JPS5933359B2

JPS5933359B2 - アミラ−ゼｇ３によるマルトトリオ−スの製造方法

Info

Publication number: JPS5933359B2
Application number: JP12701382A
Authority: JP
Inventors: 義幸高崎
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-07-21
Filing date: 1982-07-21
Publication date: 1984-08-15
Also published as: JPS5917993A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、澱粉からマルトトリオースを主成分とする糖
化物の製造方法に関するものである。

従来、アミラーゼとしては、澱粉をその非還元性末端か
らグルコース単位に分解するグルコアミラーゼ、マルト
ース単位に分解するβ−アミラーゼや澱粉をその内部銀
から切断するα−アミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの工業的製造に使用されている。

そして最近は、より分子量の大きい、例えばマルトトリ
オース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）マルトペ
ンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）など
のオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらのオリゴ糖は食品の増量剤、賦形剤、包接剤なと
、食品、医薬及び工業製品に広く製造できるものと考え
られているが、末だ製法は確立されていないと云っても
過言ではない。

本発明者は、これらオリゴ糖の製法を開発することを目
的として、澱粉よりこれらオリゴ糖を特異的に生産する
アミラーゼの探索を行ってきた結果、バチルス属の微生
物が、澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖化物に
分解するアミラーゼを生産することを認めた。

澱粉からマルトトリオースを特異的に生成するアミラー
ゼおしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕ
ｓの生産するＮ−Ａ４６８酵素（特公昭５７−６９１
５、特開昭１１００４９、澱粉化学、第２３巻、第３号
、第１７５〜１８１頁（１９７９））が知られている。

しかしこの酵素は、β−アミラーゼと同様に澱粉をマル
トトリオース単位でｅｘ。

型で分解するアミラーゼであり、反応生成物中の糖は殆
んどマルトトリオースのみであると報告されている。

しかるに、本発明の酵素は分解生成糖がα−糖であるこ
とがらα−アミラーゼの一種であり、澱粉を最終的には
法度反応が殆んど消失するまで、主としてマルトトリオ
ースを含む分解物に分解するアミラーゼであり、ポテト
澱粉糖化物の糖組成の一例は第１表に示す通りである。

この他、酵素の最適温度、熱安定性、ｐＨ安定注分子量
などの酵素的性質においても著しい差異が認められるも
のである。

また、従来知られている多くのび一アミラーゼは澱粉分
解産物の一つさしてマルトトリオースを生成するが、マ
ルトトリオースのみを特異的に大量生成するものではな
い。

本発明のアミラーゼは、第１表から明らかなように、マ
ル）１．ｌＪオースを６０％以上の高収量で生産すると
いう極めて特徴のあるアミラーゼであって、本発明者は
この酵素をアミラーゼＧ３（ｌ！ｌ：名命した。

以下に本酵素の酵素的性質を記載する。アミラーゼＧ３
の酵素的性質（１）作用；澱粉、アミロース、アミロペクチン、デデ
キストリンなどのグルカンをマルトトリオースを主成分
とする分解物に分解する。

生成糖はα−型であって、本酵素はα−アミラーセの一
種と考えられるものである。

澱粉及び液化でん粉からのマルトトリオースの収量は約
５０〜約６５％である。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約５０℃である（１％澱粉濃度、
最適作用ｐＨで３０分間反応、第１図ｂ）。

（３）作用ｐ）Ｉ範囲及び最適作用ｐＨ；ｐＨ約４〜
約１１の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６〜７、（第１
図ａ）。

（４）熱安定性；０．０５Ｍ’トリス緩衝液（ｐＨ７，
０）の存在下で加勢した場合、５０℃、１０分間の加熱
で約７０％失活し、６０℃、１０分間の加熱で９０％以
上失活する。

（第１図Ｃの白抜き丸）。

（５）ｐＨ安定性；０．１Ｍ緩衝液の下で、室温（
２５℃）で３時間放置後、残存活性を測定したその結果
、ｐＨ約６〜約９の範囲で安定であった（第１図ｄ）。

（６）安定化；カルシウムイオンの存在下で熱安定性の
増加が認められた（第１図Ｃの黒丸）。

（力阻害剤；本酵素は５Ｘ１０−３ＭのＨｇ（３
１□。

ＡｇＮＯ３，０ｕＳＯ４、ＺｎＳ０４ｔＦｅＳＯ４ｔ
の存在下で、それぞれ、約９８％、約８０％、約９７％
、約９５％、約６０％阻害された。

（８）精製方法；本酵素は液体培養物の遠心上澄液から
、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー（ＫＯＩ濃度Ｏ〜０．２Ｍでグラジェント溶出
）、次いで、セファデックスＧ−１００カラムクロマト
グラフイー及び同カラムによる再クロマトグラフィーに
より、クロマト的及び電気泳動的にはゾ均一にまで精製
された。

（９）分子量；セファデックスＧ−１００を用いるゲル
沢過法により測定された本酵素の分子量は約２５０００
であった。

（１０）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解さ
せた１％可溶性澱粉液（ｐＨ７，０）０．５ＴＬｌに
適量の酵素を加え、水で全量１ｙｄとし、４０℃で反応
させる。

この条件で１時間に１ｍｙのグルコースに和尚する還元
力を生成する酵素量を１単位とした。

本酵素を生産する例示菌として、バシルス・ＹＴ−１０
０４を挙げられ、本微生物の菌学的性質は下記に示す通
りであり、微生物菌寄第５８５４号として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。

（１）形態；短桿菌、大きさ、巾０．５〜０．７μ×１
．７〜２．４μ、単桿菌、非運動性、グラム陰性、又は
グラムバリアプル。

（２）胞子；胞子前細胞のふくらみはあっても非常に少
ない、球形〜楕円形の胞子を形成する。

（３）ゼラチン；ゆっくり液化する。

（４）肉汁寒天：生育良好、表面スムース、黄色を帯び
る。

（５）グルコース肉汁寒天；肉汁寒天よりも生育不良淡
黄色。

（６）グルコース硝酸寒天；生育わずか。

（７）肉汁；少し混濁、沈降する。

（８）食塩肉汁；食塩の存在は生育を促進する。

１０％食塩でも生育する。

（９）クエン酸寒天；生育わずか。

Ｃｌ０）チロシン寒天；生育良好、黄色、チロシナ
ーゼ陰性。

０１）グルコース−アスパラギン寒天；生育わずか。

（１２１インドール；生成しない。

。（１３）ミルク；ゆっくりと凝固、ペプトン
化。

ａ滲ポテト；生育わずか。

α■ アセチルメチルカルビノール；生成する。

（１６）硫化水素：生成する。

αの硝酸塩の還元；陰性。

Ｏａウレアーセ；生成しない。

０カタラーゼ；生成する。

（イ）澱粉の加水分解：陽性。

Ｃυ 炭水化物の利用：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロ
ース、Ｌ−アラビノース、シュークロース、ラクトース
、マルトース、澱粉、グリコーゲンなどから生成するが
ガスの生成はなし。

（２２）生育温度；最適生育温度３８〜４６℃、最高生
育温度約５０℃。

以上の菌学的諸性質について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎ
ｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第７版及び第８版（ＴｈｅＷｉ
ｌｌｉａｍｓ＆ＷｉＩ−ｋｉｎｓＣｏｍｐａｎ
ｙ、１９５７年及び１９７４年）を参照し、同定した
結果、車両はバシルスズブチリス（１３ａｃｉｌｌｕ
ｓ５ｕｂｔｉｌｉｓ）の変種の一種々考えるのが受
光と思われた。

本菌株は、アミラーゼＧ３の他（こα−１，６−グルコ
シダーゼ（プルラナーゼ）を同時に生産する能力があり
、この酵素がアミロペクチンの分岐結合であるα−１，
６−グルコシド結合を分解するため、澱粉やアミロペク
チンなどの分岐結合のある基質に対し、アミラーゼ０３
き共同して作用し、澱粉からマルトトリオースを収量よ
く生産するのに重要な役割をしている。

例えば、車両の生産するα−１，６−グルコシダーゼと
同時に反応を行った場合、マルトトリオースの収量は基
質の種類によっても異なるが、通常１０〜２５％増加す
る。

車両の生産するα−１，６−グルコシダーゼの酵素的性
質は下記に示す通りである。

１１）作用；プルランに存在するα−１，６−グルコシ
ド結合を分解し、マルトトリオースを生成する。

また、澱粉、アミロペクチングリコーゲン又はその派生
物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約６０℃（１％プルラン、０．ｏ
ｓＭトｌＪス緩衝液のもとて３０分間反応）。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐｉ（；ｐＨ約４〜
約１０の範囲に作用し、最適作用ｐＨは６〜７にある（
１％プルラン、０．０５Ｍ緩衝液の下で４０℃で反応）
。

（４）熱安定性；０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐｌ（７，
０）のもとで、各温度で１０分間加熱後、残存活性を測
定した。

その結果、５０℃、１０分間の加熱では殆んど失活せず
、６０℃、１０分間の加熱で約７０％失活した。

（５）ｐＨ安定性ｚＰＨ約５〜約１０で安定（０
，１Ｍ緩衝液の下で室温（２５℃）で放置後、残存活性
を測定）。

（６）阻害剤；本酵素は、５Ｘ１０−３ＭのＨｇＯ
１２゜ＡｇＮＯ３，ＣｕＳＯ４などにより、それぞれ約
９８％、約９８％、約８７％阻害された。

（７）安定化；カルシウムイオンの存在は本酵素の熱安
定性を増加する。

（８）精製方法；本酵素は液体培養物の上澄液から硫安
分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムりロマトグラフ
イー（ＫＯ１０〜０，５Ｍでグラジェント溶出）、その
後セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイー
によりクロマト的且つ電気泳動的にはゾ均一まで精製す
ることができる。

（９）分子量；セファデックスＧ−２００ゲル濾過法に
より測定された分子量は約５５万であった。

（１０）力価測定法；０．ＩＭＩＪン酸緩衝液に溶解さ
せた１％プルラン液（ｐＨ７，０）０．５７７１７！
に適量の酵素を加え、水で全量１ｍとし、４０℃で反応
させる。

この条件で１時間に１ｍｙのマルトトリオースに和尚す
る還元力を生成する酵素量を１年位とした。

車両の生産するプルラナーゼ以外にも、例えばエーロバ
クター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏ
ｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ−ｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）属やバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の生
産するプルラナゼやシュードモナス・アミロデラモサ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ
）の生産するイソアミラーゼなどのび−１，６−グ
ルコシダーゼも同時に使用することができる。

α−１，６−グルコシダーゼは、通常、アミラーゼ’Ｇ
３と同時に使用されるが、アミラーゼＧ３による糖化前
に、α−１，６−グルコシダーゼで処理してもよい。

アミラーゼＧ３により液化澱粉を糖化してマルトトリオ
ースを製造するに際し、これらα−１，６−グルコシダ
ーゼで処理すると、無処理の場合に比べ、マルトトリオ
ースの収量は１０〜２０％増加する。

本発明によるアミラーゼＧ３生産のための培養は、窒素
源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
、コーン・ステイブ・リカー、大豆粕など通常に用いら
れる有機窒素源が使用され、また炭素源としては、澱粉
、デキストリン、マルトース、グルコース、シュークロ
ースなどが使用され、そして、これに補足する栄養源と
して無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩と各種金属
塩を含む培地が使用される。

培養はｐＨ約５〜９、温度２５〜５５℃で好気的に行な
われる。

アミラーゼＧ３及びプルラナーゼは菌体外に生産される
酵素であるので、培養終了後、ｆ過又は遠心分離して除
菌し、上澄液を回収する。

そして必要に応じ、濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムなど
による塩析によるか、又はアセトン、インプロパツール
、エタノール、メタノールなどの有機溶剤を加えて、酵
素を沈澱物として収得、乾燥、保存する。

本酵素による澱粉の糖化は、通常５〜４０％の液化澱粉
の下で、ｐＨ５，５〜８、温度４０〜６０℃で行なわれ
る。

実施例１２００ｍ１容三角フラスコに、Ｋ２ＨＰＯ，０，３％。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、魚肉エキス３％、可溶
性澱粉１％、硫酸マンガン５Ｘ１０−５Ｍからなる
液体培地を入れ、常法により殺菌後、バシルスＹＴ−１
００４（微工研菌寄第５８５４号）を接種し、３０℃で
２日間振盪培養した。

培養後、遠心分離機で除菌し、得られた上澄液について
、生産されたアミラーゼＧ３を測定した結果、培地ｍｌ
当り８０．９単位であった。

そして、同時に生産されたプルラナーゼは培地ｄ当り１
１．５単位であった。

培養上澄液に硫安を６０％飽和になるように加えて、沈
澱区分を集め、乾燥保存した。

本酵素剤にはアミラーゼＧ３の他にプルラナーゼが存在
しているので、アミラーゼＧ３は次の操作で精製した。

前記酵素剤を水に溶解後、遠心分離した上澄液について
、蒸留水に対して透析後、２．５Ｘ１０−３Ｍトリ
ス緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに
吸着後、同緩衝液で洗滌後、同緩衝液を含むＫＯＬ溶液
で０〜０．５Ｍまでリニヤ−グラジェントにより溶出し
た。

この結果、プルラナーゼを含まないアミラーゼＧ３を得
ることができた。

硫安沈澱物からの収量は約３０％であったっ該酵素剤３
．３単位をＤＢ４．２５の液化ポテト澱粉液（固形分５
０■）に添加し、これに車両の生産するプルラナーゼを
３単位を加えたもの及び加えないものについて、それぞ
れ全量を１ｒＩＬｌとして、５０℃で２日間反応を行っ
た。

反応後、得られた糖化物の糖組成をペーパークロマトグ
ラフ法溶媒ピリジン：ｎ−ブタノール：水（４：６：
３）により３重展開後、各糖区分を切り抜き、蒸留水で
抽出後、フェノール−硫酸法により定量）により分析し
た結果、第２表に示す通りであった。

表から明らかなように、プルラナーゼの存在下で反応を
行なうことにより、マルトトリオースの生産量は１８％
増加した。

実施例２ＤＢ４．２５の液化ポテト澱粉液（固形分５０〜）に実
施例１により得られたアミラーゼＧ３３．３単位、塩
化カルシウム５ｘ１０−３Ｍ量添加し、全量１ｍ（
ｐＨ７，０）とし、５０℃で２４時間反応させた。

一方、前記組成の反応液に、バシルスサーキュランス
Ｇ４５（微工研菌寄第６２３７号）のプルラナーゼを１
．５単位加えたものについても同様に反応を行った。

反応後、糖組成の分析を実施例１に従い行った結果を第
３表に示す。

表から明らかなように、プルラナーゼの存在下で反応を
行なうことにより、マルトトリオースの収量は１８．４
％増加した。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂ、ｃとｄは、それぞれアミラーゼＧ３の最
適ｐＨ１最適温度、熱安定性とｐＨ安定性を示している
。

Claims

【特許請求の範囲】

１澱粉からマルトトリオースを生成するバシルス属ア
ミラーゼＧ３を、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン
又はこれらの派生物に作用させるに際し、α−１，６−
グルコシダーゼの存在下で反応することを特徴とするア
ミラーゼＧ３とα−１，６−グルコシダーゼによるマル
トトリオース含有糖液の製造方法。