（７）阻害剤；　本酵素は、ｌＸｌ０−３Ｍの）！ＥＣ
Ｉ　２、ＡｇＮ０３　、　Ｃｕ５Ｏ４、Ｎ１５Ｏ４によ
り、それぞれ約８５％、約７５％、約７０％、約６０％
阻害された。また、ｌＸｌ０−’Ｍのｐ−クロロマーキ
ュリベンゾエートにより約７０％阻害された。

（８）精製方法；　本酵素は、液体培養液の上澄から、
硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラ
フィー、同カラムによる再クロマトグラフィーとバイオ
ゲルＡ０．５ｍによるカラムクロマトグラフィーにより
、ディスク電気泳動的に均一まで精製することができる
。

（９）分子量；　セファデックスＧ−２００により測定
した分子量は約６０，０００であった。

（１０）力価測定法；　　０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
させた２％可溶性澱粉０．５ｍＱに、適量の酵素を加え
、水で全１１ｍ１２とし、４０℃で反応させる。

この条件で、１分間に１μモルのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、従来、知られている植物起
源のβ−アミラーゼ及びバシルス屈のβ−アミラーゼは
β−マルトースのみを生成するのに対し、アミラーゼＧ
２はα−マルトースのみを生成する。バシルスステアロ
サーモフィラス（［１ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ、ｃａｒｏ
ｔ、ｈｃｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアミラーゼはアミラー
ゼＧ２と同様に、α−マルトースを生成するが、反応初
期には、マルトテトラオースやマルトトリオース、及び
微量のマルトヘキサオースやマルトペンタオースを生成
すると報告されている。

従って、これら酵素はアミラーゼＧ２とは本質的に異な
った酵素ということができる。また、Ｑ適ｐ１１゜最適
温度、分子量などの性質においても差が認めらることが
ら、アミラーゼＧ２は新規な酵素ということができる。

（Ｂ）アミラーゼＧ４の酵素的性質（１）作用；　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオースを主成分
とする分解物に分解する。本酵素はエンド型の分解様式
を持つα−アミラーゼの一種であり、液化澱粉に作用さ
せるとき、約６５〜７５％の収量でマルトテトラオース
が得られる。

（２）作用温度範囲及び最適温度；　１％可溶性澱粉、
０．０５Ｍリン酸緩衝液の下で作用させたとき、約７５
℃まで作用し、最適作用温度は約５０℃である（第２図
（ａ））。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適ｐＨ；　　約４〜約１２の
広い範囲に作用する。最適作用ｐＨは６〜８．５である
（０．０５Ｍ酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉
の下で作用、（第２図（ｂ））。

（４）熱安定性；　　０．ＩＭｌ−リス緩衝液（ｐ＋−
＋７．０）の下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加
熱で約４０％失活し５５５°Ｃ１１０分間の加熱で約８
５％失活した〔第２図（Ｃ）〕。

（５）ｐｕ安定性；　　０．１Ｍ緩衝液の下で、室温（
２５°Ｃ）で３時間放置後、残存活性を測定した。その
結果、ｐ］１６〜９の範囲で安定であった〔第２図（ｄ
）〕。

（６）安定化；　カルシウムイオンが存在するとき、熱
安定性の増加が認められた〔第２図（Ｃ）の破線〕。

（７）阻害剤；　本酵素は、５　Ｘ　１０−３ＭのＨｇ
Ｃ１２、ＣｕＳ０４、Ｚｎ５Ｏ４、ＡｇＮｏ　３．によ
り、それぞれ約１００％、約９５％、約５０％、約３０
％阻害された。

（８）精製方法；　本酵素は、液体培養物の遠心上澄液
から、硫安分画、　ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｃｐｈ
ａｒｏｓｃ）カラムクロマトグラフィーとバイオゲル（
Ｂｉｏｇｃｌ）、ＡＯ１５ｍカラムクロマトグラフィー
及び同ゲルによる再クロマトグラフィーにより、電気泳
動的に均一まで精製することができる。

（９）分子量：　バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａｏ、５
ｍを用いたゲル濾過法により測定した分子量は約１万で
あった。

（ｌＯ）力価測定法；　　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｏ
７．０）に溶解させた２％可溶性紐粉０．５ｍＱに、ｉ
ａ址の酵素を加え、水で全量１ｍ１２とし、４０℃で反
応させる。この条件で、１分間に１μモルのグルコース
に相冴する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、シュードモナススツッツェ
リのマルトテトラオース生成アミラーセト比較すると　
（１）最適作用ｐＨは、アミラーゼＧ４ハｐＨ６〜８．
５の広いｐＨ範囲にあるのに対し、シュードモナススッ
ッツェリの酵素はｐｌ−１８付近にあること、（２）ア
ミラーゼＧ４を澱粉に作用させたとき、約６５〜７５％
の収量でマルトテトラオースを得られるのに対し、シュ
ードモナナスッッツェリの酵素の場合は約５５％である
こと、（３）アミラーゼＧ４の分子量は１万前後にある
のに対し、シュードモナススッッツェリの酵素は、４８
，０００と５８，０００にある〔バイオケミストリーア
ンドバイオフィジックスアクタ（Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｊ
ｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ａｃｔａ）５６
６巻、８８頁（１９７９）　）など、アミラーゼＧ４と
シュードモナススッッツェリの酵素とは、澱粉からのマ
ルトテトラオースの収量、最適作用ρ１１、分子量など
の性質において顕著な違いのあるものであり、新規な酵
素ということができる。

アミラーゼＧ２を生産する例示菌として、バシルスメガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔ、ｃｒｉｕＩ
ＩＩ）Ｇ−２を挙げる。この菌株は微工研菌寄第７９７
８号として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

また、アミラーゼＧ４を生産する例示菌として、バシル
スサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａ
ｎｓ）Ｇ４を挙げる。この菌株は微工研菌寄第８２０号
として、微生物工業技術研究所に寄託されている。これ
ら微生物の菌学的性質は下記に示す通りである。

（Ａ）アミラーゼＧ２生産菌の菌学的性質（１）形態；
　巾０．７〜１．３　Ｘ　２．４〜５．０μ、通常２個
以上連なり、短鎖状に生成する。ダラム陰性。

（２）胞子；　両末端近くに２個。胞子をもつ細胞のふ
くらみは殆んど認められない。

（３）生育ｉ　好気的に生育。嫌気下では殆んど生育は
認められない。

（４）肉汁；　混濁、沈降する。

（５）肉汁寒天；　生育良好、表面なめらか、淡褐色を
示すが、色素の生成なし。

（６）グルコース肉汁寒天；　肉汁培地よりよく生育す
る。

（７）グルコース硝酸塩寒天；　よく生育する。表面な
めらか。淡褐色を示す。

（８）チロシン寒天；　褐色色素を生成する。

（９）グルコース・アスパラギン寒天；　かなりよく生
育する。

（１０）ポテト；　生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。

（１１）クエン酸の利用；　陽性。

（１２）澱粉の加水分解；　陽性。

（１３）アセチルメチルカルビノール；　生成しない。

（１４）ゼラチン；　分解する。

（１５）ミルク；　凝固し、ペプトン化する。

（１６）硝酸塩の還元；　陽性。

（１７）カタラーゼ；　陽性。

（１８）炭水化物の利用；　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
グ１−−ス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−
リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビ１−−ル、マ
ルトース、蔗糖などを利用し、いずれもガスを生成する
ことなく生成する。

（１９）最適生育温度；４０°Ｃ前後。

（２０）Ｑ高生育温度；　約５０℃。

（２１）死滅温度；１００℃、２０分間の加熱でも死滅
しない。

以上の菌学的性質について、バージェイスマニュアルオ
ブデタミネーティブバクテリオロジー（Ｂｃｒｇａｙ’
ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔ、ｃｒｍｉｎ
ａｔ、１ｖａＢａｃｔ、ｃｒｉｏｌｏｇｙ）の第７版及
び第８版（ザウィリアムスアンドゥイルキンスカンパニ
ー（Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ
　Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９５７年及び１９７４年）を参
照し、本菌をバシルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｃｇａシｃｒｉｕｍ）の菌株と同定するのが適当と考
えられ、本菌株をバシルスメガテリウムＧ−２と命名し
た。

（Ｂ）アミラーゼＧ４生産菌の菌学的性質（１）形態；
　桿菌、巾０．５〜１×５〜６μ、運動性なし、ダラム
陰性。

（２）胞子：　通常、末端近くに１個、胞子嚢のふくら
みは認められない。

（３）肉汁；　混濁、沈降する。

（４）肉汁寒天；　生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及び
表面凹凸あり。

（５）グルコース肉汁寒天；　生育良好、淡黄〜淡褐色
。

（６）グルコース硝酸寒天；　生育悪い。

（７）ポテト；　生育良好、乳白色に生育。

（８）グルコース・アスパラギン寒天；　生育あまり良
くない。淡黄〜黄褐色。

（９）チロシン寒天；　良く生育する、わずかに褐色。

（１０）ミルク；　ゆっくり凝固、ペプトン化。

（１１）インドール；　生成しない。

（１２）カタラーゼ；　生成する・（１３）アセチルメチルカルビノール；　生成しない。

（１４）硫化水素；　生成しない。

（１５）クエン酸；　利用する。

（１６）硝酸塩の還元；　陰性。

（１７）クエン酸：　利用する。

（１８）食塩肉汁；　８％食塩含有培地までよく生育し
１０％食塩でも少し生育する。

（１９）炭水化物の利用；　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リ
ボース、マルトース、シュークロス、澱粉などから酸を
生成するが、ガスの生成はない。Ｄ−キシロース、し−
ラムノース、し−ソルボースの利用性は良くない。

（２０）Ｑ適生育温度；２６°Ｃ前後。

（２１）最高生育温度；　約６０°Ｃ０（２２）死滅温
度；１００°Ｃ１で３０分間加熱しても死滅しない。

以上の菌学的性質について、バージェイスマニュアルオ
ブデタミネーティブバクテリオロジー（Ｂｃｒｇｃｙ’
ｓ　Ｍａｍｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｃｔｅｒｍｉｎａｊｉｖ
ａＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の第７版及び第８版〔ザ
ウィリアムスアンドゥイルキンスカンパニー（Ｔｈｅ　
Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａ
ｎｙ））　、　（１９５７年及び１９７４年）を参照し
、本菌をバシルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｉｒｃｕｌａｒ＋＋）の一種と同定し、バシルスサーキ
ュランスＧ−４と命名した。

アミラーゼＧ２及びアミラーゼＧ４を生産するための培
養は、通常、液体培地により通気、攪拌培養より行われ
る。培地の窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母
エキス、カゼイン、コーンステイープリカー、大豆粕な
ど、通常、微生物の培養に際し、よく用いられる有機窒
素源、及びこれに補足する窒素源として、塩化アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、硝酸塩などの無機窒素源が
用いられる。炭素源としては、澱粉、デキストリン、マ
ルトース、グルコース、シュークロスなどが使用される
。培養は、ｐ１１５〜９、温度２０〜６０℃で好気的に
行われる。

アミラーゼＧ２及びＧ４は、いずれも菌体外に生産され
る酵素であるので、培養終了後、濾過または遠心分離に
より除菌し、上澄液を回収する。

培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモニウム、
硫酸ナトリウムによる塩析によるか、または、アセトン
、イソプロパツール、エタノール、メタノールなどの有
機溶剤を加えて、酵素を沈澱物として収得し、乾燥、保
存する。

アミラーゼＧ２及びアミラー亡４を組合せて行う澱粉の
糖化反応は、次のようにして行う。

澱粉は、通常、あらかじめ酸または液化型α−アミラー
ゼにより液化される。液化度はマルトースの収量に影響
し、なるべく低ＤＥであることが望ましい。通常、ＤＥ
５以下の液化澱粉が使用される。

基質濃度は、通常５〜４０％で行われ、反応は、通常ｐ
ｉｔｓ〜８、温度は４０℃〜６０°Ｃで行われる。アミ
ラーゼＧ４はカルシウムイオンの存在により熱安定化さ
れるので、糖化に際し１通常５ＸｌＯ−４〜２Ｘ１０−
２Ｍ程度のカルシウム塩が添加される。

アミラーゼＧ２とアミラーゼＧ４は同時に澱粉に作用さ
せるのが望ましいが、あらかじめ、アミラーゼＧ２で糖
化し、反応途中でアミラーゼＧ４を添加して反応を継続
するか、あるいは、最初、アミラーゼＧ４で反応を開始
し１次いでアミラーゼＧ２を添加して反応を行なう。

次に、実施例により、本発明の詳細な説明する。

実施例１（１）アミラーゼＧ２の生産大豆タンパク２％、米ヌカ２％、に２ＨＰ０４０．３％
、ＭｇＳＯ４・７＋＋　２ｏ　０１１％、可溶性澱粉２
％、ＣａＣｌ２１Ｘ１０−　’　Ｍ、ＭｎＣ１２１ＸＩ
Ｏ−’　Ｍ、ＣｕＳＯ４２，５Ｘ１０−　’　Ｍ、Ｆｃ
Ｃ１□２．５ＸＩＯ−’　Ｍ、ラウリル硫酸ナトリウム
２．５ＸｌＯ−”％からなる培地（ｐＨ７，０）３０ｍ
　Ｑを２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、１２０℃で
１５分間殺菌後、バシルス　メガテリウム（微工研菌寄
第７９７８号）を接種し、３０°Ｃで３日間振盪培養（
１６０ｒｐＩＩ＋）シた。培養後、遠心分離して得た上
澄液について、生産されたアミラーゼＧ２活性を測定し
た結果、培地１ａ＋Ｑ当り、９．０単位であった。

（２）アミラーゼＧ４の生産ポリペプトン１％、リン＃２カリ０．３％、硫酸マグネ
シウム（７水塩）０．１％、可溶性澱粉１％からなる培
地３０ｖｓ　Ｑを２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、
１２０℃で１０分殺菌したのち、バチルスサーキュラン
スＧ４（微工研条寄第８２０号）を接種し、３０℃で４
日間振盪培養（１Ｇｏｒｐｍ）　した。

培養後、遠心分離して得た上澄液について、生産された
アミラーゼＧ４を測定した結果、培地１ｍＱ当り、６．
４単位であった。

バシルス・ズブチルスのα−アミラーゼを用いて、常法
により液化した、ＤＥ４．２のポテト液化澱粉１ｇ（固
形分として）に、アミラーゼＧ４を４単位。

又ハ／及びアミラーゼＧ２を４単位、ＣａＣ（１２５Ｘ
１０−３Ｍ量を加え、水で全景１０ｍ　Ｑとし、　ＰＨ
７付近、５０℃で２０時間反応を行った。反応後、糖化
糖中の糖組成を液体クロマトグラフ法により測量した。

得られた結果は第２表に示す通りであった。

第２表（Ｇ１．　Ｇ２、Ｇ３及びＧ４は、それぞれグルコース
の１．２．３及び４ｉ体を示す。）

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）、　（Ｃ）と（ｄ）は、それぞれ
アミラーゼＧ２の最適ｐａ１．最適温度、熱安定性とｐ
）１安定性を示している。第２図（ａ）、（ｂ）、　（ｃ）と（ｄ）はそれぞれア
ミラーゼＧ４の最適ｐＨ，最適温度、熱安定性とＰ）Ｉ
安定性を示している。才１薗

Claims

【特許請求の範囲】

澱粉又はその派生物に、バシルス属細菌の生産するアミ
ラーゼＧ２とアミラーゼＧ４を作用させることを特徴と
するマルトースの製造方法。