JP2001524316A - 膜分離の段階を含む澱粉の酵素的糖化 - Google Patents

膜分離の段階を含む澱粉の酵素的糖化

Info

Publication number
JP2001524316A
JP2001524316A JP2000522265A JP2000522265A JP2001524316A JP 2001524316 A JP2001524316 A JP 2001524316A JP 2000522265 A JP2000522265 A JP 2000522265A JP 2000522265 A JP2000522265 A JP 2000522265A JP 2001524316 A JP2001524316 A JP 2001524316A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
saccharification
membrane separation
strain
amylase
retains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000522265A
Other languages
English (en)
Inventor
シー． リアウ，ギアン
スベン ペデルセン
バン ヘンドリクゼン，ハンネ
スベンゼン，アラン
レーンフェルト ニールセン，ビャルネ
イルム ニールセン，ルビー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of JP2001524316A publication Critical patent/JP2001524316A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１つ又は複数の酵素的な糖化のステージを含む糖化の段階、並びにそれに続く１つ又は複数の高温の膜分離の段階、及び糖化酵素の再循環の段階を含んで成り、本方法における膜分離の段階が糖化の段階の一体部分として行われ、液化澱粉を糖化することによる、糖製品、すなわちシロップの製造方法に関する。他の特定の観点において、本発明は、糖製品の製造方法を提供し、この方法は酵素的な糖化の段階、及び、続く段階、１つ又は複数の高温の膜分離の段階及び糖化酵素の再循環を含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、デキストロース、トレハロース、イソマルトオリゴ糖類、シクロデ
キストリン類及びマルトオリゴ糖類を含む、澱粉からの単糖類及び／又はオリゴ
糖類の製造に関する。特定の観点において、本発明は液化澱粉溶液の糖化の方法
を提供し、この方法は１つ又は複数の酵素的な糖化のステージを含む糖化の段階
、並びにそれに続く段階である１つ又は複数の高温の膜分離の段階、及び糖化酵
素の再循環を含んで成り、この方法において、膜分離の段階は糖化の段階の一体
部分として実行される。
【０００２】 他の特定の観点において、本発明は単糖及び／又はオリゴ糖、例えばデキスト
ロース、トレハロース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン類及びマルト
オリゴ糖製品の製造方法を提供し、この方法は酵素的な糖化の段階、並びに続く
１つ又は複数の高温の膜分離の段階及び糖化酵素の再循環の段階を含んで成る。 技術の背景 糖類を以下の二つのグループに分類することができる：１）単糖類及び２）単
糖に加水分解されうる糖類。２〜１０の単糖類に加水分解されうる糖類は“オリ
ゴ糖類”と称され、一方１０以上の単糖類に加水分解されうるそのような糖類は
“多糖類”と称される。
【０００３】 澱粉から糖への変換 澱粉が糖に変換される場合において（例えば、その澱粉が解重合される）、そ
の様な解重合の工程は、前処理の段階及び二つ又は三つの連続的な工程の段階、
すなわち液化の工程、糖化の工程、及び所望の最終生成物に任意に依存する異性
化の工程から成る。天然澱粉の前処理 天然澱粉は微細な顆粒から成り、室温で水に不溶である。水性の澱粉スラリー
が加熱されるとき、その顆粒は膨張し、ついには破裂し、澱粉分子を溶液に分散
させる。この“ゼラチン化”工程の間、粘性の劇的な増大がある。固体の濃度は
典型的な工業工程において３０〜４０％であるので、それを扱いやすいように、
薄めるか又は“液化”しなければならない。この粘性の低下は、今日主に酵素的
な分解により得られる。液化 液化の段階の間、長鎖の澱粉は、α−アミラーゼ（例えば、ターマミルTM）に
よって分枝及び直鎖の短かい単位（マルトデキストリン）に分解される。液化の
工程は５〜１０分間、１０５〜１１０℃、続いて９５℃で１〜２時間で行われる
。pHは５．５と６．２の間である。これらの条件下で最適な酵素を安定化させる
ことを確実にするために、１mMのカルシウム（４０ppm の遊離カルシウムイオン
）を加える。この処理の後、液化澱粉は１０〜１５の“デキストロース当量”（
ＤＥ）を有するようになる。糖化 液化の工程の後、マルトデキストリン類は、グルコアミラーゼ（例えばＡＭＧ TM ，Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから入手可能）及び枝切り酵素、例としてイソア
ミラーゼ（例えば、ＵＳ特許４，３３５，２０８）又はプルラナーゼ（例えばプ
ロモザイムTM、ＵＳ特許４，５６０，６５１参照）の添加によりデキストロース
に変換される。この段階の前に、枝切り酵素によって適当に加水分解出来ない、
“パノース前駆体”と称される短かいオリゴ糖を形成する液化α−アミラーゼを
不活性化するために、pHを４．５以下の値に下げ、高温（９５℃以上）を維持す
る。伝統的に、本温度は約６０℃以下であり、そしてグルコアミラーゼ及び枝切
り酵素を加える。糖化の工程は２４〜７２時間かけて進行する。
【０００４】 通常、液化の段階の後にα−アミラーゼを変性したとき、糖化製品の約０．２
〜０．５％が分枝三糖６2 −α−グルコシルマルトース（パノース）であり、こ
れはプルラナーゼによって分解されない。もし液化の段階由来の活性アミラーゼ
が、糖化の間存在（すなわち無変性）、するならば、この濃度は１〜２％程度の
高さであり、これは糖化の収率を有意に低下させるので大変好ましくない。
【０００５】 上述の前処理及び液化の段階は、糖化又は加水分解の段階のための液化澱粉を
提供するために、適当に使用されうる。デキストロースシロップ デキストロース（Ｄ−グルコース）シロップは澱粉から糖への酵素的な変換（
例えば上述した様に）により製造されうる。糖への澱粉の酵素的な変換は、続く
液化及び糖化の段階を含む。この方法において、高デキストロースシロップ、一
般的に９５〜９６％のＤＸ（ＤＸはシロップの乾燥物質（ＤＳ）に基づいて算出
されたデキストロース（Ｄ−グルコース）の重量パーセントを意味する）を得る
ことができる。副生物は、例えばマルトース、イソマルトース及びパノースであ
る。もし高デキストロース含有のシロップを望むならば、精製は結晶化により成
し遂げられうる。マルトオリゴ糖シロップ マルトオリゴ糖シロップは、４０〜８０％以上のマルトース（Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコピラノース）を含んで成るシロップで
ある。マルトースは、α−１，４位で結合した、二つのグルコース単位から成る
還元水溶性二糖である。
【０００６】 マルトオリゴ糖シロップは、今日一般的に以下に記述する様に酵素的に製造さ
れる。イソマルトオリゴ糖シロップ イソマルトオリゴ糖シロップは、時には“アロ混合物”に関し、そしてイソマ
ルトース（Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−６）−Ｄ−グルコピラノース
）、パノース、イソマルトトリオース並びに４つ及び５つのグルコース残基から
成る他のいくつかの分枝オリゴ糖を含む混合物と定義される。“アロ混合物”シ
ロップは液化の段階において、温度安定性の微生物α−アミラーゼを用いて澱粉
から酵素的に製造されうる。次の段階において、液化澱粉は、β−アミラーゼ及
びトランスグルコシダーゼを同時に用いる加水分解又は糖化がなされる。トレハロースシロップ トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）は、α
−１，１結合による二つのグルコース残基が結合した非還元二糖である。
【０００７】 澱粉又はマルトオリゴ糖類からトレハロースを製造するための酵素的な工程は
、例えばKatoら、(1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), p.546-550) ;
Kazuhisaら (1997), Starch 49, no. 1. p.26-30によって；及びＥＰ７６４，７
２０において記載されている。シクロデキストリンシロップ シクロデキストリン類はグルコース単位がα−１，４結合によって供に結合し
た閉還構造のオリゴ糖類である。６，７又は８個のグルコース単位を含むシクロ
デキストリン類が、最も一般的で、そして、それぞれがα、β及びγ−ＣＤとし
て知られている。
【０００８】 シクロデキストリン類は、ＣＧＴａｓｅと省略される、シクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１９）の酵素を用いて澱粉から酵
素的に製造されうる。ＣＧＴａｓｅは澱粉及び類似の基質を分子内トランスグリ
コシル化反応経由でシクロデキストリン類に触媒し、それにより様々な大きさの
シクロデキストリン類を形成する。
【０００９】 ＪＰ３−２２４４９３は、糖への澱粉の酵素的な変換を記載し、この工程にお
いて糖溶液は、澱粉糖画分及び高分子のデキストリン類を含む画分を得るための
膜分別にかけられ、そしてデキストリン画分の適当な上流位置へのフィードバッ
クを記載している。 ＪＰ１−１９１６９３は、反応を引き起こすために５０〜６０℃でグルコアミ
ラーゼ酵素を液化澱粉に加えること、それに続く連続的な分離及び膜を通過して
生じたグルコースの回収による糖化の工程を記載している。
【００１０】 ＪＰ６２−２７２９８７は、グルコアミラーゼ酵素が液化澱粉に加えられるこ
とによる糖化の工程及びその糖化が半透膜の内側で行われること、そして形成し
たグルコースが外側に放出されることを記載している。液化澱粉の分子量分布は
酵素の添加及び保持時間を決定する。膜分離 膜分離の工程は、以下の４つの基本的な工程：逆浸透、ナノ濾過、限外濾過及
び精密濾過を含む。
【００１１】 逆浸透は液／液分離における可能な最も隙間のない膜の工程である。原則とし
て、水が膜を通過する唯一の物質である。本質的に全ての溶解及び懸濁物質が退
けられる。逆浸透膜のより開いた型は、時にナノ濾過と混同される。 ナノ濾過は逆浸透に類似しているが、しかし膜がわずかに開いている。一価の
イオンが水と供にナノ濾過膜を全く自由に通過することができる。多価の負のイ
オンは良いナノ濾過膜によってほぼ完全に退けられる。本発明に関して“ナノ濾
過”はグルコースの二及び三糖分子を退ける一方で、デキストロース分子を通過
させる大きさの孔を有するナノ濾過膜を通過する浸透液を含むデキストロースの
濾過を意味すると考えられる。
【００１２】 限外濾過は高分子量の化合物のみ、例えばタンパク質、及び懸濁した固形物を
退ける。全ての低分子量の化合物は、自由にこの膜を通過する。その結果として
単糖類及び二糖類、塩類、アミノ酸、有機酸、無機酸又は水酸化ナトリウムの拒
絶が無い。 精密濾過は、観念的に懸濁した、可視の固体のみを退け、その一方でタンパク
質でさえ自由に膜を通過する。
【００１３】 デキストロース、マルトース及び塩類を含む水性の混合物は逆浸透又はナノ濾
過の膜を通じた拡散によって濃縮されうるのに対して、その様な膜は普通マルト
ース及び塩類の除去によるデキストロースの精製を行う能力が無い。又、慣習的
な限外濾過が異なる分子量の化合物の精製又は分離のための手段を提供する一方
、マルトース及びデキストロースの様な類似の化合物を全く分離又は精製するこ
とが出来ない。
【００１４】 ＥＰ４５２，２３８はデキストロース９９％以上のデキストロース製品の製造
方法を記載し、この方法は約６０℃における９５〜９６％ＤＸシロップのナノ濾
過を含んで成る。この温度は微生物の増殖の問題を最小にするための、濃縮液の
粘性を下げ、ポンプの経費を下げるための、物質移動を改良するための使用を示
唆している。又、ＥＰ４５２，２３８は流出材料（これは濃縮液の部分を構成し
ている）をいくつかの適当な上流点に戻す事を示唆している。ＥＰ４５２，２３
８は、酵素の再配分に関して記載していない。 発明の要約 デキストロース、トレハロース、イソマルトオリゴ糖類、シクロデキストリン
類及びマルトオリゴ糖類を含む、単糖類及び／又はオリゴ糖類の澱粉からの製造
の方法において、液化の段階の後、糖化（又は加水分解）の段階において、本シ
ロップが１つ又は複数の高温の膜分離の段階にかけられ、そして糖化の酵素が糖
化の段階に戻されるならば、効率が有意に改良され、そして経費は下がる事が現
在明らかになっている。本発明の方法に関して、膜分離の段階は、糖化の段階の
一体部分としてみなされうる。
【００１５】 本発明の文脈において、“糖化の段階”及び“加水分解の段階”又は“糖化”
及び“加水分解”の語は液化の段階の後の段階に関する。これらの語は以下の様
に置き換えて使用される。 ナノ濾過の段階の効率は、デキストロースを製造するとき、上昇した温度（す
なわち６３℃以上）で精製工程が行われるならば更に増大することがまた見出さ
れた。更に、反応の間に形成した副生物の量は、低グルコース含量のグルコース
溶液（シロップ）が膜分離の段階に使用されるとき、減少する事が見出された。
これはより簡単に獲得できる高純度のデキストロースシロップ、及びデキストロ
ース製品のより効率的な精製のために使用される。最終的に、温度安定性酵素の
使用により収率が改善され、そして経費が節減する。
【００１６】 一つの糖単位以上、すなわち、トレハロース、イソマルトオリゴ糖類、シクロ
デキストリン類及びマルトオリゴ糖類を有する糖類を製造するとき、加水分解の
段階（液化の段階の後）に限外及び精密濾過の段階又は精密及び限外濾過の段階
が続く。 それ故に、この第一の観点において、本発明は液化澱粉溶液の糖化の方法を提
供し、この方法は （ｉ）一つ又は複数の酵素的な糖化のステージを含む糖化の段階、並びにこれ
に続く、 （ii）一つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （iii ）糖化酵素の再循環； を含んで成り、この方法において、膜分離の段階は糖化の段階の一体部分として
行われる。
【００１７】 この第二の観点において、本発明は例えばデキストロース、トレハロース、イ
ソマルトオリゴ糖類、シクロデキストリン類及びマルトオリゴ糖類の単糖及び／
、又はオリゴ糖の製品の製造方法を提供し、この方法は酵素的な糖化の段階、並
びにこれに続く （ｉ）１つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （ii）糖化酵素の再循環； の段階を含んで成る。
【００１８】 デキストロース製造の好ましい態様において、高温の膜段階は精密及び限外濾
過又はナノ濾過の段階と組合わせた精密及び限外濾過を含む。 発明の詳細な開示糖化方法 この第一の観点において、本発明は液化澱粉溶液の糖化の方法を提供している
。
【００１９】 効率的な糖化の段階を得るために、本段階は普通、一つ又は複数のステージを
含んで成り、この間反応混合物のデキストロース含量は除々に増大する。それ故
に、本発明に関する糖化の段階は、添付した図に図解して例示した様に、一つ又
は複数の糖化の段階（段階１〜段階ｎ）を含んで成る。 本方法は以下の段階： （ｉ）一つ又は複数の酵素的な糖化のステージを含む糖化の段階、並びにそれ
に続く （ii）一つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （iii ）糖化酵素の再循環； を含んで成る。
【００２０】 本発明に関して、膜分離の段階は、糖化の段階の一体部分と考えられ、膜分離
の段階は糖化の段階の付加的なステージとして考えられうる。 本発明の文脈において、高温の膜分離の段階が６０℃以上の温度、好ましくは
６３℃以上の温度、更に好ましくは約６３〜約８０℃の範囲の温度で達成される
膜分離である。 本発明の膜分離において、膜分離にかけられる供給流は糖化の段階から生じ、
そして膜分離からの濃縮液は糖化の段階へと再循環する。
【００２１】 上述した様に、糖化の段階は普通、一つ又は複数の糖化のステージ（図１参照
）を含んで成る。しかしながら、糖化の段階は一つから少数の段階を含んで成る
、一つ又は複数のバッチ法としても達成されうる。本発明の好ましい態様におい
て、糖化の段階は１〜６４の糖化のステージ、より好ましくは１〜３２の糖化の
ステージを含んで成る。
【００２２】 本発明の方法に関して、膜分離からの濃縮液は糖化の段階に運び返される（再
循環）。好ましくは、膜分離からの濃縮液は、糖化の段階における糖化のステー
ジに再循環され、このステージにおいて反応混合物の内容は、糖、例えばグルコ
ース、トレハロース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン又はマルトオリ
ゴ糖に関する濃縮液の内容と一致する。
【００２３】 特に、例えば高グルコース含有量の濃縮液は、グルコース含有量が有意に少な
い糖化のステージへの再循環されるべきではない。同様の事が本発明に関すると
考えられる他の糖類に適用される。 好ましい態様において、デキストロースを製造するとき、糖化のステージから
生ずる、膜分離にかけられる供給流は、約５０〜約９６％のＤＸ、好ましくは約
６０〜９６％のＤＸ、より好ましくは８０〜９６％のＤＸを保持する。
【００２４】 マルトオリゴ糖類を製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離にかけ
られる供給流は約３０〜８０％以上、例えば３０〜４０％マルトース又は５０〜
５５％マルトース又は５５〜６５％マルトース又は７０〜７５％マルトース又は
８０％以上のマルトースを保持する。 イソマルトオリゴ糖類を製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離に
かけられる供給流は、約１０〜４０％イソマルトースを保持する。
【００２５】 トレハロースを製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離にかけられ
る供給流は約５０〜約９０％、好ましくは約６０〜９０％、更に好ましくは約７
５〜９０％トレハロースを保持する。 シクロデキストリン類を製造するとき、還化の段階から生じる、膜分離にかけ
られる供給流は、約３０〜６０％シクロデキストリン類を保持する。
【００２６】 本発明の文脈において、膜分離の段階はデキストロースを製造するときの精密
濾過の段階、限外濾過の段階、及び／又はナノ濾過の段階、すなわち精密濾過の
段階、限外濾過の段階、及びナノ濾過の段階を単独又は組み合わせて含んで成る
。 本発明の文脈において、膜分離の段階は、トレハロース、イソマルトオリゴ糖
類、シクロデキストリン類及びマルトオリゴ糖類を製造するとき、精密濾過の段
階に続く限外濾過の段階、又は限外濾過の段階に続く精密濾過の段階を含んで成
る。
【００２７】 ナノ濾過の段階は、グルコースより大きな糖類がナノ濾過膜を自由に通過して
流れる事が出来ない様な後述する事例を含まない。 以下の表１において、様々な膜分離工程のためのカットオフ値の特性を述べる
。
【００２８】
【表１】
【００２９】 好ましい態様において、膜分離の段階は、精密濾過の段階及び限外濾過の段階
を含んで成り、記載された順序で適用される。この態様は、約９５〜約９６％グ
ルコース、又は１０〜４０％イソマルトース、又は３０〜８０％以上のマルトー
ス、又は７５〜９０％トレハロース、又は３０〜６０％シクロデキストリン類を
保持するシロップの製造に特に有用である。
【００３０】 更に好ましい態様において、デキストロースを製造するとき、膜分離にかけら
れる本供給流は約９０〜９６％のＤＸを維持し、この事例において、膜分離にか
けられる供給流は糖化の段階の後の部分、好ましくは非常に後の糖化のステージ
に由来である。 別の好ましい態様において、デキストロースを製造するとき、膜濾過の段階は
精密濾過の段階及びナノ濾過の段階、好ましくは記載した順序で適用される濾過
の段階を含んで成る。この態様は、低デキストロース含量のデキストロース溶液
（シロップ）が膜分離の段階に適用される際、反応の間に形成する副生物の量が
減少するので、高純度のデキストロース製品の獲得に、特に有用である。好まし
くは、糖化のステージから生じる、膜分離にかけられる供給流は約８０〜約９２
％ＤＸのデキストロースを保持するべきである。この態様は、９９％ＤＸ以上の
、すなわち約９９〜９９．８％ＤＸの、デキストロースを保持するデキストロー
ス製品の製造にとって理想的である。好ましくは、膜分離にかけられる供給流は
糖化の段階の途中で生じる。更に特定の観点において、濃縮液は供給流を生じる
ステージと比較して後に位置する糖化のステージにおいて糖化の段階に再分配さ
れる。
【００３１】 更に他の好ましい態様において、膜分離の段階は精密濾過の段階、限外濾過の
段階及びナノ濾過の段階、好ましくは記載した順序で適用される濾過の段階を含
んで成る。この態様は約９９〜９９．９％ＤＸを保持するデキストロース製品の
製造に特に有用である。製造方法 この第二の観点において、本発明はシロップの製造方法を提供し、このシロッ
プは二つの段階において、澱粉の酵素的な変換によって製造される。糖への澱粉
の酵素的な変換は、次の液化及び糖化の段階を含む。デキストロースの製造 糖化の段階において、液化の段階から生じる供給流はグルコアミラーゼ酵素（
ＥＣ３．２．１．３）、及び／又は枝切り酵素の作用にかけられ、これらはプル
ラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、及び／又はイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．
１．６８）でありうる。マルトオリゴ糖の製造 今日マルトオリゴ糖シロップの幾らかは、大規模に製造されているものである
。以下の方法は、高マルトース含量の商業上利用可能な製品の典型的な製造方法
の例である。 低マルトースシロップ（３０〜４０％のマルトースを含む）の製造 低マルトースシロップを製造するために、澱粉を１０〜２０のＤＥまで液化す
る。液化澱粉の温度及びpHを、７０℃及びpH約５．０にそれぞれ調整し、１８〜
４２時間マルト生成アミラーゼ活性（例えばマルトゲナーゼTM４０００Ｌ，１５
０ml／ｔ ＤＳ）及びα−アミラーゼ活性（例えばターマミルTM１２０Ｌ，２０
０ｇ／ｔ ＤＳ）にかける。本工程の時間は、希望に達した糖スペクトルに依存
する。
【００３２】 α−アミラーゼ活性（例えばターマミルTM）の投与量はデキストロース及びマ
ルトトリオースの濃度に影響し、すなわち多量の投与は高濃度を生じる。更にマ
ルト生成にアミラーゼ活性の投与量は組成に影響し、そのため多量の投与は高い
デキストロース及びマルトース濃度、しかし低いマルトトリオース濃度を生じる
。 高マルトースシロップ（５０〜５５％マルトースを含む）の製造 高マルトースシロップを製造するために、澱粉を１０〜２０のＤＥまで液化す
る。液化澱粉のpH及び温度を、６５℃及びpH５．０の周辺にそれぞれ調整し、マ
ルト生成アミラーゼ活性（例えばマルトゲナーゼTM４０００Ｌ，０．４ｌ／ｔ
ＤＳ）、プルラナーゼ活性（例えばプロモザイムTM６００Ｌ，０．３ｌ／ｔ Ｄ
Ｓ）及びα−アミラーゼ活性（例えばＢＡＮ ２４０Ｌ又はターマミルTM１２０
Ｌ，ＬＳ型、０．４kg／ｔ ＤＳ）に２４〜４１時間かける。特定の工程の時間
は、希望に達した糖スペクトルに依存する。マルト生成アミラーゼ及びプルラナ
ーゼの投与が増加することによって、マルトース含量が増加しうる。
【００３３】 代わりとして、最初に澱粉をＤＥ１０〜２０まで液化し、そして次にpH及び温
度を５５℃及びpH５．５周辺にそれぞれ調整し、そして液化澱粉を菌類のα−ア
ミラーゼ活性（例えばフンガミルTM８００Ｌ）に２２〜２４時間かけることによ
って高マルトースシロップを製造しうる。菌類のα−アミラーゼの投与は、予測
した糖化時間に依存し、例えば４４時間のためには２００ｇ／ｔ ＤＳ及び２２
時間のためには４００ｇ／ｔ ＤＳである。
【００３４】 高マルトースシロップを製造するために、５５〜６５％澱粉含量のマルトース
と一緒の澱粉をＤＥ１０〜２０にまで液化する。液化澱粉のpH及び温度を６０℃
及びpH６の周辺にそれぞれ調整し、マルト生成アミラーゼ活性（例えばマルトゲ
ナーゼTM４０００Ｌ，０．２５〜１．０ｌ／ｔ ＤＳ）、及び菌類のα−アミラ
ーゼ活性（例えばフンガミルTM８００Ｌ，０．４〜１．０kg／ｔ ＤＳ）に２４
〜４８時間かける。
【００３５】 代わりとして液化澱粉は６５℃の温度及びpH５．０の周辺に調整され、マルト
生成アミラーゼ活性（例えばマルトゲナーゼTM４０００Ｌ，０．５〜１．０ｌ／
ｔ ＤＳ）、及びプルラナーゼ活性（例えばプロモザイムTM６００Ｌ，０．５〜
１．０ｌ／ｔ ＤＳ）に１８〜４２時間かけられうる。 極めてマルトースが高含量のシロップ（７０〜７５％マルトースを含む）の製造 極めてマルトースが高含量のシロップを製造するために、澱粉を最大のＤＥに
まで液化する。液化澱粉のpH及び温度を約５８℃及びpH５．５の周辺にそれぞれ
調整し、そしてプルラナーゼ活性（例えばプロモザイムTM６００Ｌ，１ｌ／ｔ
ＤＳ）、３〜４kg／ｔ ＤＳのマルト抽出物（約４００°のリントナー）又は１
kg／ｔ ＤＳのβ−アミラーゼ（１５００°のリントナー）の作用に約２日間か
ける。
【００３６】 液化の後のＤＥは、最終的なマルトース含量に影響し、ＤＥが高いほど、マル
トースの割合が低い。ＤＳは最終的なマルトース含有量に影響し、ＤＳが高いほ
どマルトースの割合が低い。 過度にマルトースが高含量のシロップ（８０％以上のマルトースを含む）の製造 過度にマルトースが高含量のシロップを製造するために、澱粉を最大１０のＤ
Ｅ，ＤＥ３０％まで液化する。液化澱粉のpH及び温度を５８℃及びpH５．５の周
辺にそれぞれ調整し、そしてマルト生成アミラーゼ活性（例えばマルトゲナーゼ TM ，４０００Ｌ，１．５ｌ／ｔ ＤＳ）、プルラナーゼ活性（例えばプロモザイ
ムTM６００Ｌ，１ｌ／ｔ ＤＳ）及び１kg／ｔ ＤＳのマルト抽出物（１５００
°のリントナー）に２４〜７２時間の期間かける。特定の工程の時間は希望に達
した糖スペクトルに依存する。トレハロースの製造 （７５〜９０％トレハロースを含む。） 糖化の段階において、トレハロースを製造するとき、液化澱粉は、初めに分子
内トランスグリコシレーションによってマルトオリゴ糖（液化の段階の由来）を
非還元糖マルトオリゴシルトレハロースへ変換し、続いて次の段階である最初の
段階の反応生成物（すなわちマルトオリゴシルトレハロース）をトレハロースに
加水分解することの出来る酵素の作用にかけられる。この糖化の段階はマルトオ
リゴシルトレハロースシンターゼ（ＭＴＳａｓｅ）及びマルトオリゴシルトレハ
ローストレハロハイドロラーゼ（ＭＴＨａｓｅ）を用いて行われ、例えば、この
二つの酵素はMasaruら、(1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), 546-550
に記載されている。ＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨａｓｅはトレハロースを製造するア
ミロース又は澱粉に作用する。
【００３７】 澱粉又はマルトオリゴ糖類からのトレハロースの他の酵素的な製造方法（Kato
ら、(1996), Biosci. Biotech. Biochem. 60 (3), p.546-550 参照）はトレハロ
ース製造酵素であり、超好熱古細菌スルフォロブスソルファタリカスＫＭ１由来
のグリコシルトランスフェラーゼ及びアミラーゼをそれぞれ含む。 更に、ＥＰ７６４，７２０も、澱粉又はマルトオリゴ糖類からトレハロースを
製造するためのスルフォロブス種由来の二つの酵素の使用を記載している。シクロデキストリン類の製造 （３０〜６０％シクロデキストリン類を含む） シクロデキストリンシロップは出発物質として澱粉を酵素的に使用することで
製造しうる。澱粉の大量製造は、最初の段階において澱粉を液化するために１０
５〜１１０℃の温度でのジェットクッキングを必要とする。液化の段階の後、還
化反応を行うためにＣＧＴａｓｅを加える。好熱性の嫌気性類、例えばサーモア
ナエロバクター由来のＣＧＴａｓｅを使用する場合において、１５〜３０％ＤＳ
の澱粉を約１０５°，pH５．０〜６．０で５分間ジェットクックする。ＣＧＴａ
ｓｅ（２５〜５０NU／ｇ ＤＳ）をα−アミラーゼ（例えばサーマミルTM）と一
緒にジェットクッカーに直接加えることができる。ＣＧＴａｓｅは本ステップに
おいて必要な温度以上で活性及び安定性を維持する。そして次の還化のステップ
は９０℃周辺の温度で４〜２４時間行われる。イソマルトオリゴ糖の製造 （１０〜４０％イソマルトースを含む） イソマルトオリゴ糖シロップ又は“アロ混合物”は、温度安定性微生物のα−
アミラーゼを用いて液化の段階を最初に行うことによって澱粉から製造されうる
。澱粉の加水分解の値（ＤＥ）は６〜１０の間に保たれる。次に液化澱粉をβ−
アミラーゼ（例えば大豆のβ−アミラーゼ）及びトランスグルコシダーゼ（例え
ばアスペルギルス・ニガー由来）に同時に、それぞれ澱粉あたり２〜４ｇ及び０
．２〜０．３ｇ／kg，６０℃，pH５．０で約７２時間かける。反応混合物を精製
し、そしてイソマルトオリゴ糖製品を得るために濃縮する。
【００３８】 効率のよい糖化を得るために、糖化の段階は普通、一つ又は複数のステージを
含んで成り、この間に反応混合物のデキストロース含量は除々に増大する。それ
故に、本発明に関する糖化の段階は、添付した図に図解して例示した様に、一つ
又は複数の糖化のステージを含んで成る。 本発明の方法は酵素的な糖化の段階、並びにこれに続く： （ｉ）一つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （ii）糖化酵素の再循環； の段階を含んで成る。
【００３９】 本発明の文脈において、高温の膜分離段階は、６０℃以上の温度、好ましくは
６３℃以上の温度、更に好ましくは約６３から約８０℃の範囲の温度で達成され
る膜分離である。 本発明に関して、膜分離の段階は、糖化の段階の一体部分と考えられうる。事
実、膜分離の段階は上述した様な糖化段階の付加的なステージとしても考えられ
うる。
【００４０】 本発明の膜分離において、膜分離にかけられる供給流は糖化の段階から生じ、
そして膜分離からの濃縮液は糖化の段階へと再循環する。 上述した様に、糖化の段階は普通、一つ又は複数の糖化のステージを含んで成
る。特に、糖化の段階は一つから少数の段階を含んで成る、一つ又は複数のバッ
チ工程として達成しうる。本発明の好ましい態様において、糖化の段階は１〜６
４の糖化のステージ、更に好ましくは１〜３２の糖化のステージを含んで成る。
【００４１】 別の好ましい態様において、膜分離にかけられる供給流は、糖化の段階を構成
するステージの後半分の部分における糖化のステージから生じる。好ましくは、
膜分離にかけられる供給流は、極めて後の糖化のステージから生じる。 本発明の方法に関して、膜分離からの濃縮液は糖化の段階に運び返される（再
循環）。更に特別には、膜分離からの濃縮液は、糖化の段階における糖化のステ
ージへ再循環し、このステージにおいて反応混合物の内容は、グルコース（ＤＸ
により決定）に関する濃縮液の内容と一致する。
【００４２】 特に、高グルコース含量の濃縮液は、グルコース含量が有意に少ない糖化のス
テージへと再循環されるべきではない。 好ましい態様において、デキストロースを製造するとき、糖化のステージから
生ずる、膜分離にかけられる供給流は、約５０〜約９０％ＤＸ、好ましくは約６
０〜９０％ＤＸ、より好ましくは７５〜９０％グルコースを保持する。
【００４３】 マルトオリゴ糖類を製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離にかけ
られる供給流は約３０〜８０％以上、例えば３０〜４０％マルトース又は５０〜
５５％マルトース又は５５〜６５％マルトース又は７０〜７５％マルトース又は
８０％以上のマルトースを保持する。 イソマルトオリゴ糖類を製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離に
かけられる供給流は、約１０〜４０％イソマルトースを保持する。
【００４４】 トレハロースを製造するとき、糖化のステージから生ずる、膜分離にかけられ
る供給流は約５０〜約９０％、好ましくは約６０〜９０％更に好ましくは約７５
〜９５％トレハロースを保持する。 シクロデキストリン類を製造するとき、還化の段階から生じる、膜分離にかけ
られる供給流は、約３０〜６０％シクロデキストリン類を保持する。
【００４５】 本発明の文脈においてデキストロースを製造するとき、膜分離の段階は精密濾
過の段階、限外濾過の段階、及び／又はナノ濾過の段階を含んで成る。上述の表
１において、様々な膜分離過程のカットオフ値の特性を述べている。 好ましい態様において、膜分離の段階は、精密濾過の段階、限外濾過の段階及
びナノ濾過の段階を含んで成り、これらは記載した順序で適用される。この態様
は約９５〜約９６％ＤＸを保持するデキストロース製品の製造に特に使用される
。より好ましい態様において、膜分離にかけられる供給流は約９０〜約９６％Ｄ
Ｘを保持し、この場合、膜分離にかけられる供給流は、糖化の段階の後の部分、
好ましくは極めて後の糖化のステージから生じる。
【００４６】 別の好ましい態様において、膜分離の段階は、精密濾過の段階及び限外濾過の
段階を含んで成り、これらは記載した順序で適用される。この態様は、低デキス
トロース含量のデキストロース溶液（シロップ）が膜分離の段階に適用される際
、反応の間に形成する副生物の量が減少するので、高純度のデキストロース製品
の獲得に、特に有用である。好ましくは、糖化のステージから生じる、膜分離に
かけられる供給流は約８０〜約９２％ＤＸのデキストロースを保持するべきであ
る。この態様は、９９％ＤＸ以上の、すなわち約９９〜９９．８％ＤＸの、デキ
ストロースを保持するデキストロース製品の製造にとって理想的である。好まし
くは、膜分離にかけられる供給流は糖化の段階の途中で生じる。更に特定の観点
において、濃縮液は供給流を生じるステージと比較して後に位置する糖化のステ
ージにおいて糖化の段階に再分配される。
【００４７】 更に他の好ましい態様において、膜分離の段階は精密濾過の段階、限外濾過の
段階及びナノ濾過の段階、好ましくは記載した順序で適用される濾過の段階を含
んで成る。この態様は約９９〜９９．９％ＤＸを保持するデキストロース製品の
製造に特に有用である。 温度安定性グルコアミラーゼ酵素 好ましくは、本発明の糖化の段階は、温度安定性グルコアミラーゼ酵素（ＥＣ
．３．２．１．３）の存在下行われる。温度安定性ＡＭＧの使用を含む糖化は、
例３において記載する様に行われうる。
【００４８】 好ましい態様において、グルコアミラーゼ酵素は、３０％マルトデキストリン
存在下で決定される、７０℃，５〜１０時間以上において、半減期（Ｔ1/2 ）を
有する。 別の好ましい態様において、本発明の糖化の方法に使用されるグルコアミラー
ゼは、野生型Ａ．ニガーＡＭＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）より高い残留活性を
有し、これは材料及び方法の項において記載された様に決定され、すなわち、５
０mM ＮａＯＡｃ，pH４．５，７０℃，０．２ AGU／mlにおける３０分間のイン
キュベーションの後の残留活性として決定される。
【００４９】 グルコアミラーゼ酵素は、好ましくはアスペルギルスの菌株、特にアスペルギ
ルス・ニガー又はアスペルギルス・ルチュエネシス、トリコデルマ・ビリデの菌
株、リゾプス種の菌株、特にリゾプス・ニベウスの菌株、エンドマイセス種の菌
株、セファロスポリウム・ケルチュラの菌株、クロストリジウムの菌株、特にク
ロストリジウム・サーモアミロリティクム、クロストリジウム・サーモスルフロ
ジェネス及びクロストリジウム・サーモヒドロスルフリクム、ペスタロチオプシ
スの菌株、又はタラロマイセスの菌株、特にタラロマイセス・デュポンチ、タラ
ロマイセス・エメルソニイ及びタラロマイセス・サーモフィラス由来でありうる
。
【００５０】 好ましい態様において、グルコアミラーゼは、以下の位置（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２に番号を付けたものを使用）：Ｓ１１９Ｐ，Ｎ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０
Ｐ，Ｇ１３７Ａの一つ又は複数を置換したアスペルギルス・ニガーの菌株由来の
菌類のグルコアミラーゼである。 更に好ましい態様において、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）は以下の
置換：Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０ＰとＧ１３７Ａ；Ｎ２０ＣとＡ２７Ｃ；Ｓ３
０Ｐ；Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０Ｐ；Ｇ１３７Ａ；Ｓ３０ＰとＧ１３７Ａを有
する。温度安定性枝切り酵素 好ましくは、本発明の糖化の段階は、温度安定性枝切り酵素の存在下で行われ
る。好ましくは、枝切り酵素はプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）又はイソ
アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）である。
【００５１】 温度安定性プルラナーゼはバチルスの菌株、特にバチルス・ナガノエニス又は
バチルス・アシドプルリティカス、クロストリジウムの菌株、特にクロストリジ
ウム・サーモスルフロジェネス及びクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカ
ム、又はピロコッカスの菌株、特にピロコッカス・ボエジエ及びピロコッカス・
フリオサス由来でありうる。
【００５２】 温度安定性イソアミラーゼはフラボバクテリウムの菌株、特にフラボバクテリ
ウム、オドラツム、好熱古細菌スルフォロブス・アシドカルダリウス（Hayashib
ara, (1996) Biochimica et Biophysica Acta 1291, p. 177-181、例えばスルフ
ォロブス・アシドカルダリウスＡＴ（C33909）及びロデセルムス・マリウスの菌
株由来でありうる。菌類のα−アミラーゼ 一つの態様において、本発明の糖化のステップは温度安定性α−アミラーゼ、
好ましくは菌類のα−アミラーゼの存在下行われる。
【００５３】 菌類のα−アミラーゼはアスペルギルスの菌株、特にアスペルギルス・ニガー
又はアスペルギルス・オリザエ、あるいはアクレモニウムの菌株由来でありうる
。 本発明は更に、下記の例に言及して例示されているが、請求項に記載した本発
明の範囲をなんら限定する事を意味するものではない。微生物のα−アミラーゼ 本発明の糖化の段階において微生物のα−アミラーゼを使用するとき、これは
温度安定性の微生物のα−アミラーゼ、例えばバチルスα−アミラーゼ、例えば
商業上入手可能なＢ．リケニフォルミス（例えばＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋのタ
ーマミルTM）又はのそ変異体の存在下で行われるのに適当である。他の適当な温
度安定性アミラーゼはバチルス・ステアロサーモフィラス由来のマルト生成アミ
ラーゼ（例えば、Ｎｏｖｏ ＮｏｒｄｉｓｋのマルトゲナーゼTM）である。ベーターアミラーゼ 一つの態様において、本発明の糖化の段階はβ−アミラーゼの存在下行われる
。β−アミラーゼはしばしば、植物、例えば大豆及び大麦由来である。トランスグルコシダーゼ 糖化の段階においてトランスグルコシダーゼが使用されるとき、アスペルギル
ス・ニガーのトランスグルコシダーゼは使用されうる（例えばAmano から入手可
能）。ＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨａｓｅ 好ましくは、糖化の段階は、トレハロースを製造するときＭＴＳａｓｅ及びＭ
ＴＨａｓｅ（例えばMasaruらによる（1996) Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3
), 546-550に開示された酵素）の存在下行われる。温度安定性ＣＧＴａｓｅ類 シクロデキストリン類を製造するとき、環化の段階は好ましくは温度安定性Ｃ
ＧＴａｓｅの存在下で行われうる。適当な温度安定性ＣＧＴａｓｅ類は、好熱性
の嫌気性類サーモアナエロバクター、バルチス類、例えばＢ．マセランス、Ｂ．
サークランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス及びＢ．サブチルス由来のＣＧＴａ
ｓｅを含む。 材料及び方法酵素 ： デキシトロザイム（登録商標）：それぞれＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから入手
可能の、アスペルギルス・ニガー及びバチルス・アシドプルリチカスから選択し
た菌株から得たグルコアミラーゼ及びプルラナーゼの平衡混合物。
【００５４】 ＡＭＧ Ｇ２：短縮されたアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼＧ１は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されており、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから入手可
能である。アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼＧ１はBoelら、(1984),
EMBO J. 3 (5), 1097-1102に開示されており、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから入
手可能である。宿主細胞 Ａ．オリザエＪａＬ１２５：Osaka の、発酵研究所；17-25 Jrso Hammachi 2-
Chome Yodogawa-Ku, Osaka, Japan から入手可能の、一段階の遺伝子置換法（G.
Mayによる“Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi ”(1992), p.
1-25. Eds. J.R. Kinghorn 及びG. Turner ; Blackie Academic及びProfession
alに記載）で欠失した“ａｌｐ”（Murakami Kらにより、(1991), Agric. Biol.
Chem. 55, p. 2807-2811 に記載）と名付けられたアルカリホスファターゼを有
する、マーカーとしてＡ．オリザエのpyrG遺伝子を使用するアスペルギルス オ
リザエ ＩＦＯ ４１７７。菌株ＪａＬ１２５は更にＷＯ９７／３５９５６（Ｎ
ｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に開示されている。装置 ： コッホ膜とのＭＦユニット（精密濾過ユニット）。
【００５５】 Ｄｅｓａｌ膜とのＮＦユニット（ナノ濾過ユニット）。 コッホ膜システム株式会社のコッホ精密濾過膜（コッホ３８３８−ＭＦＫ−６
１８−ＦＹＴ）。 ＤＥＳＡＬ膜製品のＤｅｓａｌｔナノ濾過膜（Ｄｅｓａｌ ＤＬ ３８４０
Ｃ１１０３）。プラスミド ： ｐＣＡＭＧ９１：図５参照。アスペルギルス・ニガーのＧ１グルコアミラーゼ
（ＡＭＧ Ｇ１）を含んで成るプラスミド。ｐＣＡＭＧ９１のコンストラクショ
ンはBoelらの、(1984), EMBO J. 301 p 1581-1585 に記載されている。
【００５６】 ｐＭＴ８３８：末端が切除されたアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ
Ｇ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするプラスミド。 方法デキシトロザイムTMの活性の定義 １AGU （Ｎｏｖｏのアミログルコシダーゼ単位）は特定の条件下で１分当たり
１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素量である。
【００５７】 １PUN （Ｎｏｖｏのプルラナーゼ単位）は特定の条件下で、プルランを加水分
解する酵素量であり、１分当たり１マイクロモルのグルコースに等しい還元力で
、還元する炭化水素を遊離する。 分析方法の詳細な記述は、請求によりＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから入手可能
である。AGU 活性の決定 １Ｎｏｖｏアミログルコシダーゼ単位（AGU ）は、以下の標準的な条件下で、
１分当たり１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素量として定義されて
いる。： 基質…マルトース 温度…２５℃ pH…４．３（酢酸緩衝液） 反応時間…３０分 分析方法（ＡＦ２２）の詳細な記述は請求により入手可能である。アスペルギルス・オリザエの形質転換（一般的方法） １００mlのＹＰＤ（Sherman らの、(1981), Yeast Genetics, Cold Spring Ha
rbor Laboratory の方法）をＡ．オリザエの胞子で植え付ぎ、そして約２４時間
震盪でインキュベートする。その菌糸体をミラクロスを通した濾過により採収し
、そして２００mlの０．６Ｍ ＭｇＳＯ4 で洗浄する。菌糸体を１５mlの１．２
Ｍ ＭｇＳＯ4 ，pH５．８の１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 中に懸濁する。懸濁液を氷
上で冷却し、そして１２０mgのノボザイムTM２３４を含む１mlの緩衝液を加える
。５分後、１mlの１２mg／ml ＢＳＡ（シグマのＨ２５型）を加え、そして多く
のプロトプラストが顕微鏡下で観察した試料において見られるまで、おだやかな
撹拌でインキュベーションを３７℃で１．５〜２．５時間続ける。
【００５８】 懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を滅菌試験管に移し、５mlの０．６
Ｍソルビトール、pH７．０の１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを重そうする。１００
０ｇで遠心を１５分間行い、そしてプロトプラストをＭｇＳＯ4 クッションの表
面から回収する。２倍量のＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール、pH７．５の１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＣａＣｌ2 ）をプロトプラスト懸濁液に加え、そし
て混合物を１０００ｇで１５分間遠心する。プロトプラストのペレットを３mlの
ＳＴＣに再懸濁、及び再ペレット化する。これを繰り返す。最終的にプロトプラ
ストは、０．２〜１mlのＳＴＣに再懸濁する。
【００５９】 １００μｌのプロトプラスト懸濁液を５〜２５μｇのｐ３ＳＲ２（Hynes らの
、Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983に記載のプラス
ミドを所有する。Ａ．ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子）を１０μｌのＳＴＣに混
合する。混合物を２５分間室温で放置する。０．２mlの６０％ＰＥＧ ４０００
（ＢＤＨ２９５７６）、１０mM ＣａＣｌ2 及びpH７．５の１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌを加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最終的に０．８５mlの同一
の溶液を加え、そして慎重に混合する。混合物を２５分間室温で放置し、そして
１５分間、２，５００ｇで遠心し、そしてペレットを２mlの１．２Ｍソルビトー
ルに再懸濁する。更に１回沈降を行った後、プロトプラストを１．０Ｍスクロー
ス、窒素供給源としてのpH７．０の１０mMアセトアミド及びバックグラウンドの
成育を阻害するための２０mM ＣｓＣｌを含む最小プレート（Cove, (1996), Bi
ochem. Biophys. Acta 113, 51-56)に広げる。３７℃で４〜７日間のインキュベ
ーションの後、胞子を採取し、滅菌水に懸濁し、そして単一のコロニーのために
広げる。この方法を繰り返し、二回目の再単離の後、単一のコロニーの胞子は形
質転換細胞として保存される。フェドバッチ発酵 フェドバッチ発酵を炭素供給源としてのマルトデキストリン、窒素供給源とし
ての尿素及び酵母抽出物を含んで成る培地中で行う。本Ａ．オリザエ宿主細胞の
震盪フラスコの培養物から、３．５％の炭素供給源及び０．５％の窒素供給源を
含んで成る培地に植え付ぐことによってフェドバッチ発酵を行う。pH５．０及び
３４℃での２４時間の培養の後、付加的な炭素及び窒素の供給源の連続的な補給
を開始する。炭素供給源を制限因子として保ち、そして酸素が過剰に存在するこ
とを確実にする。フェドバッチ培養を４日間続け、この後、遠心、限外濾過、清
浄濾過及び微生物濾過により酵素を回収する。更なる精製は当業界で知られた陰
イオン交換クロマトグラフィー法により行われる。精製 培養液を濾過し、そして１０kDの膜を有するフィルトロンTM限外濾過モジュー
ルを用いて濃縮する。濃縮した溶液は、pH５．０の２０mM酢酸ナトリウム（ＥＫ
Ｖ−緩衝液）を用いて濃縮液における伝導率が２mS／cm以下に、ダイアフィルト
レーションされる。
【００６０】 濃縮液を、あらかじめpH５．０のＥＫＶ−緩衝液で平衡化したファルマシアＳ
セファロースカラムに適用する。カラムをＥＫＶ−緩衝液で洗浄し、そしてアミ
ラーゼを溶出液中から集める。 溶出液は０．５％濃度まで活性炭を加えられ、そして１０分間室温でインキュ
ベーションされる。そして炭は濾過によって除去される。
【００６１】 最終的に、あらかじめpH４．３のＥＫＶ−緩衝液で平衡化したファルマシアＱ
セファロースＦＦカラムに酵素溶液をかける。カラムをＥＫＶ−緩衝液で洗浄し
、結合タンパク質をカラムの１０倍量以上の、０〜５００mM ＮａＣｌの直線Ｎ
ａＣｌ勾配で溶出する。画分を含むグルコアミラーゼは貯められる。 精製した製品の同質性はＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析される。ゲルはクーマシーブ
ルーで染色される。グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）の温度安定性の決定 グルコアミラーゼの温度安定性を以下の方法で試験する：９５０マイクロリッ
トルの５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．３）（ＮａＯＡｃ）を７０℃で５分
間インキュベートする。５０マイクロリットルの緩衝液中の酵素を加える。４０
マイクロリットルの試料を２回、０及び３０分で採取し、そして氷上で冷却する
。インキュベーション（０分）の前に測定した活性(AGU／ml）を基準（１００％
）として使用する。パーセントの低下はインキュベーション時間の機能として計
算される。グルコアミラーゼのＴ1/2 （半減期） 本温度（例えば７０℃）で、pH４．５で、３０％の１０ＤＥマルトデキストリ
ンにおける本グルコアミラーゼ（０．１８〜０．３６AG／ｇ ＤＳ）をインキュ
ベートすることによってＴ1/2 を測定する。試料を設定した時間の間隔で採取し
、そして、マルトデキストリンが活性検定に影響を及ぼしうるので、全ての基質
が加水分解されるのを確実にするために更に５０℃で２４時間インキュベートす
る。５０℃での２４時間のインキュベーションは、本酵素活性を有意に減少しな
い。インキュベーションの後、試料を冷却し、そして残留酵素活性をｐＮＰＧ法
（以下に記載）で測定する。
【００６２】 本％残留グルコアミラーゼ活性を異なる時間で決定する。Ｔ1/2 は、％相対活
性が５０％に減少するまでの時間の期間である。残留酵素活性（ｐＮＰＧ法） ｐＮＰＧ試薬： ０．２ｇのｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニルグルコピラノシド）を０．１Ｍの酢
酸緩衝液（pH４．３）中に溶解し、そして１００mlにする。 ホウ酸塩溶液： ３．８ｇのＮａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 ＯをミリＱ水に溶解し、そして１００ml
にする。ＡＭＧ標準 ： ０．０４ AGU／mlに等しいとして知られた酵素量を含む酵素水溶液。
【００６３】 試料は分析前に希釈されうる（水を用いて１：１〜１：２）。以下の溶液を調
製する： ＨＳ：０．５mlの試料と１mlのＡＭＧ標準と３mlのｐＮＰＧ試薬 Ｈ：０．５mlの試料と１mlの水と３mlのｐＮＰＧ試薬 Ｂ：０．５mlの試料と１mlのＡＭＧ標準と３mlのホウ酸塩溶液 ＨＳ及びＨを５０℃の水浴に据える。２時間後、３mlのホウ酸溶液を各バイア
ルに加える。Ｂを室温で置き、２時間後３mlのｐＮＰＧ試薬を加える。全ての３
つの溶液の光学濃度を４００nmで測定し、活性を計算する： 活性＝２* AGU 標準* （Ｈ−Ｂ）／（ＨＳ−Ｈ） ここでＨＳ，Ｈ及びＢは分析した溶液のＯＤであり、そしてAGU 標準は用いたＡ
ＭＧ標準の活性である。 例 例１デキストロース溶液製造のための糖化 本発明のデキストロース糖化方法は、２つの１６ステージのタンク（合計３２
ステージ）（図４参照）を用いて行われた。ＭＦユニット及びＮＦユニットを二
つの糖化タンクの１６番目と１７番目のステージの間に設置した。
【００６４】 １）９２〜９４％デキストロースシロップ、 ２）デキストロザイムTM（グラム乾燥固体（ＤＳ）当たり０．１８AGU ）、及
び ３）かす を含む第一の糖化タンクの第１６ステージ由来の糖化膜溶液はＭＦユニットへの
供給として使用された。
【００６５】 ＭＦユニットの濃縮液はかすである。ＭＦユニットの浸透液は糖化溶液及びデ
キストロザイム（登録商標）である。 ＭＦユニットの浸透液は、ＮＦユニットへの供給として使用された。ＮＦユニ
ットの浸透液は、デキストロース及び水のみがナノ膜を濾過するのに十分小さい
とき、約９９％のデキストロースを含む。ＮＦユニットの濃縮液は第二の糖化タ
ンクの１７番目のステージに送られ、ここで糖化は、それ以上のデキストロザイ
ム（登録商標）の添加無しで、デキストロースの収率９６％まで続けられた。約
２８ＧＰＭ酵素を、ＮＦユニットに供給する浸透液に再循環した。本実験の間に
記録されたデータ：
【００６６】
【表２】
【００６７】 注：濃縮液ライン１から浸透液の流れを供なうライン１への流出 供給流の温度：ＮＦユニットへの供給流における温度； 供給流の％乾燥固体：ＮＦユニットへ導入される供給流における；乾燥固体； 浸透液の％乾燥固体：ＮＦユニットからの浸透液における％乾燥固体： ％Ｍｏｎｏ；ＤＳの％単糖類 ＧＰＭ：ガロン／分 ＰＳＩ：圧力 ％ＤＳ：％乾燥固体 本発明の糖化工程に関して、膜フィルターユニットが糖化の工程の一体部分と
して使用される。
【００６８】 上述の表１から読みとれるように、デキストロースの収率は９９％以上である
。 例２温度安定性ＡＭＧ Ｇ２ Ｓ１１９Ｐ変異体のコンストラクション 部位−特異的組換え ＡＭＧ Ｇ２酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の変異体のコンストラクション
のために、商業用キット、カメレオン二重らせん、部位特異的組換えキットを製
品の説明書に従って使用した。
【００６９】 本ＡＭＧ Ｇ２酵素をコードしている遺伝子は、ＡＭＧのＧ１型を含んで成る
プラスミドｐＣＡＭＧ９１（図１参照）におけるＧ２のヌクレオチドＢ６２とＧ
２のヌクレオチド１５３０の間のＤＮＡを欠失させることによって製造したｐＭ
Ｔ８３８に位置している。 製品の説明書に従って、ｐＭＴ８３８のアンピシリン遺伝子のＳｃａＩ部位を
、以下のプライマー：7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） を使用することによって、ＭｌｕＩ部位に変えた。（このような、ＳｃａＩ部位
の変化はアンピシリン耐性遺伝子において見られ、ＭｌｕＩ部位を切断するため
に使用される）。次に、本ＡＭＧ遺伝子を含んで成るｐＭＴ８３８ベクターは、
ＤＮＡポリメラーゼ並びにオリゴ７２５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び２１
４０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の鋳型ＤＮＡとして使用された。
【００７０】 プライマーｎｏ．２１４０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を選択プライマーと
して使用した。 21401 ：5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc
acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3' （ＳｃａＩ部位の変化は、アミノ酸配列の変化無しにＡＭＧ遺伝子において見ら
れる）。
【００７１】 所望の変異（例えばシステイン残基への導入）は所望の変異を含んで成る適当
なオリゴの添加によって、本ＡＭＧ遺伝子に導入される。 プライマーＳＰ１１９Ｐは、Ｓ１１９Ｐに導入するために使用された。 P-CCTACACTG GTCCTTGGGG ACGGC（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５） 本変異を、全ての遺伝子をシークエンスすることにより確認する。本プラスミ
ドは、“材料及び方法”の項において上述した方法を用いてＡ．オリザエに形質
転換を起こした。本変異体を発酵し、そして“材料及び方法”の項で上述した様
に精製した。
【００７２】 pH４．５の５０mM ＮａＯＡｃ，７０℃，０．２ AGU／mlにおいて３０分間イ
ンキュベートした後の残留活性を、以下の表に記載した様に決定し、そして野生
型のＡ．ニガーのＡＭＧと比較した。
【００７３】
【表３】
【００７４】 例３デキストロース溶液を製造するための温度安定性ＡＭＧを用いる糖化 例１において記述した糖化を繰り返し、これはデキストロザイムTMのＡＭＧを
、例２のＡ．ニガーＳ１１９Ｐ変異体に置き換えたものを除く。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明の糖化の段階１〜ｎを含んで成る糖化の段階（ＳＡＣＣ）、及び
本発明の膜分離の段階を示している。
【図２】 図２は糖化の段階（ＳＡＣＣ；糖化の段階１〜ｎを含む）、精密濾過の段階（
ＭＦ）、限外濾過の段階（ＵＦ）、及びナノ濾過の段階を含んで成る本発明の好
ましい態様を示している。
【図３】 図３は糖化の段階（ＳＡＣＣ；糖化の段階１〜ｎを含む）、精密濾過の段階（
ＭＦ）、限外濾過の段階（ＵＦ）、及びナノ濾過の段階を含んで成る本発明の別
の好ましい態様を示している。
【図４】 図４は二つのタンクの間において設置されたＭＦ装置及びＮＦ装置と、各々１
６のステージと２つの糖化のタンク（ＳＡＣタンク）を用いる本発明のデキスト
ロース糖化工程のブロック線図を示している。
【図５】 図５はアスペルギルス・ニガーＧ１グルコアミラーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐＣＡＭＧ９１を示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月７日（２０００．１．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 19/14 (Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リアウ，ギアン シー． アメリカ合衆国，イリノイ 62525，ディ ケイター，イースト エルドラード スト リート 2200，エー．イー．ステイレー マニュファクチャリング カンパニー (72)発明者 ペデルセン スベン デンマーク国，デーコー−2820 ゲントフ テ，エミル レーセンス バイ ９ (72)発明者 ヘンドリクゼン，ハンネ バン デンマーク国，デーコー−2840 ホルテ， バイレモゼバイ ５アー (72)発明者 スベンゼン，アラン デンマーク国，デーコー−3460 ビルケレ ード，バッケレデト 28 (72)発明者 ニールセン，ビャルネ レーンフェルト デンマーク国，デーコー−2830 ビルム， リグステルベーンゲト 37 (72)発明者 ニールセン，ルビー イルム デンマーク国，デーコー−3520 ファル ム，ゲデバッケン ９ Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD02 DD03 LL05 4B064 AF03 AF04 AF15 CA21 CB07 CC06 CC08 CC24 CE06 DA10

Claims (91)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）１つ又は複数の酵素的な糖化のステージを含む糖化の
    段階、並びにそれに続く段階、 （ii）１つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （iii ）糖化酵素の再循環； を含んで成る液化澱粉溶液の糖化方法において、前記膜分離の段階が、糖化の
    段階の一体部分として行われる方法。
  2. 【請求項２】 前記高温の膜分離の段階が、６３℃以上の温度（好ましくは
    約６３〜約８０℃の範囲内の温度）で達成される膜分離の段階である、請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 糖化の段階が１〜６４個の糖化のステージを含んで成る、請
    求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記糖化のステージから生じる、膜分離にかけられる供給流
    が約５０〜約９６％のＤＸ、好ましくは約６０〜約９６％のＤＸ、更に好ましく
    は約８０〜約９６％のＤＸを保持する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階、及び／又は限外濾過
    の段階、及び／又はナノ濾過の段階を含んで成る、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記膜分離の段階が、限外濾過の段階である、請求項５に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 前記膜分離の段階が、ナノ濾過の段階である、請求項５に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階及び限外濾過の段階を
    含んで成り、好ましくはこれらが前記の順序で適用される、請求項５に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 約９５〜約９６％のＤＸを保持しているデキストロース製品
    の製造のための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記糖化のステージから生じる、膜分離にかけられる供給
    流が約９０〜約９６％のＤＸを保持する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階及びナノ濾過の段階
    を含んで成り、好ましくはこれらが前記の順序で適用される、請求項５に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 前記糖化のステージから生じる、膜分離にかけられる供給
    流が、約８０〜約９２％のＤＸを保持する、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 約９９〜約９９．９％のＤＸを保持しているデキストロー
    ス製品の製造のための、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階、限外濾過の段階及
    びナノ濾過の段階を含んで成り、前記に記載された順序で適用される、請求項５
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 約９９〜９９．９％のＤＸを保持しているデキストロース
    製品の製造のための、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記糖化の段階が温度安定性グルコアミラーゼ酵素（ＥＣ
    ３．２．１．３）の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記グルコアミラーゼ酵素が、３０％マルトデキストリン
    の存在下で決定された、５〜１０時間以上７０℃において半減期（Ｔ1/2 ）を有
    する、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記グルコアミラーゼ酵素が、pH４．５の５０mM ＮａＯ
    Ａｃ，７０℃，０．２ AGU／mlにおける３０分間のインキュベーションの後、Ｓ
    ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示した野生型Ａ．ニガー（A. niger）のグルコアミラー
    ゼよりも高い残留活性を有する、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記グルコアミラーゼ酵素が、アスペルギルス（Aspergil
    lus ）の菌株、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）の菌
    株由来である、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 菌類のグルコアミラーゼが以下の位置（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    Ｏ：２に番号を付けたものを使用）：Ｓ１１９Ｐ，Ｎ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０
    ＰとＧ１３７Ａの１つ又は複数の位置において置換を有するアスペルギルス・ニ
    ガーの菌株由来である、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 Ａ．ニガーのＡＭＧが１つ又は以下の置換（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：２に番号を付けた）：Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０ＰとＧ１３７Ａ；Ｎ
    ２０ＣとＡ２７Ｃ；Ｓ３０Ｐ；Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０Ｐ；Ｇ１３７Ａ；Ｓ
    ３０ＰとＧ１３７Ａを有する、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記グルコアミラーゼ酵素が、タラロマイセス（Talaromy
    ces ）の菌株、特にタラロマイセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii ）
    の菌株由来である、請求項１６に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 枝切り酵素の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記枝切り酵素がプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）
    又はイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）である、請求項２３に記載の方法
    。
  25. 【請求項２５】 前記枝切り酵素が温度安定性プルラナーゼ又は温度安定性
    イソアミラーゼである、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記プルラナーゼがピロコッカス（Pyrococcus）の菌株、
    特にピロコッカス・ボエジエ（Pyrococcus woesie ）の菌株、又はピロコッカス
    ・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）の菌株由来である、請求項２５に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 前記イソアミラーゼがフラボバクテリウム（Flavobacteri
    um）の菌株、特にフラボバクテリウム・オドラツム（Flavobacterium odoratum
    ）の菌株由来である、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記糖化の段階が、菌類のα−アミラーゼの量を増して行
    われる、請求項１に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記の菌類のα−アミラーゼが、アスペルギルスの菌株、
    特にアスペルギルス・ニガーである、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記の菌類のα−アミラーゼがアクレモニウム（Acremoni
    um）の菌株由来である、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記膜分離の段階が、精密濾過及び限外濾過を含んで成り
    、好ましくはそれらが前記の順序で適用される、請求項１に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記糖化の段階が、温度安定性のＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨ
    ａｓｅの存在下で行われる、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記ＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨａｓｅがスルフォロブス（Su
    lfolobus）の菌株、例えばＳ．アシドカルダリウス（S. acidocaldarius ）、特
    にＳ．アシドカルダリウスＡＴＣＣ３３９０９由来である、請求項３２に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 前記液化澱粉が温度安定性ＣＧＴａｓｅにかけられる、請
    求項３１に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ＣＧＴａｓｅがサーモアナエロバクター（Thermoanae
    robacter）又はバチルス（Bacillus）の属の菌株由来である、請求項３４に記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 前記液化澱粉が、温度安定性α−アミラーゼ及び／又はプ
    ルラナーゼ及び／又は菌類のα−アミラーゼにかけられる、請求項３１に記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】 前記α−アミラーゼがバチルス・リチェニフォルミス（Ba
    cillus licheniformis）又はバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus the
    rmophilus ）の菌株由来である、請求項３１に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記プルラナーゼがバチルス属の菌株、例えばバチルス・
    アシドプルリティカス（Bacillus acidopullulyticus）又はバチルス・デラミフ
    ィカンス（Bacillus deramificans ）由来である請求項３１に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記の菌類のα−アミラーゼがアスペルギルス・ニガーの
    菌株由来である、請求項３１に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記液化澱粉をβ−アミラーゼ及びトランスグルコシダー
    ゼにかける、請求項３１に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記トランスグルコシダーゼがアスペルギルス・ニガー由
    来である、請求項４０に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 約３０〜約８０％以上のマルトースを保持するマルトオリ
    ゴ糖シロップの製造のための、請求項３１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 約１０〜４０％のイソマルトースを保持するイソマルトオ
    リゴ糖又は“アロ混合物”のシロップの製造のための、請求項３１に記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】 約７５〜約９０％のトレハロースを保持するトレハロース
    製品の製造のための、請求項３１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 約３０〜６０％のシクロデキストリン類を保持するシクロ
    デキストリン類製品の製造のための、請求項３１に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 酵素的な糖化の段階、並びにそれに続く： （ｉ）１つ又は複数の高温の膜分離の段階；及び （ii）糖化酵素の再循環； の段階を含んで成る、糖製品の製造方法。
  47. 【請求項４７】 前記高温の膜分離の段階が６３℃以上の温度（好ましくは
    約６３〜約８０℃の範囲内の温度）で達成される膜分離の段階である、請求項４
    ６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記膜分離の段階（ｉ）が糖化の段階の一体部分であり、
    膜分離にかけられる供給流が糖化の段階由来であり、そして膜分離からの濃縮液
    が糖化の段階に再循環される、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記膜分離の段階が、１つ又は複数の糖化のステージ、好
    ましくは１〜６４の糖化のステージ、更に好ましくは１〜３２の糖化のステージ
    を含んで成る、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記糖化のステージに由来する、膜分離にかけられる供給
    流が約５０〜約９６％ＤＸ、好ましくは約６０〜約９６％ＤＸ、更に好ましくは
    約８０〜約９６％ＤＸを保持する請求項４６に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階、及び／又は限外濾
    過の段階、及び／又はナノ濾過の段階を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記膜分離の段階が限外濾過の段階である、請求項５１に
    記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記膜分離の段階がナノ濾過の段階である、請求項５１に
    記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記膜分離の段階が、精密濾過及び限外濾過を含んで成る
    、好ましくは前記の順序で適用される、請求項５１に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 約９５〜約９６％のＤＸを保持するデキストロース製品の
    製造のための、請求項４６に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 糖化のステージに由来する、膜分離にかけられる供給流が
    、約９０〜約９６％のＤＸを保持する、請求項４６に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記膜分離の段階が精密濾過の段階及びナノ濾過の段階を
    含んで成る、好ましくは前記の順序で適用される、請求項４６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 糖化のステージに由来する、膜分離にかけられる供給流が
    、約８０〜約９２％のＤＸを保持する、請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 約９９〜９９．９％のＤＸを保持するデキストロース製品
    の製造のための、請求項４６に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記膜分離の段階が、精密濾過の段階、限外濾過の段階及
    びナノ濾過の段階を含んで成る、前記の順序で適用される、請求項４６に記載の
    方法。
  61. 【請求項６１】 約９９〜９９．９％のＤＸを保持するデキストロース製品
    の製造のための、請求項６０に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記糖化の段階が温度安定性グルコアミラーゼ酵素（ＥＣ
    ３．２．１．３）の存在下行われる、請求項４６に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記グルコアミラーゼ酵素が、３０％マルトデキストリン
    の存在下決定される、５〜１０時間以上７０℃において半減期（Ｔ1/2 ）を有す
    る、請求項６２に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 pH４．５の５０mM ＮａＯＡｃ，７０℃，０．２ AGU／ml
    における３０分間のインキュベーションの後、前記グルコアミラーゼ酵素がＳＥ
    Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に示した野生型Ａ．ニガーのグルコアミラーゼよりも高い残
    留活性を有する、請求項６３に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記グルコアミラーゼ酵素がアスペルギルスの菌株、好ま
    しくはアスペルギルス・ニガーの菌株由来である、請求項６２に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記の菌類のグルコアミラーゼが、１つ又は複数の以下の
    位置（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に番号を付けたものを使用）：Ｓ１１９Ｐ，Ｎ２
    ０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ｇ１３７Ａにおいて置換したアスペルギルス・ニガ
    ーの菌株由来である、請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記のＡ．ニガーのＡＭＧが以下の置換（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：２に番号を付けた）：Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０ＰとＧ１３７Ａ；Ｎ２
    ０ＣとＡ２７Ｃ；Ｓ３０Ｐ；Ｎ２０ＣとＡ２７ＣとＳ３０Ｐ；Ｇ１３７Ａ；Ｓ３
    ０Ｐ；Ｇ１３７Ａを有する、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記グルコアミラーゼ酵素がタラロマイセスの菌株、好ま
    しくはタラロマイセス・エメルソニイの菌株由来である、請求項６２に記載の方
    法。
  69. 【請求項６９】 枝切り酵素の存在下行われる、請求項６０に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記枝切り酵素がプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）
    又はイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）である、請求項６９に記載の方法
    。
  71. 【請求項７１】 前記枝切り酵素が温度安定性プルラナーゼ又は温度安定性
    イソアミラーゼである、請求項６９に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記プルラナーゼがピロコッカスの菌株、特にピロコッカ
    ス・ボエジエの菌株、又はピロコッカス・フリオサスの菌株由来である、請求項
    ７０に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記イソアミラーゼがフラボバクテリウムの菌株、特にフ
    ラボバクテリウム・オドラツム由来である、請求項７０に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 菌類のα−アミラーゼの量を増して行われる、請求項４６
    に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記の菌類のα−アミラーゼが、アスペルギルスの菌株、
    特にアスペルギルス・ニガーである、請求項７４に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 前記の菌類のα−アミラーゼがアクレモニウムの菌株由来
    である、請求項７４に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記膜分離の段階が、精密濾過及び限外濾過を含んで成る
    、好ましくはそれらが前記の順序で適用される、請求項４６に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 前記糖化の段階が、温度安定性のＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨ
    ａｓｅの存在下で行われる、請求項７７に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 前記ＭＴＳａｓｅ及びＭＴＨａｓｅがスルフォロブスの菌
    株、例えばＳ．アシドカルダリウス、特にＳ．アシドカルダリウスＡＴＣＣ３３
    ９０９由来である、請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記液化澱粉が温度安定性ＣＧＴａｓｅにかけられる、請
    求項７７に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 前記ＣＧＴａｓｅがサーモアナエロバクター又はバチルス
    の属の菌株由来である、請求項８０に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記液化澱粉が、温度安定性の微生物のα−アミラーゼ及
    び／又はプルラナーゼ及び／又は菌類のα−アミラーゼにかけられる、請求項７
    ７に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記α−アミラーゼがバチルス・リチェニフォルミス又は
    バチルス・ステアロサーモフィラスの菌株由来である、請求項８２に記載の方法
    。
  84. 【請求項８４】 前記プルラナーゼがバチルス属の菌株、例えばバチルス・
    アシドプルリティカス又はバチルス・デラミフィカンス由来である請求項８２に
    記載の方法。
  85. 【請求項８５】 前記菌類のα−アミラーゼがアスペルギルス・ニガーの菌
    株由来である、請求項８２に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 前記液化澱粉をβ−アミラーゼ及びトランスグルシダーゼ
    にかける、請求項８２に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 前記トランスグルコシダーゼがアスペルギルス・ニガー由
    来である、請求項８６に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 約３０〜約８０％以上のマルトースを保持するマルトオリ
    ゴ糖シロップの製造のための、請求項８７に記載の方法。
  89. 【請求項８９】 約１０〜４０％のイソマルトースを保持するイソマルトオ
    リゴ糖又は“アロ混合物”のシロップの製造のための、請求項７７に記載の方法
    。
  90. 【請求項９０】 約７５〜約９０％のトレハロースを保持するトレハロース
    製品の製造のための、請求項７７に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 約３０〜６０％のシクロデキストリン類を保持するシクロ
    デキストリン類製品の製造のための、請求項７７に記載の方法。
JP2000522265A 1997-11-26 1998-11-23 膜分離の段階を含む澱粉の酵素的糖化 Pending JP2001524316A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97967397A 1997-11-26 1997-11-26
US08/979,673 1997-11-26
US10765798A 1998-06-30 1998-06-30
US09/107,657 1998-06-30
PCT/US1998/024871 WO1999027124A1 (en) 1997-11-26 1998-11-23 Enzymatic starch saccharification including a membrane separation step

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001524316A true JP2001524316A (ja) 2001-12-04

Family

ID=26805008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000522265A Pending JP2001524316A (ja) 1997-11-26 1998-11-23 膜分離の段階を含む澱粉の酵素的糖化

Country Status (9)

Country Link
US (5) US6129788A (ja)
EP (1) EP1034293A1 (ja)
JP (1) JP2001524316A (ja)
KR (1) KR20010032497A (ja)
AR (1) AR016701A1 (ja)
AU (1) AU1595999A (ja)
CA (1) CA2311505A1 (ja)
IN (1) IN188155B (ja)
WO (1) WO1999027124A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014103348A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 日本コーンスターチ株式会社 コーヒー飲料

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027124A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Novo Nordisk A/S Enzymatic starch saccharification including a membrane separation step
FR2791701B1 (fr) * 1999-04-02 2003-05-23 Roquette Freres Procede de fabrication d'un hydrolysat d'amidon a haute teneur en dextrose
FR2791700B1 (fr) * 1999-04-02 2003-07-04 Roquette Freres Procede de fabrication d'un hydrolysat d'amidon a haute teneur en dextrose
FI111959B (fi) * 2000-12-28 2003-10-15 Danisco Sweeteners Oy Menetelmä maltoosin puhdistamiseksi
DE50209165D1 (de) 2001-02-21 2007-02-15 Basf Ag Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder salze als zusatz zu tierfuttermitteln
EP1382687B1 (en) * 2001-04-27 2010-05-26 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for producing isomaltose and use thereof
US7709230B2 (en) 2001-04-27 2010-05-04 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for producing isomaltose and uses thereof
TWI324635B (en) * 2001-10-18 2010-05-11 Hayashibara Biochem Lab Process for producing isomaltitol and uses thereof
US20030134396A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-17 Shetty Jayarama K. Process for hydrolyzing starch without pH adjustment
FI20020675A0 (fi) * 2002-04-09 2002-04-09 Danisco Sweeteners Oy Puhtaan disakkaridiliuoksen puhdistaminen
DK1366674T3 (da) * 2002-05-28 2008-01-07 Cooperatie Avebe U A Levnedsmiddeladditiv
CN1273610C (zh) * 2004-01-15 2006-09-06 华南理工大学 一种祛除低聚糖中单糖成分的方法
US20060160189A1 (en) * 2005-01-19 2006-07-20 California Natural Products High-temperature enzyme starch-to-sugar conversion
US20060210696A1 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Chi-Li Liu Slowly digestible carbohydrate
US10526627B2 (en) * 2007-11-30 2020-01-07 Corn Products Development, Inc Method for producing high molecular weight reduced viscosity starch pastes
EP2467476A1 (en) 2009-08-21 2012-06-27 Novozymes A/S Polypeptides having isoamylase activity and polynucleotides encoding same
US20110091938A1 (en) * 2009-10-20 2011-04-21 Grain Processing Corporation Starch Hydrolysis
EP2499227B1 (en) 2009-11-13 2015-04-08 Novozymes A/S A brewing method
US11999928B2 (en) 2009-11-13 2024-06-04 Novozymes A/S Brewing method
CN101899488A (zh) * 2010-07-09 2010-12-01 中国科学院过程工程研究所 一种木质纤维素酶水解与膜分离耦合生产高浓度还原糖的方法
MX2011008654A (es) * 2010-08-24 2012-02-23 Corn Products Int Inc Produccion de isomaltooligosacaridos y usos para los mismos.
WO2013148152A1 (en) * 2012-03-28 2013-10-03 Danisco Us Inc. Method for making high maltose syrup
EP2898084B1 (en) * 2012-09-24 2021-01-06 Cargill, Incorporated Process for increasing yield of dextrose production process, by membrane technology
CN106520729B (zh) * 2016-10-25 2019-11-26 齐鲁工业大学 麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用
EP3415622A1 (en) 2017-06-14 2018-12-19 Evonik Degussa GmbH Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases
KR101958017B1 (ko) * 2017-07-13 2019-03-15 (주)카보엑스퍼트 고농도 세포 배양 방법을 이용한 다당체의 생산 방법
CN110241152A (zh) * 2018-03-09 2019-09-17 通辽梅花生物科技有限公司 复合海藻糖产品的制备方法
CN108866126A (zh) * 2018-07-06 2018-11-23 安徽民祯生物工程有限公司 一种经济型海藻糖生产方法
CN112575022A (zh) * 2020-12-24 2021-03-30 齐鲁工业大学 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法
CN113061632B (zh) * 2021-03-05 2023-04-28 江南大学 一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法
CN114875097B (zh) * 2022-04-21 2023-08-25 江南大学 一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3720583A (en) * 1968-12-20 1973-03-13 Staley Mfg Co A E Enzyme hydrolysis
US4594322A (en) * 1983-04-19 1986-06-10 Uop Inc. Glucose or maltose from starch
CA2038485A1 (en) * 1990-03-23 1991-09-24 Donald K. Hadden Nanofiltration process for making dextrose
FR2668163B1 (fr) * 1990-10-18 1993-01-15 Orsan Procede de fabrication de beta-cyclodextrine.
CN1238009A (zh) * 1996-07-24 1999-12-08 衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司 提高葡糖淀粉酶pH最适点、底物专一性和热稳定性的蛋白质工程方法
WO1999027124A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Novo Nordisk A/S Enzymatic starch saccharification including a membrane separation step

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014103348A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 日本コーンスターチ株式会社 コーヒー飲料

Also Published As

Publication number Publication date
AR016701A1 (es) 2001-07-25
US20050260719A1 (en) 2005-11-24
US20020164723A1 (en) 2002-11-07
KR20010032497A (ko) 2001-04-25
US6303346B1 (en) 2001-10-16
WO1999027124A9 (en) 1999-09-10
EP1034293A1 (en) 2000-09-13
US6136571A (en) 2000-10-24
CA2311505A1 (en) 1999-06-03
IN188155B (ja) 2002-08-24
WO1999027124A1 (en) 1999-06-03
US6129788A (en) 2000-10-10
AU1595999A (en) 1999-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2001524316A (ja) 膜分離の段階を含む澱粉の酵素的糖化
JP3249514B2 (ja) 遺伝子工学処理をした酵素による澱粉のグルコースへの加水分解
EP0140410B2 (en) Novel enzyme product and its use in the saccharification of starch
JP3557289B2 (ja) 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素
JPH05508997A (ja) 新規熱安定性プルラナーゼ
JP2001525177A (ja) オリゴ糖シロップの製造方法、その製造系及びオリゴ糖
JP3557288B2 (ja) 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素
JP2002517157A (ja) スルホロブス由来の熱安定性イソアミラーゼを使用する澱粉転化法
US4970158A (en) Beta amylase enzyme product, preparation and use thereof
US5871993A (en) DNA encoding enzyme, recombinant DNA and enzyme, transformant, and their preparations and uses
JPH0364106B2 (ja)
JP3559609B2 (ja) 組換え型酵素とその製造方法並びに用途
US5130243A (en) Process for production of starch sugar
KR100898384B1 (ko) 내열성 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소 및 이를이용한 분지 사이클로덱스트린의 제조방법
KR100387286B1 (ko) 이소말토올리고당의 제조 방법
JP2733330B2 (ja) 高純度澱粉糖の製造方法
JPH03187390A (ja) 分岐オリゴ糖の製造方法
JPH062071B2 (ja) 糖類の製造法
JPH0365759B2 (ja)