CN114875097B - 一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法，属于功能食品领域。本发明能够以廉价的淀粉或糊精为底物，利用α‑葡萄糖苷酶与CGTase进行酶促反应，随后经糖化酶水解产物中易消化的α‑1,4糖苷键，生产方法成本低，条件温和，所得IMO产物转化率可达81.2％，且具有很高的溶解性，分离纯化后获得高聚合度IMO产物。利用本发明的方法制备得到的高聚合度低聚异麦芽糖，平均分子量约700～1500Da，聚合度约4～10，α‑1,4糖苷键含量为20～40％，α‑1,6糖苷键含量为60～80％，可作食物或饲料应用中的糖替代品添加剂。本发明的方法为规模化生产得率高且益生性能强的IMO提供重要的理论基础和关键技术，所得产物在食品工业中具有广泛作用。

Description

一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法

技术领域

本发明涉及一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法，属于功能食品领域。

背景技术

低聚异麦芽糖(IMO)是葡萄糖单元以α-1,6键连接形成聚合度在2-10之间的寡糖混合物，主要成分为异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖。IMO不易被人体消化酶利用，具有低血糖指数特征，可用于糖尿病患者的健康糖替代品。此外，IMO还可被肠道益生菌特别是双歧杆菌分解利用，产生短链脂肪酸，抑制肠道有害菌，因此作为一种重要的功能性低聚糖，IMO广泛应用于食品等行业。

目前，IMO的商业化生产均采用直接合成法，以麦芽糖或淀粉为底物，经α-淀粉酶和β-淀粉酶共同作用，首先生成富含麦芽糖的寡糖混合物，然后经α-葡萄糖苷酶切割麦芽糖形成葡萄糖-α-葡萄糖苷酶共价复合物和等量的葡萄糖，随后通过转苷作用利用葡萄糖为受体合成异麦芽糖，当受体底物为异麦芽糖时则合成异麦芽三糖。在该方法中，因α-葡萄糖苷酶具有水解副反应，导致较多的副产物葡萄糖生成，IMO得率普遍低于55％。此外，由于α-葡萄糖苷酶的转糖基反应是单个葡萄糖转移反应，合成聚合度为n的异麦芽寡糖需要以聚合度n-1的异麦芽寡糖为受体，导致聚合度越高的组分含量越低，因此该反应原理决定了转化产物只能以聚合度为2的异麦芽糖为主，三糖及以上成分占总糖含量一般低于20％。

然而，研究表明，对于IMO，双歧杆菌的增殖主要归功于其中的三糖及以上组分(Toshiyuki,Kaneko,Takanobu,et al.Effects of Isomaltooligosaccharides withdifferent degrees of polymerization on human fecal Bifidobactcria[J].Bioscience Biotechnology&Biochemistry,2014.以及Wu Q,Pi X,Liu W,etal.Fermentation properties of Isomaltooligosaccharides are affected by humanfecal enterotypes[J].Anaerobe,2017:206.)。针对上述问题，研究者尝试通过表面展示、与歧化酶复配及分子改造等方式提高产物IMO总得率和三糖以上组分比率，但只能提高转化率，并不能调控聚合度。中国专利CN10529657A中以麦芽糖为底物，利用固定化α-葡萄糖苷酶提高产物IMO三糖含量，最终产物中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖含量达干物质的75％，一定程度提高其益生性能。相比底物麦芽糖，利用廉价易得的淀粉底物生产转化率高且聚合度高的IMO，不仅对IMO产业的可持续发展具有重要作用，而且对落实“健康中国”战略规划具有积极意义。

发明内容

针对现有技术存在的缺点，本发明提供了一种IMO制备新方法，以淀粉/糊精为底物，利用α-葡萄糖苷酶断开淀粉/糊精底物的α-1,4糖苷键，通过转糖基反应在受体非还原端形成α-1,6糖苷键，再利用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的歧化作用，重新利用体系中游离的葡萄糖和麦芽糖等小分子糖，以延伸产物链长并提高产物转化率。本发明的IMO，按质量百分比包括：α-1,4糖苷键含量为20～40％，α-1,6糖苷键含量为60～80％，分子量大小约700～1500Da，聚合度约4～10，该产物具有很高的溶解性，是一种新型益生元，可作为糖替代品广泛应用于食品、医药以及化妆品领域。

本发明提供了一种制备高聚合度低聚异麦芽糖的方法，所述方法是利用α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶以淀粉或淀粉衍生物为底物，制备高聚合度低聚异麦芽糖。

在一种实施方式中，所述α-葡萄糖苷酶来源于Aspergillus nidulans或来源于Aspergillus niger，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Bacillus stearothermophilusNO2、Niallia circulans、Paenibacillus macerans JFB 05-01。

在一种实施方式中，所述来源于Aspergillus nidulans的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述来源于Aspergillus niger的α-葡萄糖苷酶公开于专利CN103146726A中。

在一种实施方式中，所述来源于Bacillus stearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶为α/β型CGTase，为专利CN108018268A中的野生型环糊精葡萄糖基转移酶。

在一种实施方式中，所述来源于Niallia circulans的环糊精葡萄糖基转移酶为β型CGTase的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述来源于Paenibacillus macerans JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶为α型CGTase，为专利CN103484439A中的野生型环糊精葡萄糖基转移酶。

在一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：

(1)以淀粉或淀粉衍生物为底物，配制成浓度为10％～30％的悬浊液，将悬浊液经糊化后，再加入α-淀粉酶液化得到液化液；

(2)将液化液冷却至30℃～45℃，调节pH值5.0～6.0，并添加所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶，在40～50℃反应10～15h；

(3)将步骤(2)中得到的反应物冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66U/g底物，置于55℃～65℃水浴摇床中持续振荡，反应25～35min；

(4)反应结束后95℃，20min灭酶，加入终浓度为10～12g/L的酵母粉进行消化，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

(5)将反应产物离心后取上清，经喷雾干燥最终得到IMO产物。

在一种实施方式中，在淀粉酶液化过程中控制液化液DE值为5-7或15-20。

在一种实施方式中，糖化酶的酶活定义为：1酶活力单位定义为：40℃、pH 4.5时、每分钟释放1μmol葡萄糖所需要的酶量。

在一种实施方式中，所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶包括酶液、干粉、共表达或分别单独表达所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶的菌体。

在一种实施方式中，所述菌体以酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等为宿主。

在一种实施方式中，所述α-葡萄糖苷酶的添加量为1～20U/g底物；所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为5～20U/g底物。

在一种实施方式中，将液化液的DE值调节为15-20，并将液化液冷却至30℃～45℃，调节pH值5.0～6.0，添加Aspergillus nidulans来源的α-葡萄糖苷酶3U/g底物和α/β-CGTase 20U/g底物进行反应。

在一种实施方式中，将液化液的DE值调节为15-20，并将液化液冷却至30℃～45℃，调节pH值5.0～6.0，加Aspergillus niger来源α-葡萄糖苷酶5U/g底物和α-CGTase15U/g底物进行反应。

在一种实施方式中，将液化液的DE值调节为5-7，并将液化液冷却至30℃～45℃，调节pH值5.0～6.0，添加Aspergillus nidulans来源α-葡萄糖苷酶5U/g底物和α/β-CGTase10U/g底物进行反应。

在一种实施方式中，将液化液的DE值调节为5-7，并将液化液冷却至30℃～45℃，调节pH值5.0～6.0，添加Aspergillus niger来源α-葡萄糖苷酶10U/g底物和β-CGTase10U/g底物进行反应。

在一种实施方式中，所述步骤(4)中在加入酵母粉后，在25～35℃、280～250rpm反应10～14h对产物进行纯化。

在一种实施方式中，所述步骤(5)中将反应物经7000～8000rpm离心15～25min取上清，利用0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥。

在一种实施方式中，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉，或淀粉衍生物。

在一种实施方式中，所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉。

在一种实施方式中，所述薯类淀粉包括木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉；所述淀粉衍生物包括麦芽糊精、不同DE值糊精、可溶性淀粉。

本发明还提供了所述制备高聚合度低聚异麦芽糖的方法在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

在一种实施方式中，所述应用包括制备高聚合度IMO复配工艺，和/或利用低聚糖，和/或生产高聚合度IMO。

在一种实施方式中，所述食品包含乳制品、婴幼儿配方食品、米面制品、肉制品、糖果、饮料。

在一种实施方式中，所述乳制品包含酸奶、奶酪、冰淇淋、植物蛋白乳制品。

在一种实施方式中，饮料包含运动饮料、低糖饮料、膳食纤维饮料、五谷杂粮饮料。

在一种实施方式中，所述米面制品包含烘焙制品、面条、米粉、方便面条、方便米饭。

在一种实施方式中，所述烘焙制品包含面包、西饼、蛋糕。

本发明的有益效果：

(1)本发明所提供的高聚合度IMO制备新方法，即利用α-葡萄糖苷酶与CGTase进行酶反应制得，利用双酶法制备出的高聚合度IMO，平均分子量为700～1500Da，平均聚合度约4～10，α-1,4糖苷键含量为20～40％，α-1,6糖苷键含量为60～80％，转化率可达81.2％；

(2)本发明制备的高聚合度IMO具有很高的溶解性，且在室温条件下浓缩至65％放置2年不易聚集沉淀；

(3)相比传统制备的IMO，本发明制备的IMO聚合度较高；

(4)本发明制备的高聚合度IMO具有很强的抗消化性能，可进入结肠发挥益生元作用。

附图说明

图1为不同α-葡萄糖苷酶与CGTase加酶量与反应时间对高聚合度IMO转化率影响；α-葡萄糖苷酶来源于Aspergillus nidulans。

图2为高聚合度IMO产物NMR图谱。

图3为室温条件下浓缩至65％放置两年后状态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不局限于此。

实施例中所述的培养基配方如下：

(1)YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基(g·L^-1):酵母提取物10.0，胰蛋白胨20.0，葡萄糖20.0；

(2)BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium，含有甘油的缓冲性复杂培养基)培养基(g·L^-1):YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源)13.4，酵母提取物10.0，胰蛋白胨20.0，甘油10.0，生物素4×10^-4；

(3)BMMY(Buffered Methanol-complex Medium，含有甲醇的缓冲性复杂培养基)培养基(g·L^-1):YNB 13.4，酵母提取物10.0，胰蛋白胨20.0，生物素4×10^-4；

实施例中体外消化特性所述的胃蛋白酶溶液和混酶溶液配方如下：

(1)胃蛋白酶溶液：0.05g猪胃蛋白酶溶于10mL HCl(0.05M)中配制成5mg·mL^-1酶液；

(2)混酶溶液：3g猪胰酶加入20mL去离子水旋涡振荡5min以充分混匀，3500rpm、4℃条件下离心10min。取上清15mL，与1.1mL淀粉葡萄糖苷酶充分混合制得混酶溶液，现用现配，冰浴保存。

实施例中所述的糖化酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；猪胃蛋白酶(P6887)，猪胰酶(P7545)，淀粉葡萄糖苷酶(A7095)均购自美国Sigma-Aldrich公司；葡萄糖氧化试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；高活性干酵母粉购自安琪酵母股份有限公司。

酶活测定：

以麦芽糖为底物测定α-葡萄糖苷酶的酶活。用40mM pH 5.5乙酸钠缓冲液配制3％麦芽糖底物，45℃反应5分钟后煮沸10分钟灭活，离心取上清后经HPLC测定异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖生成量。一个酶活单位定义为酶每分钟催化转苷1μmol葡萄糖基,即每生成1μmol异麦芽糖就有1μmol葡萄糖基发生转苷，生成1μmol潘糖也是1μmol葡萄糖基发生转苷，但生成1μmol异麦芽三糖就有2μmol葡萄糖基发生转苷，通过HPLC检测各产物的生成量计算酶活。

EPS(4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷)法测定CGTase歧化活性：使用pH5.5 50mM的磷酸盐缓冲液配置4mM EPS和20mM麦芽糖底物，将两种底物(EPS和麦芽糖)各取300μL进行预混，将反应混合物在50℃预热10min后，将100μL适当稀释的酶液加入混合物中，精确反应10min后，通过沸水浴加热10min后终止反应；然后加入200μL缓冲液，加入100μLα-葡萄糖苷酶，60℃条件下反应1h；最后加入200μL 1M Na₂CO₃终止反应。在405nm下测量其吸光值。一个酶活单位(U)定义为该测定条件下每分钟转化1μmol EPS所需的酶量。

实施例1：α-葡萄糖苷酶与CGTase在高聚合度IMO制备中的应用

具体步骤为：

1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为5-7；

2)冷却至30～45℃，调节pH值5.0～6.0，同时添加Aspergillus nidulans来源α-葡萄糖苷酶5U/g底物和α/β-CGTase 10U/g底物，放入恒温式水浴摇床，45℃反应12h；

3)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

4)取5mL反应液8000rpm离心5min，获得的上清液测定产物转化率；

5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉8～12g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到IMO产物。

测定所得的反应产物转化率为74.24％，α-1,4键比率为41.49％，α-1,6键比率为58.51％，平均分子量约1138Da，约7个聚合度葡萄糖。

实施例2：α-葡萄糖苷酶与CGTase在高聚合度IMO制备中的应用

具体步骤如下：

1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为15-20；

2)冷却至30～45℃，调节pH值5.0～6.0，同时添加Aspergillus niger来源α-葡萄糖苷酶5U/g底物和α-CGTase 15U/g底物，放入恒温式水浴摇床，45℃反应12h；

3)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

4)取5mL反应液8000rpm离心5min，获得的上清液测定产物转化率；

5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉8～12g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到IMO产物。

测定所得的反应产物转化率为61.32％，α-1,4键比率为48.32％，α-1,6键比率为51.68％，平均分子量约721Da，约4～5个聚合度葡萄糖。

实施例3：α-葡萄糖苷酶与CGTase在高聚合度IMO制备中的应用

具体步骤如下：

1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为15-20；

2)冷却至30～45℃，调节pH值5.0～6.0，同时添加Aspergillus nidulans来源α-葡萄糖苷酶3U/g底物和α/β-CGTase 20U/g底物，放入恒温式水浴摇床，45℃反应12h；

3)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

4)取5mL反应液8000rpm离心5min，获得的上清液测定产物转化率；

5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉8～12g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到IMO产物。

测定所得的反应产物转化率为81.2％，α-1,4键比率为37.59％，α-1,6键比率为62.41％，平均分子量约1338Da，约8个聚合度葡萄糖。

实施例4：α-葡萄糖苷酶与CGTase在高聚合度IMO制备中的应用

具体步骤如下：

1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为15-20；

2)冷却至30～45℃，调节pH值5.0～6.0，同时添加Aspergillus niger来源α-葡萄糖苷酶10U/g底物和β-CGTase 10U/g底物，放入恒温式水浴摇床，45℃反应12h；

3)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

4)取5mL反应液8000rpm离心5min，获得的上清液测定产物转化率；

5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10～12g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到IMO产物。

测定所得的反应产物转化率为62.36％，α-1,4键比率为44.87％，α-1,6键比率为55.13％，平均分子量约699Da，约4～5个聚合度葡萄糖。

实施例5：产物链长分布分析

具体步骤如下：

采用高效阴离子交换色谱测定IMO产物链长分布。去离子水配制IMO产物至1g/L，0.22μm滤膜过滤后放入进样盘，色谱柱为CarboPac PA200柱，流动相为250mM NaOH，1MNaAc+100mM NaOH和去离子水混合液，流速为0.5mL/min，时间为50min，梯度洗脱方法如下表所示：

表1

测定所得产物链长分布如下表所示：

表2

实施例6：IMO的体外消化特性

具体步骤如下：

1)0.6g IMO产物加入5mL乙酸缓冲液(0.25M，pH 5.2)，加热3-5min后加入50mg瓜尔胶混合均匀，加入10mL胃蛋白酶溶液，37℃恒温水浴摇床160rpm反应30min；

2)反应后加入5mL乙酸钠缓冲液(0.25M,pH 5.2)，并加入20颗玻璃珠，37℃恒温水浴摇床继续反应30min，然后加入5mL混酶溶液开始计时反应，分别于0、20和120min取样；

3)取200μL样品加入1.8mL乙醇溶液(66.6％)以终止反应，3500rpm离心5min，取上清液60μL利用葡萄糖氧化试剂盒测定葡萄糖含量。

其中，在0～20min内被消化的淀粉称为快速消化淀粉(Rapidly DigestibleStarch，RDS)，在20～120min内被消化的淀粉称为慢消化淀粉(Slowly DigestibleStarch，SDS)，在120min内不被消化的淀粉称为抗性淀粉(Resistant Starch，RS)。根据G₀(游离葡萄糖含量)、G₂₀(消化20min后释放的葡萄糖含量)以及G₁₂₀(消化120min后释放的葡萄糖含量)的值，计算样品的RDS、SDS和RS含量，计算公式如下：

RDS(％)＝(G₂₀-G₀)×0.9×100

SDS(％)＝(G₁₂₀-G₂₀)×0.9×100

RS(％)＝100％-RDS(％)-SDS(％)

体外消化性试验测的IMO RDS含量为20.06％，SDS含量为12.23％，RS为67.71％。

实施例7：IMO的溶解特性

具体步骤如下：

1.0mL去离子水溶解IMO样品，磁力搅拌器搅拌10min，继续加入样品，用磁力搅拌器搅拌至饱和。3000r/min离心10min后，取上清液移至称重的EP管中，放于105℃下干燥至恒重。根据沉淀物的重量和移液体积计算IMO的溶解度。

测得的IMO的溶解度为357.8g/100mL，该产物溶解度高，室温条件下浓缩至65％放置2年未聚集沉淀(图3)。

实施例8：以淀粉为底物酶法制备高聚合度IMO其它方法

包括以下分析：

淀粉为高分子易消化(α-1,4键含量>95％)碳水化合物，利用糖基转移酶可将易消化的α-1,4键转化成抗消化的α-1,6键。本研究利用α-淀粉酶先将淀粉糊化液化成糊精(淀粉低度水解产物)，再利用高效的糖基转移酶制备转化率且聚合度高的IMO。前期研究中，利用中国专利CN202111405478.9中Geobacillus sp.12AMOR1来源4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfD进行转糖基反应制备高聚合度IMO，反应后经糖化酶水解后，产物转化率约30-35％。利用中国专利CN201911024332.2中Vibrio vulnificus来源糖原分支酶进行糖基反应制备高聚合度IMO，反应后经糖化酶水解后，产物转化率约25-40％。利用市售Aspergillus niger来源α-葡萄糖苷酶进行酶转化反应，由于该酶水解活性很高，产物IMO转化率约20-30％，产物转化率均不高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> BAA220384A

<130> 一种高聚合度低聚异麦芽糖制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 935

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans

<400> 1

Ser Gln Ala Gly Val Asp Pro Leu Asp Arg Pro Gly Asn Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Val Lys Asp Leu Ser Asn Cys Thr Gly Tyr Lys Val Thr Lys His Trp

20 25 30

Lys Thr Arg Ser Gly Phe Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Ala Gly Pro Ala

35 40 45

Cys Asn Val Tyr Gly Ile Asp Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Val Glu

50 55 60

Tyr Gln Thr Asp Glu Arg Leu His Val Lys Ile Leu Asp Thr Asn Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Gln Val Pro Asp Ser Val Phe Pro Arg Pro Gly Phe Gly

85 90 95

Gln Trp Cys Ser Pro Lys Asn Ser Lys Leu Lys Phe Asp Phe Lys Pro

100 105 110

Asp Pro Phe Ser Phe Thr Val Ser Arg Thr Asp Thr Gly Glu Val Leu

115 120 125

Phe Asp Thr Thr Gly Thr Lys Leu Val Phe Glu Asn Gln Tyr Leu Tyr

130 135 140

Leu Lys Thr His Leu Pro Gln Asn Pro His Leu Tyr Gly Leu Gly Glu

145 150 155 160

His Ser Asp Ser Phe Met Leu Asn Thr Thr Asn Tyr Thr Arg Thr Ile

165 170 175

Tyr Thr Arg Asp Ala Tyr Gly Thr Pro Gln Gly Gln Asn Leu Tyr Gly

180 185 190

Ala His Pro Ile Tyr Phe Asp His Arg Gln Asp Gly Thr His Gly Val

195 200 205

Phe Leu Leu Asn Ser Asn Gly Met Asp Ile Tyr Ile Asp Asn Glu Gly

210 215 220

Gly Gln Phe Leu Glu Tyr Asn Ile Ile Gly Gly Val Phe Asp Phe Tyr

225 230 235 240

Phe Ile Ala Gly Pro Ser Pro Gln Asp Val Ala Arg Gln Tyr Ala Glu

245 250 255

Ile Val Gln Pro Pro Leu Met Val Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His

260 265 270

Gln Cys Arg Tyr Gly Tyr Gln Asp Val Tyr Glu Val Ala Ala Val Thr

275 280 285

Ala Asn Tyr Ser Val His Asp Ile Pro Leu Glu Thr Ile Trp Thr Asp

290 295 300

Ile Asp Tyr Met Asp Arg Arg Arg Ile Phe Thr Leu Asp Pro Glu Arg

305 310 315 320

Phe Pro Pro Glu Leu Val Lys Asp Leu Val Asp Thr Leu His Ala Arg

325 330 335

Asp Gln His Tyr Ile Val Met Val Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Ser Glu

340 345 350

Pro Asn Pro Ala Leu Asp Ala Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Phe Met Lys

355 360 365

Glu Leu Asn Gly Thr His Tyr Gln Gly Val Val Trp Ala Gly Pro Ser

370 375 380

Tyr Phe Pro Asp Trp Phe His Pro Asn Ala Gln Glu Tyr Trp Thr Glu

385 390 395 400

Gln Phe Leu Asn Phe Phe Asp Gly Val Asn Gly Pro Asp Ile Asp Ala

405 410 415

Leu Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ala Asn Phe Tyr Asn Arg Pro Tyr

420 425 430

Pro Gly Asn Asn Thr Thr Pro Glu Glu Phe Ala Glu Ala Asn Asp Asn

435 440 445

Pro Pro Glu Pro Pro Ala Val Arg Asp Gly Pro Asp Ala Pro Ile Pro

450 455 460

Gly Phe Pro Asp Ser Leu Gln Pro Asn Phe Ala Ser Gly Gln Thr Asn

465 470 475 480

Glu Lys Arg Ala Val Val Thr Val Glu Arg Arg Ala Arg Ser Gln Ser

485 490 495

His Arg Gln Leu Gly Ala Gly Arg Trp Arg Ser Ala Val Arg His Trp

500 505 510

Pro Arg Asp Pro Lys Ala Gly Trp Gln His Gly Arg Lys Ser Gly Ser

515 520 525

Gly Cys Gly Pro His Glu Cys Arg Gly Leu Pro Asn Arg Glu Leu Ile

530 535 540

Arg Pro Pro Tyr Met Ile Gln Asn Gly Ala Gly Pro Thr Leu Ala Asp

545 550 555 560

Asn Thr Ala Asp Thr Asp Ile Val Gln Ser Gly Gly Tyr Val Gln Tyr

565 570 575

Asp Thr His Ser Leu Tyr Gly Ala Met Met Ser Thr His Ser His Asn

580 585 590

Ala Met Arg Ala Arg Arg Pro Asp Asp Arg Ala Leu Val Ile Thr Arg

595 600 605

Ser Thr Phe Ala Gly Ser Gly Lys Asp Val Ser His Trp Leu Gly Asp

610 615 620

Asn Ile Ser Asp Trp Leu Ser Tyr Arg Leu Ser Ile Ser Gln Ile Leu

625 630 635 640

Gln Phe Ala Ser Leu Tyr Gln Ile Pro Val Val Gly Pro Asp Val Cys

645 650 655

Gly Phe Gly Gly Asn Val Thr Glu Thr Leu Cys Ala Arg Trp Ala Thr

660 665 670

Leu Gly Ser Phe Tyr Thr Phe Phe Arg Asn His Ala Glu Ile Phe Ala

675 680 685

Asn Pro Gln Glu Phe Tyr Arg Trp Pro Ile Val Ala Glu Ala Ala Arg

690 695 700

Asn Gly Ile Ala Ile Arg Tyr Gln Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr Thr Ala

705 710 715 720

Ile Tyr Lys Gln Thr Gln Thr Gly Thr Pro Ser Leu Asn Pro Leu Phe

725 730 735

Phe Asn Tyr Pro Phe Asp Gln Asn Thr Tyr Gly Ile Asp Leu Gln Phe

740 745 750

Phe Tyr Gly Pro Gly Ile Leu Val Ser Pro Val Thr Glu Glu Asn Ser

755 760 765

Thr Ser Val Ser Tyr Tyr Leu Pro Asp Asp Ile Phe Tyr Glu Trp Gly

770 775 780

Thr Gly Lys Pro Val Arg Gly His Gly Glu Tyr Val Ser Ala Glu Val

785 790 795 800

Asp Val Thr His Ile Thr Val His Tyr Lys Gly Gly Leu Val Tyr Pro

805 810 815

Gln Arg Ile Glu Ser Ala Asn Thr Thr Thr Ala Leu Arg Gln Lys Gly

820 825 830

Phe Asn Ile Val Ile Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ser Ala His Gly Glu

835 840 845

Leu Tyr Leu Asp Asp Gly Leu Ser Gln Val Gln Asp Lys Val Ser Glu

850 855 860

Ile Asp Phe Ser Tyr Val Asp Gly Val Phe Glu Met Lys Gly Ser Phe

865 870 875 880

Glu Tyr Asp Pro Gly Val Gly Ile Glu Arg Ile Thr Ile Leu Gly Val

885 890 895

Gly Ala Lys Pro Glu Val Ala Ala Glu Asp Ala Glu Val Glu Tyr Asp

900 905 910

Glu Glu Asn Gln Lys Leu Val Leu His Val Asp Val Pro Leu Thr Arg

915 920 925

Lys Ser Ser Ile Lys Ile Ala

930 935

<210> 2

<211> 686

<212> PRT

<213> Niallia circulans

<400> 2

Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn

20 25 30

Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Thr Cys Thr Asn Leu Arg Leu

35 40 45

Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Tyr Ser Ile Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr

100 105 110

Gly Thr Ile Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ala Lys

115 120 125

Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Ser Ser Asp Gln Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu Asn Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Thr Val Asp

195 200 205

Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Ile Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Met Ala Ala Val Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly

245 250 255

Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Val Ser Pro Glu Asn His Lys Phe

260 265 270

Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys

275 280 285

Val Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys

290 295 300

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305 310 315 320

Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Ala Ser Asn

325 330 335

Ala Asn Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser

340 345 350

Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ser Gly

355 360 365

Gly Thr Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Ser

370 375 380

Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Cys

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Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn

405 410 415

Asp Val Leu Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Ser Asn Val Ala Val Val

420 425 430

Ala Val Asn Arg Asn Leu Asn Ala Pro Ala Ser Ile Ser Gly Leu Val

435 440 445

Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Leu Leu

450 455 460

Asn Gly Asn Thr Leu Ser Val Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe

465 470 475 480

Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Ala Thr

485 490 495

Ala Thr Pro Thr Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly

500 505 510

Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Ser Lys Gly Thr

515 520 525

Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Ser Gly Ala Asp Ile Thr Ser Trp

530 535 540

Glu Asp Thr Gln Ile Lys Val Lys Ile Pro Ala Val Ala Gly Gly Asn

545 550 555 560

Tyr Asn Ile Lys Val Ala Asn Ala Ala Gly Thr Ala Ser Asn Val Tyr

565 570 575

Asp Asn Phe Glu Val Leu Ser Gly Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val

580 585 590

Val Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly

595 600 605

Ser Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Ala Lys Ala Ile Gly Pro

610 615 620

Met Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Tyr Asp Val

625 630 635 640

Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln

645 650 655

Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr Ala

660 665 670

Pro Ser Ser Gly Thr Ala Thr Ile Asn Val Asn Trp Gln Pro

675 680 685

Claims (9)

1.一种制备高聚合度低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，利用α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶以淀粉为底物，制备高聚合度低聚异麦芽糖；所述方法包含如下步骤：

（1）以淀粉为底物，配制成浓度为10~30%的悬浊液，将悬浊液经糊化后，再加入α-淀粉酶液化得到液化液；

（2）将液化液冷却至30~45℃，调节pH值5.0~6.0，并添加所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶，在40~50℃反应10~15 h；

（3）将步骤（2）中得到的反应物冷却至室温，调pH至4.0~5.0，加糖化酶至酶的作用剂量不少于66 U/g底物，置于55~65℃水浴摇床中持续振荡，反应25~35 min；

（4）反应结束后95℃，20 min灭酶，加入终浓度为10~12 g/L的酵母粉进行消化，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖和麦芽糖；

（5）将反应产物离心后取上清，经喷雾干燥最终得到低聚异麦芽糖产物。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶来源于Aspergillus nidulans或Aspergillus niger，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Bacillus stearothermophilus NO2、Niallia circulans或Paenibacillus macerans JFB 05-01。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述来源于Aspergillus nidulans的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述来源于Niallia circulans的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶包括酶液、干粉、共表达或分别单独表达所述α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶的菌体。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶的添加量为1~20 U/g底物；所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为5~20 U/g底物。

6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中在加入酵母粉后，在25~35℃、280~250 rpm反应10~14 h对产物进行纯化。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中将反应物经7000~8000rpm离心15~25 min取上清，利用0.45 μm滤膜过滤后喷雾干燥。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉；所述薯类淀粉包括木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉。