JPH0378990B2

JPH0378990B2 -

Info

Publication number: JPH0378990B2
Application number: JP58985A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1991-12-17
Also published as: JPS61162169A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は生産能の改良された耐熱性プルラナー
ゼ様酵素生産菌バシルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）TU株に関するものである。〔従来技術〕プルラナーゼはプルランのα−１，６−グルコ
シド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに
より生産されることが知られている。α−１，６
−グルコシド結合を切断する酵素には、プルラナ
ーゼの他にイソアミラーゼ、Ｒ−酵素、アミロ−
１，６−グルコシダーゼと呼ばれる種々の酵素が
あり、総称してα−１，６−グルコシダーゼ、あ
るいは一般に、枝切り酵素（debranching
enzyme）と呼ばれている。プルラナーゼなどの枝切り酵素は、最近、β−
アミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させ
ることにより、マルトースを収量よく生産するの
に使用したり、またグルコアミラーゼのα−１，
６−グルコシド結合切断能をおぎなうために、グ
ルコアミラーゼと併用して、澱粉からグルコース
を収量よく製造する、などに利用される有用な酵
素である。しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
４〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55℃〜60℃で長時間使用できる熱
安定性をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素で
あることが要求される。しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの｛バシルス・ステアロ
サーモフイラス（日本農芸化学会大会昭和47年
度講演要旨集第88頁）、バシルス・アシドプル
リテイカス（特開昭57−174089、Starch、34、
340（1980））｝を除き、殆んどは最適作用温度が40
℃〜50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠
点であつた。〔目的及び効果〕本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、最適作用PHが約５〜
約7.5の広い範囲にあり、且つ最適温度が60〜63
℃の高い温度にある、従来のプルラナーゼとは違
つた特徴のあるプルラナーゼ様酵素が、土壌中よ
り分離し、バシルス・ズブチルスと同定した細菌
により生産されることを認めた。しかし、その生
産能は低く商業的に生産し、利用するには問題が
あると考えられたので、生産能を高めるための微
生物の改良について種々検討してきた結果、紫外
線照射あるいはニトロソグアニジンなどの薬剤処
理により誘発された、ツニカマイシン
（Tunicamycin）に耐性を示す突然変異株が生産
能を顕著に増加していることを認めた。第１表は、本発明のプルラナーゼ様酵素を生産
性する、バシルス・ズブチルスの親株とツニカマ
イシン耐性を示す突然変異株（バシルス・ズブチ
ルスTU株と命名）によるプルラナーゼ様酵素の
生産能の一例を示している。

〔構成〕

本発明は、プルラナーゼ様酵素生産能の増強さ
れたツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチ
ルス（Bacillus subtilis）TU株に関するもので
ある。以下に、本発明の内容を、更に具体的に示す。本発明のツニカマイシン耐性株は以下のように
して造成された。バシルス・ズブチルスの親株（FERM BP−
672）を蒸溜水に懸濁し、紫外線（15W）を約30
cmの距離から１〜10分間照射する。照射された菌
懸濁液の一部を25〜100μｇ／mlのツニカマイシ
ンを含む培地（ポリペプトン１％、可溶性澱粉１
％、K₂HPO₄0.3％、MgSO₄・7H₂O0.1％）に入
れ、30℃で１〜３日間好気的に培養する。生育し
た微生物を、寒天を含む同培地で平板培地に散布
し、30℃でインキユベートする。生育してくるコ
ロニーを同組成の斜面培地に保存する。このよう
にして得られた25〜100μｇ／mlのツニカマイシ
ン耐性を示す突然変異株の中に高頻度でプルラナ
ーゼ様酵素の生産が増強された菌株が得られた。
なお、ツニカマイシン耐性変異株は25〜100μ
ｇ／mlのツニカマイシンを含む培地に比較的良好
に生育するが、親株は生育を示さない。従つて、
本菌株（バシルス・ズブチルスTU株）は、ツニ
カマイシンに耐性を示し、且つ、プルラナーゼ様
酵素が著しく高い点において、新規なバシルス・
ズブチルス変異株と考えられるものである。なお、その他の菌学的性質を以下に示す。 (1) 形態的性質；桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ 非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 (2) 培養的性質； (a) 肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培養
よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養；生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育する。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液化
する。 (f) ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次いで
ペプトン化する。 (g) ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質 (a) 硝酸塩の還元；陰性 (b) カタラーゼ；陽性 (c)チロシナーゼ；陰性 (d) インドール；生成しない (e) クエン酸の利用；陽性 (f) 硫化水素の生成；陽性 (g) ウレアーゼ；陰性 (h) 澱粉の加水分解；陽性 (i) 炭水化物の利用；Ｄグルコース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
シユークロース、マルトース、ラクトース、デ
ンプン、デキストリン、グリコーゲン、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラノース
などの炭水化物から酸を生成するが、ガスの発
生は認れられない。 (4) 生育PH及び生育温度本菌は中性付近よりも、弱アルカリ性のPH7.5
〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35℃〜
45℃にあり、最適生育温度は約50℃である。本菌は、バシルスズブチルス TU、微工研
条寄第684号として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。本菌により生産されるプルラナーゼ様酵素の性
質を以下に記載する。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン
で、0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30分
間反応したとき約80℃まで作用し、最適作用温
度は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約3.5〜約11
の広いPH範囲に作用する。第１図に示す通り、
PH５付近とPH７〜7.5にピークが認められ、最
適作用PHは約５〜約7.5の広い範囲にあると考
えられる（クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液とリン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分
間反応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果、50℃、
10分間の加熱までは殆んど失活が認められず、
50℃、10分間の加熱で約30％失活した。そし
て、60℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時
間放置後、プルランを基質として残存活性を測
定した結果、PH約５〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤；１×10^-3MのHgCl₂、AgNO₃で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO₄により
約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。１×10^-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた（１％プルラン、30分反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾液か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸留水
で洗滌後0.5MKClまたはリン酸一カリウム溶
液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロースカ
ラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5mによ
るカラムクロマトグラフイー、同カラムによる
再クロマトグラフイー等によりクロマト的及び
電気泳動的に均一まで精製することができる。 (9) 分子量；Biogel A0.5mで測定した分子量は
約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼ活性の測定は、0.1Mリン酸緩衝
液に溶解させた１％プルラン溶液（PH7.0）0.5ml
に適量の酵素を加え、水で全量１mlとし、40℃で
反応させる。この条件で１分間に1μmolのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ様酵素はPH約５〜約7.5の極めて広いPH範囲に
最適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60
〜63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であ
り、本発明以前に知られているバシルス属のプル
ラナーゼ（例えば、Agric Biol.chem.40，1523
（1976）、特公昭59−39630、特開昭57−174089）
とは異つた新規なプルラナーゼ様酵素であること
ができる。また、本発明のプルラナーゼ様酵素は、プルラ
ンを基質とするとき、最終的に、主としてマルト
トリオースを生成するプルラナーゼ活性を示すと
同時に、アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−１，４−グルコシド結合分解活性
をもち、マルトースとマルトトリオースを主成分
として生成するα−アミラーゼ活性をもつてい
る。このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性
は、硫安分画、各種有機溶剤による分画、陰イオ
ン交換体による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾
過、無機担体などへの吸着などのタンパク質精製
方法によつて分離されず、Sephadex Ｇ−200
（Pharmacie Fine Chemicals製）、Cellulofine
GC700m（チツソ(株)製）Biogel Ａ−0.5m（Bio−
Rad Lad.製）などを用いたゲル濾過法により測
定された分子量が45〜55万の高分子量である（通
常のプルラナーゼの分子量は10万前後）ことか
ら、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツト
がかなり強固に結合し、複合酵素を形成している
ことが考えられる（第３図は、Biogel A1.5mに
よるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及び
タンパク質の溶出曲線を示しているが、これら三
者の溶出パターンは完全に一致している）。本発明の微生物の生産するプルラナーゼ様酵素
は極めて熱安定性に優れ、且つPH4.5〜８の広い
PH域で良好に作用するため、グルコアミラーゼに
よる澱粉の糖化条件であるPH4.5〜5.0、温度55〜
60℃においても効果的に作用することができる。
従つて、本発明の微生物により生産される酵素を
グルコアミラーゼと併用して、澱粉に作用される
場合は、グルコアミラーゼ単独の場合に比べ２〜
３％グルコースを増収することができる。また、
最高の糖化率に到達する時間も著しく短縮するこ
とができる。すなわち、このことはグルコアミラ
ーゼの使用量を節減できることを示している。本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素のよう
な無機窒素源のいずれか、または両方を使用す
る。炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。培養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃前後
で２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈殿物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH４〜９、温度40℃〜70℃で
行われる。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１大豆粕５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.3％、リン酸２カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性澱粉２％、尿素0.5％、
ソデイウム・ドデシルサルフエート0.06％、硫酸
銅５×10^-5M、塩化マンガン2.5×10^-6M、塩化
カルシウム１×10^-3M、硫酸亜鉛１×10^-4M、硫
酸鉄１×10^-5Mからなる培地（PH7.0）10mlを200
ml容三角フラスコに入れ、120℃で20分間殺菌し
たのち、バシルス・ズブチルスTU株
（FERMMBP−684）または親株（FERM BP−
672）を接種し、30℃で４日間振盪培養
（160rpm）した。培養後、遠心分離して得た上澄
液について生産されたプルラナーゼ活性を測定し
た結果は第２表に示す通りであつた。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図；プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；Biogel A1.5mカラム（1.5
×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラーゼ活
性及びタンパク質（280nmにおける吸収）の溶出
曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチ
ルスTU株