JPS6374489A - マルトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はマルトオリゴ糖の製造方法に関し、詳しくは特
定の担体に固定化した固定化マルトオリゴ糖生成アミラ
ーゼと固定化枝切り酵素を充填した反応器に澱粉液化液
を供給し、作用させることを特徴とするマルトオリゴ糖
の製造方法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］ 従来よりマルトースは麦芽、大豆等の植物由来のβ−ア
ミラーゼを用いて回分法により工業的に製造されている
が、マルトトリオース以上のグルコース重合度を有する
マルトオリゴ糖は、澱粉またはアミロースを酸または液
化型α−アミラーゼで部分加水分解して調製していた。

近年になり、澱粉またはアミロースに作用してマルトト
リオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、
″ｆシルトキサオース等のマルトオリゴ糖を特異的に生
成する各種マルトオリゴ糖生成アミラーゼが相ついで発
見され、各種オリゴ糖の工業的生産が期待されている。

マルトオリゴ糖生成アミラーゼとしては次のものが知ら
れている。

マルトース生成アミラーゼとしては、大豆、麦芽等の植
物起源のβ−アミラーゼ以外に、バチ／ｂス・ポリミキ
サ［Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、　Ｊ、　Ｒ
ｏｂｙｔａｎｄ　Ｄ、　Ｆｒｅｎｃｈ、　Ａｒｃｈ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　１０４゜３３Ｂ　（
Ｉｎ２）］、バチルス・セレウス［Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｅｒｅｕｓ、Ｙ、Ｔａｋａｓａｋｉ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｌｌ、。

す、１５１５τ１５２３　（１１３７Ｂ）　］、シュー
ドモナス属菌ｒＰｓｅｕｄｏｔａｏｎａｓ　ｓｐ、　　
Ｓ、５ｈｉｎｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、Ｆｅｒｍｅ
ｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、　５３．θ９３．−Ｅｌｌ１８　（１
１７５）］　　、ストレプトミセス・ヒゲロスコピカス
［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｇｃｏｐｉｃｕ
ｓ、　Ｙ、　Ｈｉｄａｋａ　ａｔ　ａｌ、、　５ｔａｒ
ｋｅ、　２Ｅｌ。

４１３　（１９７４）］　　、ストレプトミセス・プレ
コックス［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｒａｅｃｏｘ
、若生勝雄ら、澱粉化学。

２５、１５５　（１９７８）］等の微生物起源のマルト
ース生成アミラーゼがある。

また、マル））リオース以上のグルコース重合度を有す
るオリゴ糖を生成するアミラーゼとしては次のものが知
られている。

マルトトリオース生成アミラーゼ［若生勝雄ら：澱粉化
学、踵、　１７５　（１９７９）、ストレプトミセス・
グリセウス（５ｔｒｅ　ｔａＩｌｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｕｓ　）起源のもの；高碕義幸：昭和５８年度日本農芸
化学大会要旨集、ＰＩＢ９　（１１１１８３）　、バチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属起源のもの］ マルトテトラオース生成アミラーゼ［Ｊ、　Ｆ。

Ｒｏｂｙｔ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｊ、　　Ａｃｋｅｒｍａ
ｎ　　：　　Ａｒｃｈ、　　Ｂｉａｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１４５．１０５　（１１１７１）
　、シュードモナス・ストッツェリ　（Ｐｇｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ　）起源のもの］ マルトペンタオース生成アミラーゼ［Ｎ。

５ａｉｔｏ　：　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、、　１５５．２１１０（１９７３）、バ
チルス・リケニホルミス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒ＋ｗｉｓ　）起源のもの；小林ら；昭和５
８年度日本澱粉学会大会要旨集、Ｐ２Ｏ３（１９８３）
　；吉儀寺椿ら：昭和５９年度日本農芸化学大会要旨集
、Ｐ２Ｏ３（１９８４）　］ マルトヘキサオース生成アミラーゼ［Ｋ。

Ｋａｉｎｕｍａ　　ら　　：　　ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ
、、　　２旦、　　２８１　　（１１１１７２）　　、
エアロバクター・エアロゲネス　（Ａｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒａｅｒｏｇｅｎｅｇ　）起源のもの　；　Ｊ、　Ｆ、
　Ｋｅｎｎｅｄｙ　ａｎｄＧ、　Ａ、　Ｗｈｉｔｅ　：
　５ｔｏｒｋｓ、　３１．９３　（１９７９）　；呑口
ら：澱粉化学、２９．１０７　（１９Ｂ２）　；　Ｙ、
　Ｔａｋａｓａｋｉ　：Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｗ、、　４７．２１１３３　（１９８３）　］しか
しながら、］β−アミラーを除きこれらのマルトオリゴ
糖生成アミラーゼは一般のアミラーゼに比べて非常に高
価であり、それらアミラーゼを用いて製造されたマルト
オリゴ糖の試薬グレード品が少量生産されているにすぎ
ない。したがって、これらマルトオリゴ糖生成アミラー
ゼを用いて各種オリゴ糖を工業的に生産するためには、
これらアミラーゼを効率的に使用することが不可欠であ
る。その具体的手法としてこれらアミラーゼを固定化し
て使用することが考えられる。

そこで、本発明者らはオリゴ糖の効率的な製造法につい
て検討を重ね、各種マルトオリゴ糖生成アミラーゼを担
体に固定化する技術（特願昭８０−８１３４０号）を開
発すると共に、該固定化酵素を用いたマルトオリゴ糖の
製造方法（特願昭８０−１２５０９３号）を提案した。

さらに効率よく高純度のマルトオリゴ糖を得るべく研究
を重ねた結果、固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼと
固定化枝切り酵素を併用することによって目的が達成で
き、しかも固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼ単−系
よりも、より広範囲かつ高流速でカラム通液することが
可能であることを見出し、かかる知見に基いて本発明を
完成するに至った。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、固定化マルトオリゴ糖生成アミラー
ゼを固定化枝切り酵素と共に澱粉液化液に作用させるこ
とを特徴とするマルトオリゴ糖の製造方法を提供するも
のである。

本発明で使用する原料澱粉としては種々のものが使用で
きるが、通常馬鈴薯澱粉、せ薯澱粉。

コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、キャラサバ
澱粉等を用いる。また、反応器に通液する澱粉液化液の
グルコース当量（ＤＥ）は通常、１〜３５、好ましくは
５〜２０の範囲にあるものを用いるのが良い。ここで澱
粉液化液のＤＥがワキシーコーンスターチの場合１以下
、それ以外の澱粉ではＤＥが５以下のものは老化が激し
く、また老化を防止するために７０〜８０℃以上に加熱
保持する必要があり、工程上不利である。一方、ＤＥが
３５以上になると、グルコース、マルトース等の低分子
糖の生成が増大し、かつ目的とするマルトオリゴ糖の収
量が低下するので適当でない。なお、各種澱粉を液化す
る方法は特に制限はないが、通常は液化惧α−アミラー
ゼまたは塩酸等の酸で処理する。

次に、マルトオリゴ糖とはマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース等であり、マルトオリゴ糖生成アミラーゼ
とは前述の各種マルトオリゴ糖を生成するアミラーゼで
ある。

また、枝切り酵素としては、バチルス・アシドプルリテ
ィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙ
ｔｉｃｕｓ）およびタレブシエーラ・ニューモニア（Ｋ
ｌｅｂｇｉｅｌｌａｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ）起源のプル
ラナーゼやシュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｇｅｕ
ｄｏｍｏｎａｇ　ａｍｙｌｏｄｅｒａ−ｍｏｓａ　）、
サイトファーガ属菌（Ｇｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐ、）等
が生産するイソアミラーゼを用いることができるが、オ
リゴ糖生成アミラーゼはほとんどがｐＨ５，０〜８．５
の範囲に至適ｐＨを有するため、同様の安定かつ至適ｐ
Ｈ範囲を有する枝切り酵素を用１．％るの・が望ましい
。

酵素の固定化方法としては各種の方法が知られており、
その１つに物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法等
を含む担体結合法がある。この中、物理的吸着法、イオ
ン結合法は操作が簡単であり、酵素タンパク質の活性中
心の破壊あるいは高次構造の変化が小さく、また担体の
再生利用も容易であることから適当な相体を発見できれ
ば工業化に対して有望な方法と云える。

また、本発明者らが先に提案したマルトオリゴ糖生成ア
ミラーゼの固定化手段（特願昭８０−８１３４０号）も
有利な方法の１つである。この方法ではマルトオリゴ糖
生成アミラーゼの担体として、酵素との親和性が８０％
以上であり、かつ１００八以上の細孔径を有する細孔の
比表面積が２０〜３００Ｉ１２１ｇである多孔性担体を
使用する。ここで、酵素と担体の親和性は次の方法によ
り求めた値を意味する。

担体０．５ｇと２５　ＩＵの酵素（ｐＨ７，０の５ｈＭ
リン酸緩衝液２．０ｍ１）に溶解したもの）を５０ｍ１
＋三角フラスコに入れ、室温下で１時間、１２０ストロ
ーク。

４ｃｍ幅で振とうしながら酵素を担体に固定化したのち
沙過を行ない、得られたが液中の活性を測定して次式に
より酵素と担体との親和性を求める。

親和性を求める際に用いる酵素の純度は必ずしも限定さ
れるものではないが、好ましくは比活性が３０　Ｉｎ／
■ｇ・タンパク質以上あるものを使用する。なお、上記
酵素と相体の親和性は工業的に利用する場合の酵素活性
／担体重量比よりも低いレベルで求めたものであるが、
酵素と担体の親和性を知る尺度として重要である。すな
わち、実際に高い酵素活性／担体重量比において固定化
した酵素が基質に対し高い発現活性を示すものは上記親
和性についても高い値を示すことを本発明者らは見出し
ている。この親和性については、上記の如く８０％以上
であることが必要であるが、マルトテトラオース生成ア
ミラーゼ用担体の場合は８５％以上であることが好まし
く、その他のオリゴ糖生成アミラーゼ用担体の場合は８
０％以上であることが好ましい。これらの値は使用酵素
の起源および比活性によって決まる。ここで発現活性と
は以下の如く定義されるものである。

固定化酵素の発現する活性はその使用条件によって絶対
値が大きく変わるので、次のような測定条件を設定して
求めた。すなわち、固定化酵素１０ｍｇ（ｗｅｔ）を０
．５ｔｊｊの１０ｍＮリン酸バッファー（ｐＨｅ、ｏ〜
７．０）　（５０ｍｉ’三角フラスコ中）に加え、十分
に馴染ませた後、１０　ｗ／ｖ％可溶性澱粉（Ｍｅｒｃ
ｋ社製）　５．ＯｍＲを加えて４０℃でｌＯ分間往復振
とう機により１２０ストロ一ク／ｗｉｎ、４ｃｍ幅で振
とうしながら酵素反応を行ない、生成還元糖をＳｏｍｏ
ｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で測定し、発現する活性を求め
た。

また、枝切り酵素であるプルラナーゼを固定化した固定
化酵素の場合は、固定化酵素１０ｍｇ（ｗｅｔ）を０．
５ｍＪ）の１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ８，０）（
５０層ｐ三角フラスコ中）に加え、上記と同様に処理し
た後、同バッファーに溶解した１０％（ｗ／マ）プルラ
ン溶液５．０＋ｓｊ）を加え上記と同様の方法で発現活
性を求めた。

なお、１単位とは１分間にＩＩＬｌＯＩ！のグルコシド
結合を切断する酵素量を意味する。

この担体は、さらに以下の条件を満足するものであるこ
とを要する。すなわち、担体の１０ＯＡ以上の細・孔径
を有する細孔の比表面積が２０〜３００ｍ２／ｇ　、好
ましくは４０〜２ｏｏＩ１２／ｇテあルコトカ必要であ
る。この比表面積が３００＋ｅ２／ｇを越えると、担体
は強度が弱いものとなり、好ましくない。なお、マルト
テトラオース生成アミラーゼ用担体にあっては、さらに
４０Ｏ八以上の細孔径を有する細孔の比表面積が３〜１
００ｍ２／ｇ　、好ましくは５〜５ｈ２７ｇであること
が望ましい。

ここで、比表面積は水銀圧入法により測定した値である
。

上記の条件は、いずれか一方を満足するだけでは不十分
であり、すべての条件を同時に満たすものだけが基質に
対して高い反応性を示す。

多孔性担体としては上記特性を満足するものであれば、
素材、製法等を問わないが、通常はフェノール系吸着樹
脂、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着樹脂、トリアジ
ン系吸着樹脂、アクリルエステル系吸着樹脂９弱塩基性
アニオン交換樹脂などの多孔性合成樹脂が用いられる。

より具体的には、デュオライト系樹脂（ダイヤモンド・
ジャムロック社製）の商品名ｒＳ−７ＢＩＪ、　ｒＳ−
７Ｂ２Ｊ。

ｒＨＰ−１０Ｊ、　ｒＨＰ−２０Ｊ、　ｒＨＰ−５０Ｊ
、　ｒＳＰ−２０８Ｊなど；アンバーライト系樹脂（ロ
ーム・アンド・ハース社製）の商品名ｒＸＡＤ−７Ｊ、
　ｒＸＡＤ−８４ナトヲ挙ｉｆ　ル、：とができる。

また、多孔性担体の粒径については、発現活性が高けれ
ば特に制限はないが、通常は０．０５〜１．５ｍｍ　、
より好ましくは０．２〜１．０ｍｍのものを用いるのが
適当である。粒径が小さいことは酵素の固定化や発現活
性に対しては好ましい要因であるが、あまり小さいと、
固定化酵素を反応器に充填し、これに澱粉液化液を供給
したときに、圧力損失が大きいため、運転上不都合であ
る。一方、粒径があまり大きいと、酵素の固定化や発現
活性に対して効率的でない。

上記担体への酵素の固定化は各種の方法を適用しうるが
、最も一般的な方法は、前述したように、適当な緩衝液
に酵素を溶解し、この酵素液を担体と混ぜて攪拌する方
法である０次いで、濾過等の操作により固・液分離を行
ない、得られた固定化酵素を適当な緩衝液で洗浄する。

緩衝液としてはリン酸緩衝液（ＰＨ６〜７）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７〜９）または蒸留水などが好適に用い
られる。

酵素の固定化量は、用いる酵素およびその比活性や担体
の種類等によっても異なるが、通常は担体１ｇ当りタン
パク質として０．２〜１０００＋ｅｇ、好ましくは１〜
２００ｍｇが適当である。

酵素の固定化量が担体１ｇ当りタンパク質として０．２
ｍｇより少ない場合、固定化率が高く、効率的に固定化
することができるが、発現活性の絶対値が小さく、目的
成分の収量が少ない。一方、固定化量が担体１ｇ当りタ
ンパク質として１０００ｍｇよりも多い場合、酵素固定
化時の固定化率が低下するため、酵素の使用効率が悪い
ばかりでなく、発現活性として利用される割合も減少し
、好ましくない。そのほか上記方法で得られる固定化酵
素に対して適当な多官能性架橋剤、たとえばグルグルア
ルデヒドで処理することにより酵素の固定化活性の維持
性能を改良したものを用いても良い。

一方、枝切り酵素を固定化する担体については固定化操
作により高い発現活性を示すものであれば、どのような
担体でも使用できるが、特に以下に示す相体を用いるこ
とが好ましい。

樹脂１弱酸性カチオン樹脂、フェノール系吸着樹脂１粒
状多孔質キトサン参巻が好適であることを見出した。よ
り具体的には、デュオライト系樹脂（ダイヤモンド・ジ
ャムロック社製）、商品名ｒＳ−７８１」、　ｒＳ−７
ｆ１２」、　ｒＥＳ−７７１Ｊ、　ｒｅ−ａｅ４ノ、　
ｒＡ−７Ｊ。

ｒＳ−５８７Ｊ、　ｒＡ−５Ｅ１２Ｊや「キトパール」
　（富士紡績輛製）等を挙げることができる。また、固
定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼに対する固定化枝切
り酵素の使用比率については、後者の量を増すほど目的
のマルトオリゴ糖の濃度を高めることができるが、通常
は発現活性ベースで前者ｌに対し後者０．１〜５、好ま
しくは０．２〜２である。固定化枝切り酵素を上限以上
に用いても、マルトオリゴ糖の濃度向上効果が少なく、
反応器の大きさが比例的に大きくなり好ましくない。

本発明者らは、種々の固定化酵素を用いてマルトオリゴ
糖を効率よく生成するため条件について種々検討を重ね
た結果、次のような因子等が大きく影響していることが
判った。すなわち、使用する基質の種類、濃度およびそ
の供給量、固定化担体の種類（物性）、固定化した酵素
量、その充填塔への充填量、反応系の温度、ｐＨ等の条
件などである。

これらを系統的に検討した結果、これら因子等の影響は
以下に示す表現および条件の範囲内において効率よくマ
ルトオリゴ糖を生成することができることを見出した。

すなわち、本発明の方法は、固定化マルトオリゴ糖生成
アミラーゼと固定化枝切り酵素を併用して反応器に充填
し、前述の澱粉液化液を固定化マルトオリゴ糖生成アミ
ラーゼの単位活性あたりの重量基準空塔速度が１×１０
−４〜２　Ｘ　１Ｏ−１ｈｒ−’（ＩＩＩ／ｇ）−’、
好ましくは２Ｘ１０−４〜７　Ｘ　１Ｏ−２ｈｒ−１（
ＩＵ／ｇ）−’（７）条件で供給することによって効率
良くマルトオリゴ糖を製造するものである。ここで、固
定化酵素の単位活性あたりの重量基準空塔速度は次のよ
うにして求めた値である。まず、反応器に充填するもの
と同じ固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼ１０ｍｇ　
（ｗｅｔ）ヲ０．５ａｊ）の１ｈＭリン酸バッフｙ−（
ｐＨ７，０）　（５０ｍｆ三角フラスコ中）に加え、十
分に馴染ませた後、反応器に供給するものと同じ基質（
ｉ１９粉の種類、濃度等も同じ）　５．ｈｉ＋を加えて
、反応器と同じ温度で往復振とう機により１２０ストロ
一クス／ｗｉｎ、。

４ｃ＋ｅ幅で振とうしながら酵素反応を行い、生成還元
糖をＳｏｍｏｇｙ　１−Ｎｅ　ｌ５ｏｎ法で測定するか
、高速液体クロマトグラフィーのような分析機器で直接
生成するマルトオリゴ糖を測定して発現する活性を測定
する（この発現活性をＡ　　ＩＵ／ｇ−担体とする。）
。また、反応器に充填する固定化マルトオリゴ糖生成ア
ミラーゼをＢ　ｇ　（ｗｅｔ）　、反応器に供給する澱
粉液化液量を固形分としてＣｇ−固形分／ｈｒとすると
き、単位活性あたりの重量基準空塔速度をＣ／　（Ａ　
Ｘ　Ｂ　）　ｈｒ＝（ＩＵ／ｇ）−’として求める。な
お、ＤＥが大きい場合には原料中に目的とするマルトオ
リゴ糖やそれよりも小さい糖を含むので、上記Ｃの値と
してはそれらを除いた固形分量を用いるのがより実際的
である。単位活性あたりの重量基準空塔速度が２　Ｘ　
１０１ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ）川よりも大きいと、すなわ
ち反応器中での反応時間が短いと加水分解反応が十分に
おこなわれないため、マルトオリゴ糖の収率が悪くなり
好ま−しくない。

また、単位活性あたりの重量基準空塔速度が１×１Ｏ−
４ｈｒ　’　（ＩＵ／ｇ）弓よりも小さくなると、すな
わち反応器中での反応時間が長くなると、下記の刊行物
に明らかにされているように、生成したマルトオリゴ糖
がさらに過分解されるため、グルコース、マルトース等
の低分子の糖が生成され、製品の純度が著しく低下する
ばかりでなく、後に精製分離を行なう場合の効率を悪く
するので好ましくない。

上記したマルトオリゴ糖の過分解については、β−アミ
ラーゼを除くマルトオリゴ糖生成アミラーゼは、反応初
期にはそれぞれのオリゴ糖（マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス等）を特異的に生産するが、反応後期になるにつれて
生成物そのものを分解することが明らかにされている［
　Ｔ、　Ｎａｋａｋｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ　；　Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒｏ、Ｒｅｓ、、　１２８゜２１３７　（Ｉｎ
２）］。

複合固定化酵素系の場合、反応器の形態および充填方法
は種々考えられる。たとえば２種類の固定化酵素を別々
の容器に充填する方法、２種類の固定化酵素を混合して
から充填する方法、２種類のネイティブ酵素を一定の比
率にて混合した後、両酵素を同時に固定化して充填する
方法等がある。

これらのいずれの方法を用いても目的とする各種オリゴ
糖の生成量に大差はないが、固定化酵素を混合して充填
する方法が好ましい。

なお、２種類のネイティブ酵素を同時に固定化する場合
、マルトオリゴ糖生成アミラーゼと枝切り酵素の両者を
同時に効果的に固定化することが出来る担体を使用する
ことが必要である。このような担体としては、各種のも
のを使用しうるが、特に微弱酸性の多孔質吸着樹脂がす
ぐれていることが判明した。具体的に例示すると、デュ
オライト系樹脂の商品名ｒＳ−７８１Ｊ、　ｒＳ−７Ｂ
２Ｊ、　ｒＥＳ−７７１Ｊなどがある。

本発明の方法によりマルトオリゴ糖を製造する場合、マ
ルトオリゴ糖の目的とする純度に応じて様々な製造方式
をとり得る。たとえば純度２０〜８０％程度のマルトオ
リゴ糖は、０．５〜４０％（Ｗ／Ｗ）の澱粉液化液を前
述の固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼと固定化枝切
り酵素を充填した反応器に前述の条件で供給することに
よって得られる。

また、さらに高純度（８０〜１００％）のマルトオリゴ
糖は、上記反応器から得られた生成物をさらに精製分離
することにより得られる。この場合の精製分離手段は特
に制限はなく種々の方法をとりうるが、たとえば限外が
過、ゲルか過、カチオン交換樹脂カラムクロマトグラフ
ィー、カーボンカラムクロマトグラフィー等の手段が有
効である。また、上記精製分離を行なった際に得られる
未分解物の一部または全部を固定化酵素を充填した反応
器へ再循環させて供給原料の一部とすることによって原
料澱粉液化液あたりのマルトオリゴ糖収量を増大させる
ことができる。

固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼを単独で、もしく
は固定化枝切り酵素と共に充填した反応器に澱粉液化液
を供給するにあたり、澱粉液化液中のカルシウムイオン
濃度を適切な範囲に制御することによって、酵素の活性
維持性能を向上させうろことを見出した。すなわち、た
とえば固定化マルトテトラオース生成アミラーゼの場合
、澱粉を溶解させるために用いる水が水道水であるとき
、澱粉液化液中のカルシウムイオンが０．１〜５．０ｍ
Ｍ　、好ましくは０．２〜２．０ｍＭとなるように調整
することによって、このような調整を行わなかった場合
よりも活性維持性能を１．２〜１．５倍程度に改善する
ことができる。また、澱粉を溶解させるために用いる水
が蒸留水であるときは、澱粉液化液中のカルシウムイオ
ンが０．５〜１０ｍＭ、　好＊しくは１〜５ｍＭとなる
ように調整することにより、無調整の場合よりも活性維
持性能を２〜３倍程度に改善することができる。なお、
この特性は高温における連続運転下での安定性の向上に
顕著に認められる。マルトテトラオース生成アミラーゼ
以外の酵素の場合についても同様の効果がみちれる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ 担体としてデュオライト系吸着樹脂ｒＳ−７８１Ｊを用
い、マルトテトラオース生成アミラーゼ（シュードモナ
ス・ストッツェリ起源、比活性８０．８１０層ｍｇ・タ
ンパク）を固定化して固定化酵素を得た。すなわち、担
体２０ｇを５０ｒａＨＴｒｒｓ−ＨＣＲバッファー（ｐ
Ｈ７，０）で十分に平衡化した後。

１００ｍＡ＋−（７）同一バ”／　７７−に溶解した２
０．０００１Ｈの酵素を添加し、室温で１時間往復振と
う（３００１！三角フラスコ中１２０スト白−り／分、
４ｃｍ幅）しながら酵素を担体に固定化した。

次いで、濾紙により濾過した後、　１０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＲバッファー（ｐＨ７，０）でタンパクが溶出
しなくなるまで十分に洗浄し、発現活性が２５２　ＩＵ
／ｇ　−担体の固定化マルトテトラオース生成酵素を得
た。

また、枝切り酵素であるプルラナーゼ（クレブシェーラ
・ニューモニア起源、比活性５０１Ｕ／ｍｇ・タンパク
）を用いてｐＨ８，０のリン酸バッファーを使用したこ
と以外は上記と同様の方法で同一の担体に固定化し、発
現活性？４．９１■／ｇ−担体の固定化酵素を得た。

次に、直径２７鵬■、長さ１３０１履のガラスカラム２
本を用いて、一方にマルトテトラオース生成固定化酵素
１０層ｐを、他方にマルトテトラオース生成固定化酵素
１０ｍＪと固定化枝切り酵素８ｒａＲを混合（発現活性
比で前者：後者＝約４：１）ｌ、て充填した。これに基
質として２８．２％（Ｗ／Ｗ）の澱粉液化液（ＤＨ＝　
７　、　ｐＨ７，２）を用い、温度４５℃、流速２４ｍ
ｆ／ｈｒの条件で連続通液した。結果を第１図に示す。

第１図から明らかなように、両力ラム共に８５０時間の
連続運転を行なっても活性の低下は観察されなかった。

マルトテトラオース生成固定化酵素のみを充填したカラ
ム（カラムエ）ではマルトテトラオースの生成量が約４
５％（Ｗ／Ｗ）であるのに対し、マルトテトラオース生
成固定化酵素と枝切り固定化酵素を混合して充填した複
合酵素系（カラム■）の場合、約５０％（Ｗ／Ｗ）のマ
ルトテトラオースが生成した。

［発明の効果］ 実施例に示した結果は、他のマルトオリゴ糖生成アミラ
ーゼを用いた場合も同様であり、本発明により固定化マ
ルトオリゴ糖生成アミラーゼと固定化枝切り酵素を併用
することによって、目的とする各種マルトオリゴ糖の純
度の向上や単位活性あたりの重量基準空塔速度の拡大が
可能である。

したがって、本発明の方法は各種マルトオリゴ糖の工業
的な製造法として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は単一酵素系（カラムエ）と複合酵素系Ｃカラム
■）で連続通液した場合のマルトテトラオース生成量を
比較したグラフである。 特許出願人　　食品産業バイオリアクターシステム技術
研究組合

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼを固定化枝
   切り酵素と共に澱粉液化液に作用させることを特徴とす
   るマルトオリゴ糖の製造方法。
2. （２）固定化マルトオリゴ糖生成アミラーゼが多孔性担
   体に吸着せしめたものである特許請求の範囲第１項記載
   の方法。