JPS6331194B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、広い最適作用PH域をもつ新規なプル
ラナーゼに関するものである。 プルラナーゼは、Benderらにより、プルラリ
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分
解する酵素として、エーロバクター・エーロゲネ
ス（Aerobacter aerogenes）に、はじめて見出
された［Biochem.Biophys.Acta、36、309
（1959）、特公昭46−7559など］。その後、この酵
素は、アミロペクチンのα−1.6−グルコシド結
合を加水分解し、β−アミラーゼとの併用によ
り、デンプンからマルトースを収量よく生産でき
ることから注目され、現在までに同種の酵素が
種々の微生物より生産されることが知られてい
る。この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラー
ゼなど種々の名称で呼ばれているが、総称してα
−1.6−グルコシダーゼと言われている。たとえ
ば、エツセリシア・インターメデイアのイソアミ
ラーゼ［Escherichia intermedia、Applied.
Microbiol.、15、492（1967）］、ストレプトコツカ
ス・ミテイスのプルラナーゼ［Streptococcus
mitis、Biochem.J.108、33、（1968）］、ストレプ
トマイセス・sp.NO.28のイソアミラーゼ［J.
Ferment.Tech.、49、552（1971）］、バシルス属の
プルラナーゼ［Agric.Biol.Chem.、40、1515
（1976）、Starch、34、340（1982）など］などが
ある。 最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
−1.6−グルコシダーゼは、デンプンからグルコ
ースの製造や、デンプンからマルトース、マルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタ
オース、マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ
糖の生産においても、これら糖の増収に有効であ
ることが認められている。 しかるに、従来、知られているプルラナーゼや
イソアミラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、
一般に熱安定性に劣り（多くは最適温度45〜50
℃）また、作用PH範囲が狭いため、グルコアミラ
ーゼのように酸性側で作用し、熱安定性に優れた
酵素（最適作用PH4.5付近、最適作用温度60℃）
や、中性〜弱アルカリ性に最適作用PHをもつ微生
物起源のマルトオリゴ糖生成酵素の、全てのアミ
ラーゼに対して使用するには技術的および経済的
に問題があつた。 そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β
−アミラーゼやマルトトリオース以上のマルトオ
リゴ糖を生成するアミラーゼの、いずれのアミラ
ーゼとも併用できる、最適作用PH範囲が広く、且
つ熱安定性に優れたα−1.6−グルコシダーゼを
求めて、広く自然界から微生物の検索を行つてき
た結果、土壌中より分離し、クレブシラ・ニユー
モニア（Klebsiella pneumoniae）と同定した細
菌の生産するプルラナーゼが新規な耐熱性プルラ
ナーゼであることを認め本発明を完成した。 すなわち、本発明は作用温度範囲が約０〜約75
℃、至適作用温度範囲約60〜約63℃、作用PH範囲
が約2.5〜約10、至適作用PH範囲が約4.5〜約7.5か
らなる新規な耐熱性プルラナーゼに関するもので
ある。 以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。 本発明において使用される、クレブシラ・ニユ
ーモニア（Klebsiella pneumoniae）は、Begey
の細菌同定書（Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology、The Williams
＆ Wilkins Co.）において、以前はエーロバク
ター・エーロゲネス（Aerobacter aerogenes）
と区別されていたが、第８版において、エーロバ
クター・エーロゲネスはクレブシラ・ニユーモニ
アに包含されている。エーロバクター属やクレブ
シラ属細菌がプルラナーゼを生産することについ
ては、すでに本発明以前に公知である。たとえ
ば、Biochem.Z.、334、79（1961）、Method in
Enzymology 、555（1966）、特公昭46−7559、
Agric.Biol.Chem.、37、2821（1973）などには、
エーロバクター・エーロゲネスの生産するプルラ
ナーゼの記載があり、また、特公昭51−5072特公
昭58−22197などには、クレブシラ・ニユーモニ
アなどのクレブシラ属の生産するα−1.6−グル
コシダーゼについての記載がある。しかし、これ
ら文献や特許公報に記載されている酵素は、いず
れも熱安定性に劣つている。すなわち、
Biochem.Z.334、79（1961）とMethod in
Enzymology 、555（1966）にはエーロバクタ
ー・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温度
は47.5℃とあり、Agric.Biol.Chem.、37、2821
（1973）には、同じくエーロバクター・エーロゲ
ネスのプルラナーゼの最適作用温度は50℃である
と記載されている。 そして、特公昭51−5072には、クレブシラ・ニ
ユーモニアの最適作用温度は45〜50℃にあり、基
質の不在下では、50℃で１時間加熱処理すると殆
んど失活すると記載されている。 このように、従来、知られているエーロバクタ
ー属やクレブシラ属のプルラナーゼやα−1.6−
グルコシダーゼの最適作用温度は45〜50℃程度で
あると考えられるのに対し、本発明のプルラナー
ゼの最適作用温度は60〜63℃の高温側にあり、基
質の不在下で50℃で１時間加熱しても殆んど活性
の低下は認められない（第１図及び第２図）な
ど、熱安定性に優れた酵素である。本酵素は基質
の存在下では当然熱安定性化され、またカルシウ
ムなどの金属塩の存在下でも熱安定化されるの
で、実用的な反応条件においても、最低60℃の温
度で反応を行なうことができる。 一方、最適作用PHについてみてみると、エーロ
バクター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラ
ナーゼやα−1.6−グルコシダーゼの最適作用PH
は5.0付近｛Method in Enzymology 、555
（1966）、特公昭51−5072など｝、または、PH６付
近｛Agric Biol.Chem.、37、2821（1973）｝にあ
り、いずれの場合も、特に、PH６以上においては
著しく活性が低下することが知られている。 本発明以前に、比較的熱安定性に優れたα−
1.6−グルコシダーゼを生産する微生物として、
たとえば、バシルス属のプルラナーゼ｛特開昭57
−174089、Starch、34、340（1982）｝、およびス
トレプトマイセス属のイソアミラーゼ｛J.
Ferment Technol.、49、552（1971）｝が知られ
ている。これらの微生物の生産するプルラナーゼ
やイソアミラーゼの最適作用温度は約60℃にある
が、いずれも最適作用PHは5.0にあり、PH５以上
では著しく活性が低下する。 以上、説明したように、本発明以前に知られて
いたエーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱
安定性に劣り、最適作用温度は50℃前後にあり、
また、最適作用PHも5.0または6.0の狭い範囲にあ
る。これに対し、本発明により生産されるクレブ
シラ・ニユーモニアの新規な耐熱性プルラナーゼ
Ａは、最適作用PHが約4.5〜約7.0の極めて広い範
囲にあり、そして最適作用温度は約60〜約63℃と
極めて熱安定性に優れた酵素であり、従来、知ら
れていたエーロバクタ属やクレブシラ属の酵素と
は違つた新規な酵素と認められるものである。 以下に、本発明の新規な耐熱性プルラナーゼの
酵素的性質についてより詳細に記載する。 (1) 作用：プルランのα−1.6−グルコシド結合
を分解してマルトトリオースを生成する。ま
た、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲンまた
はこれらの派生物のα−1.6−グルコシド結合
を分解する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH：PH約2.5〜約10
の極めて広いPH範囲で作用し、最適作用温度は
PH約4.5〜約7.5の広い範囲に認められた｛２％
プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、ト
リス緩衝液ｐ（PH5.5〜7.5）およびトリシン緩
衝液（PH７〜8.5）のもとで50℃で30分間反応、
第１図ａ｝ (3) 作用温度範囲及び最適作用温度；約75℃まで
作用し、最適作用温度は約63℃に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH5.0）又
は0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）のもとで30分
間反応、第１図ｂ｝。 (4) 熱安定性；酵素水溶液を50℃、55℃と60℃で
加熱処理してのち、残存活性を測定した。その
結果、50℃では１時間の加熱後も失活は殆んど
認められなかつた。55℃の加熱では20分の加熱
で約20％失活し、１時間の加熱で約60％失活し
た。そして、60℃の加熱では30分間の加熱で約
80％失活した｛第２図ａ｝。 (5) PH安定性；PH約４〜約10の範囲で安定であつ
た｛0.1M酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはト
リス緩衝液のもと、室温（25℃）で３時間放置
後、残存活性を測定した｛第２図ｂ｝。 (6) 阻害剤；本酵素は１×10^-3MのCuSO₄、
HgCl₂、ZnSO₄、FeSO₄により、それぞれ約93
％、約89％、約86％、約29％阻害された。同濃
度のAgNO₃によつては殆んど阻害されなかつ
た。 (7) 精製方法；本酵素は培養上澄液から硫安分画
（40〜70％飽和）、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー（KCl0〜0.5Mでリニヤー
グラジエント溶出）とセフアデツクスＧ−200
カラムクロマトグラフイーにより、クロマト
的、電気泳動的に均一まで精製することができ
る。 (8) 分子量；セフアデツクスＧ−200ゲル濾過法
により測定した分子量は約12万であつた。 (9) 力価測定法；0.1Mトリス緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし40℃で反応させる。
この条件で１時間１mgのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。 また、本発明において使用される新規な耐熱性
プルラナーゼ生産菌の菌学的性質は下記に示す通
りである。 (1) 形態的性質；約0.8×約1.3μの桿菌、通常、
単桿菌あるいは２連状に連なり生育する、運動
性はなく、また胞子形成は認められない。 (2) 培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ
る円形状の集落を形成する。集落の周縁は全縁
で、表面隆起は頭状を示す。肉汁液体培養で
は、培地全体に混濁を生成する。 穿刺培養では、寒天高層の上層、中部、深部
ともに糸状の生育が認められ、寒天表面にも集
落の形成が認められる。 (3) 生理的性質 生育温度；約50℃の温度まで生育するが、最適
生育温度は約43℃。 生育PH；PH約５〜約９の範囲で生育する。 最適生育PHは７付近。 グラム染色；陰性。 酸素に対する態度；通性嫌気性。 カラターゼ；陽性。 オキシダーゼ；陰性 β−ガラクトシダーゼ；陽性 硝酸塩の還元；陽性 炭水化物の利用；グルコース、アドニトール、
Ｌ−アラビノース、エクスリン、イノシー
ル、マンニトール、Ｌ−ラムノースなどを利
用し酸を生成する。 クエン酸の利用；陽性 マロン酸の利用；陽性 メチルレツド反応；陰性 VP反応；陽性 アルギニンの加水分解；陽性 ゼラチンの液化；陰性 硫化水素の生成；陽性 インドール反応；陰性 リジンの脱炭酸；陽性 オルニチンの脱炭酸；陽性 ウレアーゼ反応；陽性 フエニールアラニンからのフエニルピルビン酸
の生成；陰性 以上の菌学的性質について、Bergey's
Manual of Determinative Bacteriologyの第８
版（The Williams ＆ Wilkins Co.1974年）
を参照し、本菌をクレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）の一菌株と同定当す
るのが適当と考えた。本菌は工業技術院微生物工
業技術研究所においてKlebsiella pneumoniae
FERMP−7387として寄託されている。 本菌による新規な耐熱性プルラナーゼを生産す
るためには、窒素源として、ペプトン、肉エキ
ス、カゼイン、コーンステイープ・リカーのよう
な有機窒素源あるいは尿素、硫酸アンモニウム、
硝酸塩などの無機窒素化合物と、炭素源として、
デンプン、アミロペクチン、デキストリン、マル
トース、グルコース、乳糖などを一種または一種
以上、そしてこれに補足する栄養源として、リン
酸塩、マグネシウム塩、塩化カリウムと、マンガ
ン塩、カルシウム塩、鉄塩などの金属塩を含む培
地が使用される。 培養はPH５〜９、温度20〜45℃で、通常、好気
的に行われる。 新規な耐熱性プルラナーゼは殆んど菌体外に生
産されることと、α−アミラーゼなどのデンプン
糖化において有害となる酵素は殆んど生産されな
いため、培養後は、濾過または遠心分離により除
菌し、上澄液を回収して、これを濃縮するか、あ
るいは必要に応じて、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウムなどによる塩析によるか、または、アセ
トン、イソプロパノール、エタノール、メタノー
ルなどの有機溶剤を加えて酵素を沈澱物として収
得する、などの手段により、容易に培養物から酵
素を回収することができる。 本発明以前に知られているAerobacter属や
Klebsiella属の生産するプルラナーゼやイソアミ
ラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、菌体内
に多量の酵素を蓄積する（例えば、特公昭46−
7559、特公昭51−5072など）ため、培養終了後、
菌体から酵素を抽出回収する操作が必要であると
いう問題があるが、本発明により生産される新規
な耐熱性プルラナーゼは、殆んどすべて菌体外に
生産されるため、培養物からの該酵素の回収は容
易であり、工業的に同酵素を製造する際に商業的
に有利に実施することができる。このことも本発
明の大きな特徴として挙げることができる。 また、新規な耐熱性プルラナーゼは前述の如
く、最適作用PHが約4.5〜約7.5の広い範囲にあ
り、また熱安定性に優れた酵素であるため、現
在、知られているデンプンからグルコースを生産
するグルコアミラーゼ、デンプンからマルトース
を生産する植物または細菌のβ−アミラーゼはも
とより、マルトトリオースを生成するバシルス属
アミラーゼ（最適作用PH6.0〜6.5、特許出願中）、
マルトテトラオースを生成するシユードモナス属
アミラーゼ｛最適作用PH6.5〜８、Arch.
Biochem.Biophys.45 105（1971）など｝、マルト
ペンタオースを生成するバシルス属アミラーゼ
｛最適作用PH５〜８、Arch.Biochem.Biophys.
155、290（1973）｝、マルトヘキサオースを生成す
るアミラーゼ｛最適作用PH6.8または8.0、
Biochem.Biophys.A Acta、410、333（1975）ま
たはAgric.Biol.Chem.、46、1539（1982）｝など、
いずれのアミラーゼとも、それぞれのアミラーゼ
の最適条件下で反応をおこなうことができる。 以下、実施例により本発明の詳細を説明する。 実施例 １ 尿素0.35％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、可溶性デンプン２％、KCl0.5％、
MnCl₂5×10^-5M、CaCl₂1×10^-3Mからなる培地
に50mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法によ
り殺菌後、クレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）FERMP−7387を接
種し、30℃で２日間振温培養した。培養後、遠心
分離機により除菌し、得られた上澄液について生
産された新規な耐熱性プルラナーゼ活性を測定し
た結果、培地ml当り5.6単位であつた。 実施例 ２ 実施例１で使用したと同じ組成の培地３を５
容ジヤーフアーメンターに入れ、常法により殺
菌後、クレブシラ・ニユーモニアFERMP−7387
を接種し、通気量１／min回転数250rpmで培
養した。培養後、遠心分離機により除菌し、硫安
70％飽和になるように加え、生成した沈澱物を粗
酵素として回収した。得られた酵素剤を用いて、
アミラーゼと併用してデンプンの糖化を行つた。 DE1.4の液化デンプン液（固形物として１ｇ）
に、市販の大豆β−アミラーゼ300単位｛Agric
Biol.Chem.、40、1515（1976）の測定法によつ
た｝と上記方法により得たクレブシラ・ニユーモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼを１または２単
位を加え、PH6.0、55℃で反応させた。得られた
糖化物の糖組成は高速液体クロマトグラフ法によ
り定量した。結果は第１表に示す通りであつた。 実施例 ３ DE7.7の液化デンプン液に、市販のグルコアミ
ラーゼと実施例２で調製した新規な耐熱性プルラ
ナーゼを１単位加え、固形分濃度30％、全容量10
mlとして、PH5.0、温度60℃で糖化した。糖化液
の糖組成の分析は高速液体クロマトグラフ法によ
つた。得られた結果を第２表に示す。 表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ 【表】 【表】 ーゼの添加によりグルコースの収量が増加した。 ここでG₂、G₃はそれぞれグルコースの２量体、
３量体を示す。 実施例 ４ DE4.2の液化デンプン液（固形分として１ｇ）
に、バシルスsp YT−1004（微工研菌寄第5854
号）の生産するマルトトリオース生成アミラーゼ
２単位と実施例２で調製した新規な耐熱性プルラ
ナーゼ1.5単位を加え、水で全量10mlとし、PH
7.0、温度50℃で糖化した。糖化液の糖組成を分
析した結果は第３表に示す通りあつた。 表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ
ーゼを添加することにより、マルトトリオースの
収量が著しく増加した。

【図面の簡単な説明】

第１図ａとｂ、第２図ａとｂは、それぞれクレ
ブシラ・ニユーモニアの生産する新規な耐熱性プ
ルラナーゼの最適作用PH、最適作用温度、熱安定
性とPH安定性を示している。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 作用温度範囲が約０〜約75℃、最適作用温度
   が約60〜約63℃、作用PH範囲が約2.5〜約10、最
   適作用PHが約4.5〜約7.5からなり、且つ、以下の
   酵素的性質により特徴づけられる新規な耐熱性プ
   ルラナーゼ。 １ プルランのほか、澱粉、アミロペクチン、グ
   リコーゲンなどに存在するα−１、６−グルコ
   シド結合を分解すること、 ２ 55℃以上の温度の加熱で失活がおこること、 ３ PH約４〜約10の範囲で安定であること（25
   ℃、３時間）、 ４ 銅、水銀、亜鉛、鉄の各イオンにより阻害さ
   れること、 ５ ゲル濾過法により測定した分子量が約12万で
   あること。