JPH0378990B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔技術分野〕
本発明は生産能の改良された耐熱性プルラナー
ゼ様酵素生産菌バシルス・ズブチルス(Bacillus
subtilis)TU株に関するものである。 〔従来技術〕 プルラナーゼはプルランのα−1,6−グルコ
シド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに
より生産されることが知られている。α−1,6
−グルコシド結合を切断する酵素には、プルラナ
ーゼの他にイソアミラーゼ、R−酵素、アミロ−
1,6−グルコシダーゼと呼ばれる種々の酵素が
あり、総称してα−1,6−グルコシダーゼ、あ
るいは一般に、枝切り酵素(debranching
enzyme)と呼ばれている。 プルラナーゼなどの枝切り酵素は、最近、β−
アミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させ
ることにより、マルトースを収量よく生産するの
に使用したり、またグルコアミラーゼのα−1,
6−グルコシド結合切断能をおぎなうために、グ
ルコアミラーゼと併用して、澱粉からグルコース
を収量よく製造する、などに利用される有用な酵
素である。 しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
4〜5、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55℃〜60℃で長時間使用できる熱
安定性をもち、且つPH4〜5で作用できる酵素で
あることが要求される。 しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの{バシルス・ステアロ
サーモフイラス(日本農芸化学会大会 昭和47年
度講演要旨集 第88頁)、バシルス・アシドプル
リテイカス(特開昭57−174089、Starch、34、
340(1980))}を除き、殆んどは最適作用温度が40
℃〜50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠
点であつた。 〔目的及び効果〕 本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、最適作用PHが約5〜
約7.5の広い範囲にあり、且つ最適温度が60〜63
℃の高い温度にある、従来のプルラナーゼとは違
つた特徴のあるプルラナーゼ様酵素が、土壌中よ
り分離し、バシルス・ズブチルスと同定した細菌
により生産されることを認めた。しかし、その生
産能は低く商業的に生産し、利用するには問題が
あると考えられたので、生産能を高めるための微
生物の改良について種々検討してきた結果、紫外
線照射あるいはニトロソグアニジンなどの薬剤処
理により誘発された、ツニカマイシン
(Tunicamycin)に耐性を示す突然変異株が生産
能を顕著に増加していることを認めた。 第1表は、本発明のプルラナーゼ様酵素を生産
性する、バシルス・ズブチルスの親株とツニカマ
イシン耐性を示す突然変異株(バシルス・ズブチ
ルスTU株と命名)によるプルラナーゼ様酵素の
生産能の一例を示している。
ゼ様酵素生産菌バシルス・ズブチルス(Bacillus
subtilis)TU株に関するものである。 〔従来技術〕 プルラナーゼはプルランのα−1,6−グルコ
シド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに
より生産されることが知られている。α−1,6
−グルコシド結合を切断する酵素には、プルラナ
ーゼの他にイソアミラーゼ、R−酵素、アミロ−
1,6−グルコシダーゼと呼ばれる種々の酵素が
あり、総称してα−1,6−グルコシダーゼ、あ
るいは一般に、枝切り酵素(debranching
enzyme)と呼ばれている。 プルラナーゼなどの枝切り酵素は、最近、β−
アミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させ
ることにより、マルトースを収量よく生産するの
に使用したり、またグルコアミラーゼのα−1,
6−グルコシド結合切断能をおぎなうために、グ
ルコアミラーゼと併用して、澱粉からグルコース
を収量よく製造する、などに利用される有用な酵
素である。 しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
4〜5、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55℃〜60℃で長時間使用できる熱
安定性をもち、且つPH4〜5で作用できる酵素で
あることが要求される。 しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの{バシルス・ステアロ
サーモフイラス(日本農芸化学会大会 昭和47年
度講演要旨集 第88頁)、バシルス・アシドプル
リテイカス(特開昭57−174089、Starch、34、
340(1980))}を除き、殆んどは最適作用温度が40
℃〜50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠
点であつた。 〔目的及び効果〕 本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、最適作用PHが約5〜
約7.5の広い範囲にあり、且つ最適温度が60〜63
℃の高い温度にある、従来のプルラナーゼとは違
つた特徴のあるプルラナーゼ様酵素が、土壌中よ
り分離し、バシルス・ズブチルスと同定した細菌
により生産されることを認めた。しかし、その生
産能は低く商業的に生産し、利用するには問題が
あると考えられたので、生産能を高めるための微
生物の改良について種々検討してきた結果、紫外
線照射あるいはニトロソグアニジンなどの薬剤処
理により誘発された、ツニカマイシン
(Tunicamycin)に耐性を示す突然変異株が生産
能を顕著に増加していることを認めた。 第1表は、本発明のプルラナーゼ様酵素を生産
性する、バシルス・ズブチルスの親株とツニカマ
イシン耐性を示す突然変異株(バシルス・ズブチ
ルスTU株と命名)によるプルラナーゼ様酵素の
生産能の一例を示している。
本発明は、プルラナーゼ様酵素生産能の増強さ
れたツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチ
ルス(Bacillus subtilis)TU株に関するもので
ある。 以下に、本発明の内容を、更に具体的に示す。 本発明のツニカマイシン耐性株は以下のように
して造成された。 バシルス・ズブチルスの親株(FERM BP−
672)を蒸溜水に懸濁し、紫外線(15W)を約30
cmの距離から1〜10分間照射する。照射された菌
懸濁液の一部を25〜100μg/mlのツニカマイシ
ンを含む培地(ポリペプトン1%、可溶性澱粉1
%、K2HPO40.3%、MgSO4・7H2O0.1%)に入
れ、30℃で1〜3日間好気的に培養する。生育し
た微生物を、寒天を含む同培地で平板培地に散布
し、30℃でインキユベートする。生育してくるコ
ロニーを同組成の斜面培地に保存する。このよう
にして得られた25〜100μg/mlのツニカマイシ
ン耐性を示す突然変異株の中に高頻度でプルラナ
ーゼ様酵素の生産が増強された菌株が得られた。
なお、ツニカマイシン耐性変異株は25〜100μ
g/mlのツニカマイシンを含む培地に比較的良好
に生育するが、親株は生育を示さない。従つて、
本菌株(バシルス・ズブチルスTU株)は、ツニ
カマイシンに耐性を示し、且つ、プルラナーゼ様
酵素が著しく高い点において、新規なバシルス・
ズブチルス変異株と考えられるものである。 なお、その他の菌学的性質を以下に示す。 (1) 形態的性質; 桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ 非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 (2) 培養的性質; (a) 肉汁寒天斜面培養;表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養;肉汁寒天培養
よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養;生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養;わずかに生育する。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養;ゆつくり液化
する。 (f) ミルク液体培養;カゼインを凝固し、次いで
ペプトン化する。 (g) ポテト培養;生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質 (a) 硝酸塩の還元;陰性 (b) カタラーゼ;陽性 (c)チロシナーゼ;陰性 (d) インドール;生成しない (e) クエン酸の利用;陽性 (f) 硫化水素の生成;陽性 (g) ウレアーゼ;陰性 (h) 澱粉の加水分解;陽性 (i) 炭水化物の利用;Dグルコース、D−フラク
トース、D−マンノース、D−ガラクトース、
シユークロース、マルトース、ラクトース、デ
ンプン、デキストリン、グリコーゲン、D−キ
シロース、D−アラビノース、L−アラノース
などの炭水化物から酸を生成するが、ガスの発
生は認れられない。 (4) 生育PH及び生育温度 本菌は中性付近よりも、弱アルカリ性のPH7.5
〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35℃〜
45℃にあり、最適生育温度は約50℃である。 本菌は、バシルス ズブチルス TU、微工研
条寄第684号として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。 本菌により生産されるプルラナーゼ様酵素の性
質を以下に記載する。 (1) 作用;プルランのα−1,6−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度;1%プルラン
で、0.05Mトリス緩衝液(PH7.0)の下で30分
間反応したとき約80℃まで作用し、最適作用温
度は60〜63℃(第2図)。 (3) 作用PH及び最適作用PH;1%プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約3.5〜約11
の広いPH範囲に作用する。第1図に示す通り、
PH5付近とPH7〜7.5にピークが認められ、最
適作用PHは約5〜約7.5の広い範囲にあると考
えられる(クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液とリン酸緩衝液、2%プルラン、55℃で30分
間反応)。 (4) 熱安定性;0.05Mトリス緩衝液(PH7.0)の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果、50℃、
10分間の加熱までは殆んど失活が認められず、
50℃、10分間の加熱で約30%失活した。そし
て、60℃、10分間の加熱で約80%失活した。 (5) PH安定性;0.1M緩衝液のもとで30℃で3時
間放置後、プルランを基質として残存活性を測
定した結果、PH約5〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤;1×10-3MのHgCl2、AgNO3で90
%以上阻害された。また同濃度のZnSO4により
約70%阻害された。 (7) 安定化剤;カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。1×10-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた(1%プルラン、30分反応)。 (8) 精製方法;本酵素は液体培養物の培養濾液か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸留水
で洗滌後0.5MKClまたはリン酸一カリウム溶
液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロースカ
ラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5mによ
るカラムクロマトグラフイー、同カラムによる
再クロマトグラフイー等によりクロマト的及び
電気泳動的に均一まで精製することができる。 (9) 分子量;Biogel A0.5mで測定した分子量は
約55万であつた。 (10) 活性測定法; プルラナーゼ活性の測定は、0.1Mリン酸緩衝
液に溶解させた1%プルラン溶液(PH7.0)0.5ml
に適量の酵素を加え、水で全量1mlとし、40℃で
反応させる。この条件で1分間に1μmolのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を1単位
とした。 以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ様酵素はPH約5〜約7.5の極めて広いPH範囲に
最適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60
〜63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であ
り、本発明以前に知られているバシルス属のプル
ラナーゼ(例えば、Agric Biol.chem.40,1523
(1976)、特公昭59−39630、特開昭57−174089)
とは異つた新規なプルラナーゼ様酵素であること
ができる。 また、本発明のプルラナーゼ様酵素は、プルラ
ンを基質とするとき、最終的に、主としてマルト
トリオースを生成するプルラナーゼ活性を示すと
同時に、アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−1,4−グルコシド結合分解活性
をもち、マルトースとマルトトリオースを主成分
として生成するα−アミラーゼ活性をもつてい
る。このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性
は、硫安分画、各種有機溶剤による分画、陰イオ
ン交換体による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾
過、無機担体などへの吸着などのタンパク質精製
方法によつて分離されず、Sephadex G−200
(Pharmacie Fine Chemicals製)、Cellulofine
GC700m(チツソ(株)製)Biogel A−0.5m(Bio−
Rad Lad.製)などを用いたゲル濾過法により測
定された分子量が45〜55万の高分子量である(通
常のプルラナーゼの分子量は10万前後)ことか
ら、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツト
がかなり強固に結合し、複合酵素を形成している
ことが考えられる(第3図は、Biogel A1.5mに
よるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及び
タンパク質の溶出曲線を示しているが、これら三
者の溶出パターンは完全に一致している)。 本発明の微生物の生産するプルラナーゼ様酵素
は極めて熱安定性に優れ、且つPH4.5〜8の広い
PH域で良好に作用するため、グルコアミラーゼに
よる澱粉の糖化条件であるPH4.5〜5.0、温度55〜
60℃においても効果的に作用することができる。
従つて、本発明の微生物により生産される酵素を
グルコアミラーゼと併用して、澱粉に作用される
場合は、グルコアミラーゼ単独の場合に比べ2〜
3%グルコースを増収することができる。また、
最高の糖化率に到達する時間も著しく短縮するこ
とができる。すなわち、このことはグルコアミラ
ーゼの使用量を節減できることを示している。 本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素のよう
な無機窒素源のいずれか、または両方を使用す
る。 炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。 培養は、PH約5〜約9、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH7〜9、温度30℃前後
で2〜4日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈殿物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。 本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH4〜9、温度40℃〜70℃で
行われる。 以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。 実施例 1 大豆粕5%、コーン・ステイープ・リカー0.6
%、肉エキス0.3%、リン酸2カリ0.3%、硫酸マ
グネシウム0.1%、可溶性澱粉2%、尿素0.5%、
ソデイウム・ドデシルサルフエート0.06%、硫酸
銅5×10-5M、塩化マンガン2.5×10-6M、塩化
カルシウム1×10-3M、硫酸亜鉛1×10-4M、硫
酸鉄1×10-5Mからなる培地(PH7.0)10mlを200
ml容三角フラスコに入れ、120℃で20分間殺菌し
たのち、バシルス・ズブチルスTU株
(FERMMBP−684)または親株(FERM BP−
672)を接種し、30℃で4日間振盪培養
(160rpm)した。培養後、遠心分離して得た上澄
液について生産されたプルラナーゼ活性を測定し
た結果は第2表に示す通りであつた。
れたツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチ
ルス(Bacillus subtilis)TU株に関するもので
ある。 以下に、本発明の内容を、更に具体的に示す。 本発明のツニカマイシン耐性株は以下のように
して造成された。 バシルス・ズブチルスの親株(FERM BP−
672)を蒸溜水に懸濁し、紫外線(15W)を約30
cmの距離から1〜10分間照射する。照射された菌
懸濁液の一部を25〜100μg/mlのツニカマイシ
ンを含む培地(ポリペプトン1%、可溶性澱粉1
%、K2HPO40.3%、MgSO4・7H2O0.1%)に入
れ、30℃で1〜3日間好気的に培養する。生育し
た微生物を、寒天を含む同培地で平板培地に散布
し、30℃でインキユベートする。生育してくるコ
ロニーを同組成の斜面培地に保存する。このよう
にして得られた25〜100μg/mlのツニカマイシ
ン耐性を示す突然変異株の中に高頻度でプルラナ
ーゼ様酵素の生産が増強された菌株が得られた。
なお、ツニカマイシン耐性変異株は25〜100μ
g/mlのツニカマイシンを含む培地に比較的良好
に生育するが、親株は生育を示さない。従つて、
本菌株(バシルス・ズブチルスTU株)は、ツニ
カマイシンに耐性を示し、且つ、プルラナーゼ様
酵素が著しく高い点において、新規なバシルス・
ズブチルス変異株と考えられるものである。 なお、その他の菌学的性質を以下に示す。 (1) 形態的性質; 桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ 非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 (2) 培養的性質; (a) 肉汁寒天斜面培養;表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養;肉汁寒天培養
よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養;生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養;わずかに生育する。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養;ゆつくり液化
する。 (f) ミルク液体培養;カゼインを凝固し、次いで
ペプトン化する。 (g) ポテト培養;生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質 (a) 硝酸塩の還元;陰性 (b) カタラーゼ;陽性 (c)チロシナーゼ;陰性 (d) インドール;生成しない (e) クエン酸の利用;陽性 (f) 硫化水素の生成;陽性 (g) ウレアーゼ;陰性 (h) 澱粉の加水分解;陽性 (i) 炭水化物の利用;Dグルコース、D−フラク
トース、D−マンノース、D−ガラクトース、
シユークロース、マルトース、ラクトース、デ
ンプン、デキストリン、グリコーゲン、D−キ
シロース、D−アラビノース、L−アラノース
などの炭水化物から酸を生成するが、ガスの発
生は認れられない。 (4) 生育PH及び生育温度 本菌は中性付近よりも、弱アルカリ性のPH7.5
〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35℃〜
45℃にあり、最適生育温度は約50℃である。 本菌は、バシルス ズブチルス TU、微工研
条寄第684号として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。 本菌により生産されるプルラナーゼ様酵素の性
質を以下に記載する。 (1) 作用;プルランのα−1,6−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度;1%プルラン
で、0.05Mトリス緩衝液(PH7.0)の下で30分
間反応したとき約80℃まで作用し、最適作用温
度は60〜63℃(第2図)。 (3) 作用PH及び最適作用PH;1%プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約3.5〜約11
の広いPH範囲に作用する。第1図に示す通り、
PH5付近とPH7〜7.5にピークが認められ、最
適作用PHは約5〜約7.5の広い範囲にあると考
えられる(クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液とリン酸緩衝液、2%プルラン、55℃で30分
間反応)。 (4) 熱安定性;0.05Mトリス緩衝液(PH7.0)の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果、50℃、
10分間の加熱までは殆んど失活が認められず、
50℃、10分間の加熱で約30%失活した。そし
て、60℃、10分間の加熱で約80%失活した。 (5) PH安定性;0.1M緩衝液のもとで30℃で3時
間放置後、プルランを基質として残存活性を測
定した結果、PH約5〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤;1×10-3MのHgCl2、AgNO3で90
%以上阻害された。また同濃度のZnSO4により
約70%阻害された。 (7) 安定化剤;カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。1×10-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた(1%プルラン、30分反応)。 (8) 精製方法;本酵素は液体培養物の培養濾液か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸留水
で洗滌後0.5MKClまたはリン酸一カリウム溶
液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロースカ
ラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5mによ
るカラムクロマトグラフイー、同カラムによる
再クロマトグラフイー等によりクロマト的及び
電気泳動的に均一まで精製することができる。 (9) 分子量;Biogel A0.5mで測定した分子量は
約55万であつた。 (10) 活性測定法; プルラナーゼ活性の測定は、0.1Mリン酸緩衝
液に溶解させた1%プルラン溶液(PH7.0)0.5ml
に適量の酵素を加え、水で全量1mlとし、40℃で
反応させる。この条件で1分間に1μmolのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を1単位
とした。 以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ様酵素はPH約5〜約7.5の極めて広いPH範囲に
最適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60
〜63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であ
り、本発明以前に知られているバシルス属のプル
ラナーゼ(例えば、Agric Biol.chem.40,1523
(1976)、特公昭59−39630、特開昭57−174089)
とは異つた新規なプルラナーゼ様酵素であること
ができる。 また、本発明のプルラナーゼ様酵素は、プルラ
ンを基質とするとき、最終的に、主としてマルト
トリオースを生成するプルラナーゼ活性を示すと
同時に、アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−1,4−グルコシド結合分解活性
をもち、マルトースとマルトトリオースを主成分
として生成するα−アミラーゼ活性をもつてい
る。このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性
は、硫安分画、各種有機溶剤による分画、陰イオ
ン交換体による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾
過、無機担体などへの吸着などのタンパク質精製
方法によつて分離されず、Sephadex G−200
(Pharmacie Fine Chemicals製)、Cellulofine
GC700m(チツソ(株)製)Biogel A−0.5m(Bio−
Rad Lad.製)などを用いたゲル濾過法により測
定された分子量が45〜55万の高分子量である(通
常のプルラナーゼの分子量は10万前後)ことか
ら、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツト
がかなり強固に結合し、複合酵素を形成している
ことが考えられる(第3図は、Biogel A1.5mに
よるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及び
タンパク質の溶出曲線を示しているが、これら三
者の溶出パターンは完全に一致している)。 本発明の微生物の生産するプルラナーゼ様酵素
は極めて熱安定性に優れ、且つPH4.5〜8の広い
PH域で良好に作用するため、グルコアミラーゼに
よる澱粉の糖化条件であるPH4.5〜5.0、温度55〜
60℃においても効果的に作用することができる。
従つて、本発明の微生物により生産される酵素を
グルコアミラーゼと併用して、澱粉に作用される
場合は、グルコアミラーゼ単独の場合に比べ2〜
3%グルコースを増収することができる。また、
最高の糖化率に到達する時間も著しく短縮するこ
とができる。すなわち、このことはグルコアミラ
ーゼの使用量を節減できることを示している。 本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素のよう
な無機窒素源のいずれか、または両方を使用す
る。 炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。 培養は、PH約5〜約9、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH7〜9、温度30℃前後
で2〜4日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈殿物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。 本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH4〜9、温度40℃〜70℃で
行われる。 以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。 実施例 1 大豆粕5%、コーン・ステイープ・リカー0.6
%、肉エキス0.3%、リン酸2カリ0.3%、硫酸マ
グネシウム0.1%、可溶性澱粉2%、尿素0.5%、
ソデイウム・ドデシルサルフエート0.06%、硫酸
銅5×10-5M、塩化マンガン2.5×10-6M、塩化
カルシウム1×10-3M、硫酸亜鉛1×10-4M、硫
酸鉄1×10-5Mからなる培地(PH7.0)10mlを200
ml容三角フラスコに入れ、120℃で20分間殺菌し
たのち、バシルス・ズブチルスTU株
(FERMMBP−684)または親株(FERM BP−
672)を接種し、30℃で4日間振盪培養
(160rpm)した。培養後、遠心分離して得た上澄
液について生産されたプルラナーゼ活性を測定し
た結果は第2表に示す通りであつた。
第1図;プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第2図;プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第3図;Biogel A1.5mカラム(1.5
×87cm)によるプルラナーゼ活性、アミラーゼ活
性及びタンパク質(280nmにおける吸収)の溶出
曲線を示す。
示す。第2図;プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第3図;Biogel A1.5mカラム(1.5
×87cm)によるプルラナーゼ活性、アミラーゼ活
性及びタンパク質(280nmにおける吸収)の溶出
曲線を示す。
Claims (1)
- 1 ツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチ
ルスTU株
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58985A JPS61162169A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | 新規なバシルス・ズブチルスtu株 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58985A JPS61162169A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | 新規なバシルス・ズブチルスtu株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61162169A JPS61162169A (ja) | 1986-07-22 |
JPH0378990B2 true JPH0378990B2 (ja) | 1991-12-17 |
Family
ID=11477912
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58985A Granted JPS61162169A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | 新規なバシルス・ズブチルスtu株 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61162169A (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107365730B (zh) * | 2017-09-08 | 2021-12-10 | 河南新仰韶生物酶制剂有限公司 | 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法 |
CN110184259B (zh) * | 2019-07-09 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用 |
-
1985
- 1985-01-07 JP JP58985A patent/JPS61162169A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS61162169A (ja) | 1986-07-22 |
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