JPH0435158B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はデンプンから高純度マルトースの製造
法に関するものである。 植物または微生物の生産するβ−アミラーゼを
デンプンに作用させると、デンプン中のアミロー
スとアミロペクチンの非還元性末端からマルトー
スが生成する。しかし、アミロペクチンのα−
1.6−グルコシド結合はβ−アミラーゼによつて
分解されないため、α−1.6−グルコシド結合付
近で分解が止り、後にデキストリン（β−リミツ
トデキストリン）を残すことになる。β−アミラ
ーゼと共にアミロペクチン（またはβ−リミツト
デキストリン）のα−1.6−グルコシド結合を分
解する酵素を存在させてデンプンを糖化させると
きマルトースの収量が増収できることはよく知ら
れている｛たとえば、Z.H.Gunjaら、Biochem.J.
81、392（1961）など｝。 α−1.6−グルコシド結合を分解する酵素は、
その給源、基質特異性などにより、イソアミラー
ゼ、プルラナーゼ、アミロ−1.6−グルコシダー
ゼなどと呼ばれているが、総称としてα−1.6−
グルコシダーゼといわれる。 本発明者は、先に、バシルス属細菌が、デンプ
ンからマルトースを高収量で生産するのに必要な
β−アミラーゼとα−1.6−グルコシダーゼから
なる複合酵素を同時に生産することを認めた｛特
公昭53−5749など、及びAgric、Biol、Chem、
40、1515（1476）など｝。この酵素によれば、各種
デンプンから最高88％の収量でマルトースを生産
することができる｛日本農芸化学会誌、53、77
（1979）｝。 しかし、デンプンを糖化したマルトース含有液
からマルトースを結晶として収量よく回収するた
めには、マルトース含有液のマルトース純度を、
少なくとも90％以上に高めることが要求される。
そこで、本発明者は、前記複合酵素を用いたデン
プン糖化において、マルトース含量を高める方法
について鋭意研究を行つてきた結果、デンプンを
バシルス属β−アミラーゼとα−1.6−グルコシ
ダーゼで糖化するに際し、エーロバクター属また
はクレブシラ属のプルラナーゼを存在させて糖化
するとマルトースの収量が増加できることを認め
た。本発明はこの知見にもとずいてなされたもの
である。 すなわち、本発明は、バシルス属の生産するβ
−アミラーゼとα−1.6−グルコシダーゼでデン
プンを糖化してマルトースを製造するに際し、エ
ーロバクター属またはクレブシラ属のプルラナー
ゼを存在させることを特徴とする高純度マルトー
スの製造方法に関するものである。 以下に本発明の内容を詳細に説明する。 β−アミラーゼとα−1.6−グルコシダーゼを
同時に生産するバシルス属の微生物としてはバシ
ルス・セレウス・バリエータス・ミコイデス
FERMP−2391（菌学的性質については特公昭52
−30590号公報参照）を挙げることができる。 エーロバクター属菌株（Aerobacter
aerogenes）の生産するプルラナーゼは、最初、
Benderらにより、プルラリヤ・プルランの生産
する多糖類プルランを分解する酵素として発見さ
れた｛Biochem.Biophys.Acta、36、309（1959）｝
が、その後、同じ属種の菌株のプルラナーゼが多
く研究者により研究されている｛たとえば、
Method in Enzymolagy、 、555（1966）、
Agric.Biol.Chem.、37、2821（1973）など｝。ま
た、クレブシラ属菌株によるα−1.6−グルコシ
ダーゼの生産については、たとえば、特公昭51−
5072に記載されている。 エーロバクター・エーロゲネスは、現在、
Bergeyの細菌同定書（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology、The William
＆ Wilkinds Co.第８版）においては、クレブ
シラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae）
に統合されている。本発明において使用される、
エーロバクター属またはクレブシラ属のプルラナ
ーゼとは、この属種の菌株の生産するプルラナー
ゼをさし、これら属種の菌株の酵素はすでに市販
されている。 本発明は、このような市販のエーロバクター属
またはクレブシラ属のプルラナーゼも使用するこ
とができるが、本発明者により発明された、クレ
ブシラ・ニューモニアFERMP−7387の生産する
新規なプルラナーゼを用いることができる。 クレブシラ・ニユーモニアPERMP−7387の菌
学的性質は下記に示す通りである。 (1) 形態的性質；約0.8×約0.3μの桿菌、通常、
単桿菌あるいは２連状に連なり生育する、運動
性はなく、また胞子形成は認められない。 (2) 培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ
る円形状の集落を形成する。集落の周縁は全縁
で、表面隆起は頭状を示す。 肉汁液体培養では、堵地全体に混濁を生成す
る。 穿刺培養では、寒天高層の上槽、中部、深部
ともに糸状に生育が認められ、寒天表面にも集
落の形成が認められる。 (3) 生理的性質 生育温度；約50℃の温度まで生育するが、最適
生育温度は約43℃。 生育PH；PH約５〜約９の範囲で生育する。最適
生育PHは７付近。 グラム染色；陰性。 酸素に対する態度；通性嫌気性。 カタラーゼ；陽性。 オキシダーゼ；陰性。 β−ガラクトシダーゼ；陽性。 硝酸塩の還元；陽性。 炭水化物の利用；グウコール、アドニトール、
Ｌ−アラビノース、エスクリン、イノシトー
ル、マンニトール、Ｌ−ラムノースなどを利
用し酸を生成する。 クエン酸の利用；陽性。 マロン酸の利用；陽性。 メチルレツド反応；陰性。 VP反応；陽性。 アルギニンの加水分解；陽性。 ゼラチンの液化；陰性。 硫化水素の生成；陽性。 インドール反応；陰性。 リジンの脱炭酸；陽性。 オルニチンの脱炭酸；陽性。 ウレアーゼ反応；陽性。 フエニルアラニンからのフエニルピルビン酸の
生成；陰性。 以上の菌学的性質について、Bergey's
Manual of Determinative Bacteriologyの第８
版（The Williams ＆ Wilkins Co.1974年）
を参照し、本菌をクレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoiae）の一菌株と同定するの
が適当と考えられるものである。 本酵素は最適作用PHが約4.5〜約7.5、最適温度
が60〜63℃の極めて広いPH範囲に作用する熱安定
のプルラナーゼであり、α−アミラーゼやトラン
スグルコシダーゼなどのマルトースの生産にとつ
て妨害となる酵素を殆んど含んでいないため、本
発明をより効果的に実施することができる。本酵
素の酵素的性質の概要は以下の通りである。 (1) 作用：プルランのα−1.6−グルコシド結合
を分解してマルトトリオースを生成する。ま
た、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲンま
たはこれらの派生物のα−1.6−グルコシド
結合を分解する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH：PH約2.5〜約10
の極めて広いPH範囲で作用し、最適作用温度
はPH約4.5〜約7.5の広い範囲に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH３〜
5.5）、トリス緩衝液（PH5.5〜7.5）およびト
リシン緩衝液（PH７〜8.5）のもとで50℃で
30分間反応｝ (3) 作用温度範囲及び最適作用温度：約75℃まで
作用し、最適作用温度は約63℃に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH5.0）
又は0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）のもとで
30分間反応｝。 (4) 熱安定性：酵素水溶液を50℃、55℃と60℃で
加熱処理してのち、残存活性を測定した。そ
の結果、50℃では１時間の加熱後も失活は殆
んど認められなかつた。55℃の加熱では20分
の加熱で約20％失活し、１時間の加熱で約60
％失活した。そして、60℃の加熱では30分間
の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定性：PH約４〜約10の範囲で安定であつ
た｛0.1M酢酸緩衝液、リン酸緩衝液または
トリス緩衝液のもと、室温（25℃）で３時間
放置後、残損活性を測定した。 (6) 阻害剤：本酵素は１×10^-3MのCuSO₄、
HgCl₂、ZnSO₄、FeSO₄により、それぞれ約
93％、約89％、約89％、約29％阻害された。
同濃度のAgNO₃によつては殆んど阻害され
なかつた。 (7) 精製方法：本酵素は培養上澄液から硫安分画
（40〜70％飽和）、DEAE−セフアロースカラ
ムクロマトグラフイー（KCl0〜0.5Mでリニ
ヤーグラジエント溶出）とセフアデツクスＧ
−200カラムクロマトグラフイーにより、ク
ロマト的、電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。 (8) 分子量：セフアデツクスＧ−200ゲル濾過法
により測定した分子量は約12万であつた。 (9) 力価測定法：0.1Mトリス緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（PH7.0）0.5mlに適量の酵
素を加え、水で全量１mlとし40℃で反応させ
る。この条件で１時間に１mgのグルコースに
相当する還元力を生成する酵素量を１単位と
した。 本発明により、デンプンを糖化するには、通常
DE（デンプンの分解率を示す指標、固形分中の還
却力をグルコースとして表わした百分率）10以下
の液化デンを10〜40％濃度で、PH５〜７、温度50
〜60℃でおこなわれる。 次に、実施例により本発明の詳細を説明する。 実施例 １ DE1.4の液化デンプン液（固定分として１ｇ
に、バシルス・セレウス・バリエータス・ミコイ
デス（微工研菌寄第2391号）生産するβ−アミラ
ーゼとα−1.6−グルコシダーゼ｛FERMP−
2391を用い、Agric.Biol.Chem.、48、1515
（1976）、特公昭53−5749により調製した。同酵素
は北海道糖業(株)より入手することができる｝それ
ぞれ300単位（単位の定義は前記文献によつた）
とクレブシラ・ニユーモニアFERMP−7387の生
産するプルラナーゼを0.5または１単位を加え、
PH６〜6.5、温度50℃で44時間糖化した。糖化液
の糖組成を高速液体クロマトウラフイーにより定
量した結果は第１表に示す通りであつた。 表から明らかなように、バシルス属β−アミラ
ーゼとα−1.6−グルコシダーゼに加えて、クレ
ブシラ・ニユーモニアのプルラナーゼを１単位加
えて糖化すると、無添加の場合に比べ、その他の
成分（オリゴ糖）が低下し、マルトースの収量が
2.9％増加した。 実施例 ２ 実施例１において、クレブシラ・ニユーモニア
のプルラナーゼの代りに、市販のエーロバクタ
ー・エーロゲネスのプルラナーゼ（ナガセ生化学
工業(株)製）を用いて、実施例１と同様にして、デ
ンプンの糖化を行つた、得られた結果は第２表の
通りであつた。 【表】 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バシルス属の生産するβ−アミラーゼとα−
   1.6−グルコシダーゼでデンプンを糖化してマル
   トースを製造するに際し、エーロバクター属また
   はクレブシラ属のプルラナーゼを存在させること
   を特徴とする高純度マルトースの製造法。