CN112553271A

CN112553271A - 一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的制备方法

Info

Publication number: CN112553271A
Application number: CN202011476048.1A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 王蕾; 魏贝贝; 夏伟; 陈晟; 杨卫康; 金雪薇
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-03-26

Abstract

本发明公开了一种含α‑1,2糖苷键低热量糊精的制备方法，属于功能食品领域。可用作食物和饲料应用中的耐消化纤维。所述低热量糊精，平均分子量约为1000～5000Da，聚合度约5～30，α‑1,2糖苷键含量约2‑50％。所述低热量糊精的制备方法为：以淀粉为底物，利用4,6‑α‑葡萄糖基转移酶Gtf B及分支蔗糖酶△N₁₂₃‑GBD‑CD₂进行酶促反应制得低热量糊精粗品，经热稳定α‑淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶酶解后利用酵母菌体分离、干燥，制得含α‑1,2糖苷键的低热量糊精。该方法条件温和，键型复杂，成本低。这种淀粉衍生的分支α‑葡聚糖在食品工业中具有广泛应用。

Description

一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的制备方法

技术领域

本发明涉及一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的制备方法，属于功能食品领域。

背景技术

低热量糊精是一类富含α-1,2、α-1,3及α-1,6糖苷键或环状糖链结构的可溶性糊精的总称，是一种新型的低热量葡聚糖，一般由淀粉为原料制成，但具有比原料淀粉显著复杂的分支结构，且正是这些分支结构使低热量糊精具有了抗消化的性能，因而对人体来说是低热量的食物。同时，低热量糊精产品具有水溶性好、溶速快、无色无味等特性，在改善食品口感、优化食品加工性能等方面独具优势，在饮料、烘焙、乳制品等行业具有广泛的应用。

日本科学家在20世纪80年代首先对低热量糊精进行研究，其采用高温酸解化学法介导糖苷键重构制备低热量糊精，以不同浓度酸和温度处理淀粉底物，水解其中的α-1,4糖苷键，使产生的不同糖链之间重新发生脱水缩合而形成抗消化性糖苷键。然而，大量研究表明，这种高温酸解液中抗性成分含量只能达到40-50％，随后采用淀粉酶降解其中易消化的α-1,4糖苷键并色谱分离去除葡萄糖麦芽糖等物质，从而将抗性成分提高至80％以上。然而该方法不仅分离纯化工艺复杂，而且原料利用率低，导致成本高，难以满足大众消费需求。目前，对可再生自然资源通过环保工艺生产可生物降解多糖和低聚糖的需求正在增加，相比于化学法合成单体组成、键型比例和聚合度不同的低热量糊精，酶法合成是一种非常有前途的替代方法。

近年来，糖苷水解酶GH70亚家族分支蔗糖酶的发现为制备低热量糊精提供了新思路，该酶能以右旋糖酐为受体蔗糖为供体合成带α-1,2或α-1,3糖苷键分支的α-葡聚糖，但该酶不能单独作用与淀粉或蔗糖，且以右旋糖酐为底物生产成本高不利于工业化放大生产。我们以淀粉为底物利用4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B生成一种低分子量抗性糊精，该抗性糊精富含α-1,6键，分子量低且产率不高，已公开于公开号为CN202010288282.5中国专利文献中。但该抗性糊精仅含α-1,4和α-1,6糖苷键，该键型葡聚糖在一定程度上仍可被口腔、胰腺肠道中的消化酶消化，并且该产物抗性含量较低，因而需要提供一种键型更加丰富、且抗性含量高的抗性糊精。

发明内容

针对现有技术存在的缺点，本发明使用一种分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂，该酶可以右旋糖酐或异麦芽/麦芽-多糖(IMMP)为受体制备富含α-1,2糖苷键的低热量糊精，分子量在1000～5000Da之间，并利用已公开于公开号为CN202010288282.5专利中的4,6-α-葡萄糖基转移酶与该酶的生化特性开发了一种新的工艺技术，可获得一系列符合低热量糊精理化指标的产品，该产品溶解性好、α-1,2糖苷键比率高，且抗性含量达60％以上，其可能构成一种新型益生元，为维持和改善人类健康提供有力保障，本发明为酶法制备复杂键型低热量糊精的工业化生产奠定坚实的理论基础。

本发明提供了一种制备抗性糊精的方法，所述方法是以淀粉或含有淀粉的物质为底物，利用4,6-α-葡萄糖基转移酶和分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂进行酶促反应。

在一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。

在一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列已在申请号为CN202010288282.5专利中公开。

在一种实施方式中，所述分支蔗糖酶来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

在一种实施方式中，所述分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉，或淀粉衍生物；所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉；所述薯类淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉等薯类淀粉；所述淀粉衍生物为麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉等淀粉衍生物；所述含有淀粉的物质为大米蛋白肽。

在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成悬浊液，将悬浊液糊化，再加淀粉酶液化得到反应液；

(2)将液化后的反应液冷却至30～45℃，调节pH值5.0～7.5，添加普鲁兰酶底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶，35～40℃反应20～30h；

(3)调pH值5.0～6.0，加入蔗糖和分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂，40-45℃反应20～30h；

(4)步骤(3)反应结束后，将反应体系升温至90-95℃灭酶，并加入α-淀粉酶，反应20～40min；

(5)步骤(4)反应结束后，冷却至室温，调pH至4.0～5.0，加淀粉葡萄糖苷酶，置于50～60℃反应30min；

(6)步骤(5)反应结束后将反应液进行灭酶，灭酶后向反应液中加入酵母进行消化；

(7)消化结束后，将反应产物离心并取上清，将上清经过滤后干燥，最终得到成品。

在一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的添加量为2000～5000U/g底物。

在一种实施方式中，所述分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂的添加量为0.5～5U/mL底物。

在一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的终浓度为2～40g/100mL。

在一种实施方式中，步骤(1)所述悬浊液的浓度为10～20g/100mL。

在一种实施方式中，将淀粉加水调成10～30g/100mL悬浊液后，将悬浊液开始进行糊化；在淀粉酶液化过程中控制液化液DE值在3～8。

在一种实施方式中，控制液化液pH值在5.5～7.5和温度在30～45℃，向液化液中加入普鲁兰酶和4,6-α-葡萄糖基转移酶，在35～50℃反应22～28小时后，向反应体系中加入2～40％蔗糖供体，并加入分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂；所述普鲁兰酶添加量为10～80U/g底物。

在一种实施方式中，调节温度至90～100℃，添加热稳定α-淀粉酶，反应30min；α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物。

在一种实施方式中，调节温度至50～70℃，调节pH至4.0～5.0，加入淀粉葡萄糖苷酶，反应25～35min；反应后对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；所述淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物。

在一种实施方式中，调节温度90～100℃，15～25min灭酶，降至室温，添加活性干酵母消化或通过色谱分离除去体系葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等小分子糖。

本发明提供了所述方法制备得到的抗性糊精。

本发明提供了所述方法，或所述抗性糊精在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含α-1,2糖苷键的低热量糊精，和/或利用低聚糖，和/或生产含α-1,2糖苷键的糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述食品包含乳制品、婴幼儿配方食品、米面制品、肉制品、糖果、饮料。

在本发明的一种实施方式中，所述乳制品包含酸奶、奶酪、冰淇淋、植物蛋白乳制品。

在本发明的一种实施方式中，饮料包含运动饮料、低糖饮料、膳食纤维饮料、五谷杂粮饮料。

在本发明的一种实施方式中，所述米面制品包含烘焙制品、面条、米粉、方便面条、方便米饭。

在本发明的一种实施方式中，所述烘焙制品包含面包、西饼、蛋糕。

本发明的有益效果：本发明的一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的方法和现有技术相比，具有以下特点：

(1)本发明所使用的分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂不仅能以线性α-1,6键右旋糖酐为受体还可以异麦芽/麦芽-多糖(IMMP)为受体，不同浓度蔗糖为供体，引入-(1→2,6)-α-D-Glcp-(1→6)-分支点，生成α-1,2糖苷键可控的低热量糊精；

(2)本发明利用双酶法制备出含α-1,2糖苷键低热量糊精，平均分子量为1000-5000Da，平均聚合度为5～30，α-1,2糖苷键含量为2-50％，且膳食纤维含量在60％以上；

(3)相比于传统高温酸解法制备低热量糊精，本方法产率高，制备工艺简单，反应条件比较温和，清洁安全、无毒性产物生成；

(4)本发明制备得到的低热量糊精可作为食品添加剂，进入结肠，例如作为益生元能够被用于多种食品应用中，从乳制品到烘焙食品、糖果和饮料应用，可改善食品的质地和口感，便于在食品、保健品尤其是高端食品和保健品领域广泛应用。

附图说明

图1为4,6-α-葡萄糖基转移酶产物键型比例。

图2为含α-1,2糖苷键低热量糊精键型比例，蔗糖供体添加量为25～30％。

图3为含α-1,2糖苷键低热量糊精键型比例，蔗糖供体添加量为7～10％。

图4为含α-1,2糖苷键低热量糊精键型比例，蔗糖供体添加量为2～4％。

图5为不同含量α-1,2糖苷键低热量糊精分子量分布。

具体实施方式

1、实施例中所述的培养基配方如下：

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄ 2.31。

2、实施例中所述的耐高温α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、普鲁兰酶均购自山东隆科特酶制剂有限公司，酶活分别为40kU/mL、100kU/mL、2kU/mL。

3、酶活测定：

用碘法测定实施例3～5中用到的4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB总酶活，具体测定方法及酶活定义已公开于公开号为CN202010288282.5的中国专利文献中；

采用改良的3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定实施例3～5中用到的分支蔗糖酶△N₁₂₃-GBD-CD₂酶活：

用50mM醋酸缓冲液(pH 5.5)配制20g/L的蔗糖为底物，15mL具塞试管中加入1mL底物、0.9mL 50mM醋酸缓冲液(pH5.5)，震荡混匀后，放入40℃水浴锅预热10min。加入100μL酶液/空白，40℃反应30min后加入3mL DNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15mL，540nm下测吸光度(以灭活的酶液或缓冲液做空白对照)；

酶活定义：在上述酶反应条件下，每分钟生成1μmol的果糖所需的酶量为1个酶活单位(U)。

S：还原糖量；1000：mg与μg之间的换算；n：酶活稀释倍数

T：反应时间；V：酶液量；M：相对分子质量

DNS试剂的配制：将6.5g DNS于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解，加入262mL的2mol/L氢氧化钠溶液，再加到500mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，然后分别加入5.0g苯酚和5.0g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加入蒸馏水定容1L，充分混匀保存于棕色瓶中。

4、膳食纤维含量测定方法：

测定方法参照国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》，测定结果为质量占比，采用百分比表示，例如60g/L表示为60％。

(1)IDF+SDF的计算

式中：

IDF+SDF—试样中不溶性膳食纤维(IDF)和高分子质量在乙醇中沉淀的可溶性膳食纤维(SDF)的总含量的百分含量(以质量分数计)，％；

m_SR1和m_SR2—双份试样中1和2的坩埚中残渣的质量，单位为毫克(mg)；

m_PS—残渣中蛋白质的质量，单位为毫克(mg)；

m_AS—残渣中灰分的质量，单位为毫克(mg)；

m_BR—空白的坩埚中残渣的质量，单位为毫克(mg)；

m_S1和m_S2—双份试样1和2的质量，单位为毫克(mg)。

(2)RMD的计算

式中：

RMD—试样中低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的百分含量(以质量分数计)，％；

m_RMD1和m_RMD2—双份试样1和2中DP≥3的低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的质量，单位为毫克(mg)；

m_S1和m_S2—双份试样1和2的质量，单位为毫克(mg)。

式中：

PA_RMD—DP≥3的低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的色谱峰面积；

PA_glyIS—丙三醇内标的色谱峰面积；

mgly_IS—抽滤液中加入的丙三醇内标的质量，单位为毫克(mg)；

RF—右旋葡萄糖的响应因子。

(3)TDF的计算

TDF＝(IDF+SDF)+RMD

式中：

TDF—试样中总膳食纤维的百分含量，％。

(4)色谱参考条件

色谱柱：Agilent Hi-Plex Ca,流动相为超纯水，流速为0.5mL/min,柱温80℃，检测器温度为40℃，进样量为10μL。

实施例1：分支蔗糖酶基因的合成及大肠杆菌转化

化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的目的基因分支蔗糖酶基因(△N₁₂₃-gbd-cd2)片段，摇瓶发酵，提取重组质粒pET-24a-△N₁₂₃-gbd-cd2，转化至大肠杆菌BL21(DE3)。

(1)将提前制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态放在冰上5min，向其中加入5μL重组质粒pET-24a-△N₁₂₃-gbd-cd2，轻柔吹吸均匀后，置于冰上静置30min；

(2)42℃水浴热激90s，迅速取出于冰上冷却2min；

(3)加入200μL 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃轻微振荡培养约40min，使细胞复苏；

(4)取适量复苏的感受态细胞涂布于含卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h，观察单菌落生长情况；

(5)挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/mL)抗性的10mL液体LB培养基中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。测序验证正确的阳性转化子即为含质粒pET-24a-△N₁₂₃-gbd-cd2的基因工程大肠杆菌。

实施例2：摇瓶发酵产酶

将实施例1中得到的重组大肠杆菌接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后，以发酵培养基体积5％(5mL/100mL)的接种量转接至50mL TB发酵培养基中，37℃、200rpm恒温培养1-2h，在菌体OD₆₀₀为0.5～0.7时添加IPTG(终浓度0.4mM)并转至25℃、200rpm诱导发酵12h。发酵结束后，将发酵液经高压匀浆破碎(破碎条件为4℃，800Bar)后离心(8000rpm、20min、4℃)，上清即为重组大肠杆菌所产的分支蔗糖酶酶液。

测定酶液酶活，经测定，分支蔗糖酶的酶活为3U/mL。

实施例3：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶在低热量糊精制备中的应用

(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％(20g/100mL)的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；

(2)冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，同时添加普鲁兰酶10-50U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶2500-4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；

(3)调pH值5.0-6.0，加入终浓度为25-30％(25-30g/100mL)蔗糖，同时加入2-3U/mL的分支蔗糖酶，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；

(4)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；

(5)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

(6)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；

(7)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。

测定所得的低热量糊精产率为48.21％，经酵母消化后，抗性含量为88.31％，α-1,2键比率为32.75％，α-1,4键比率为12.46％，α-1,6键比率为54.79％，平均分子量约3910Da，约24个聚合度葡萄糖。

实施例4：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶在低热量糊精制备中的应用

(3)调pH值5.0-6.0，加入7-10％(7-10g/100mL)蔗糖，同时加入2-3U/g底物的分支蔗糖酶，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；

测定所得的低热量糊精产率为55.16％，经酵母消化后，抗性含量为90.2％，α-1,2键比率为22.94％，α-1,4键比率为11.59％，α-1,6键比率为65.47％，平均分子量约3411Da，约21个聚合度葡萄糖。

实施例5：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶在低热量糊精制备中的应用

(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；

(3)调pH值5.0-6.0，加入2-4％(2-4g/100mL)蔗糖，同时加入2-3U/g底物的分支蔗糖酶，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；

测定所得的低热量糊精产率为61.05％，经酵母消化后，抗性含量为92.2％，α-1,2键比率为7.26％，α-1,4键比率为11.52％，α-1,6键比率为81.22％，平均分子量约3061Da，约19个聚合度葡萄糖。

对比例1

具体实施方式参见实施例3，区别在于，在制备过程中不添加蔗糖与分支蔗糖酶，反应结束后，测定所得的低热量糊精产率为49.91％，经酵母消化后，抗性含量为89％(在所提取的低热量抗性糊精中所占的百分比)，α-1,4键比率为12.19％，α-1,6键比率为87.81％，无α-1,2键，平均分子量约3057Da，约19个聚合度葡萄糖。

(3)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；

(4)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；

(5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、麦芽糖等小分子糖；

(6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。

由于该反应产物在酶反应后处理时淀粉葡萄糖苷酶加量不足660U/g底物(实际添加66U/g底物)，造成转化产物中部分α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键未被糖化酶水解完全，使膳食纤维含量偏高至75.32％，我们根据国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》规定的淀粉葡萄糖苷酶处理后测得该转化产物实际产率为49.91％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种含α-1,2糖苷键低热量糊精的制备方法

<130> BAA200806A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1079

<212> PRT

<213> Leuconostoc mesenteroides

<400> 1

Met Ala Gln Ala Gly His Tyr Ile Thr Lys Asn Gly Asn Asp Trp Gln

1 5 10 15

Tyr Asp Thr Asn Gly Glu Leu Ala Lys Gly Leu Arg Gln Asp Ser Asn

20 25 30

Gly Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Thr Thr Gly Ile Gln Ala Lys Gly

35 40 45

Gln Phe Val Thr Ile Gly Gln Glu Thr Tyr Tyr Phe Ser Lys Asp His

50 55 60

Gly Asp Ala Gln Leu Leu Pro Met Val Thr Glu Gly His Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Ile Thr Leu Lys Gln Gly Gln Asp Thr Lys Thr Ala Trp Val Tyr Arg

85 90 95

Asp Gln Asn Asn Thr Ile Leu Lys Gly Leu Gln Asn Ile Asn Gly Thr

100 105 110

Leu Gln Phe Phe Asp Pro Tyr Thr Gly Glu Gln Leu Lys Gly Gly Val

115 120 125

Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Phe Tyr Phe Glu Ser Gly Lys Gly Asn

130 135 140

Leu Val Ser Thr Val Ala Gly Asp Tyr Gln Asp Gly His Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Gln Asp Gly Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Lys Gln Asn Gln Leu Val Lys

165 170 175

Gly Leu Val Thr Val Asn Gly Ala Leu Gln Tyr Phe Asp Asn Ala Thr

180 185 190

Gly Asn Gln Ile Lys Asn Gln Gln Val Ile Val Asp Gly Lys Thr Tyr

195 200 205

Tyr Phe Asp Asp Lys Gly Asn Gly Glu Tyr Leu Phe Thr Asn Thr Leu

210 215 220

Asp Met Ser Thr Asn Ala Phe Ser Thr Lys Asn Val Ala Phe Asn His

225 230 235 240

Asp Ser Ser Ser Phe Asp His Thr Val Asp Gly Phe Leu Thr Ala Asp

245 250 255

Thr Trp Tyr Arg Pro Lys Ser Ile Leu Ala Asn Gly Thr Thr Trp Arg

260 265 270

Asp Ser Thr Asp Lys Asp Met Arg Pro Leu Ile Thr Val Trp Trp Pro

275 280 285

Asn Lys Asn Val Gln Val Asn Tyr Leu Asn Phe Met Lys Ala Asn Gly

290 295 300

Leu Leu Thr Thr Ala Ala Gln Tyr Thr Leu His Ser Asp Gln Tyr Asp

305 310 315 320

Leu Asn Gln Ala Ala Gln Asp Val Gln Val Ala Ile Glu Arg Arg Ile

325 330 335

Ala Ser Glu His Gly Thr Asp Trp Leu Gln Lys Leu Leu Phe Glu Ser

340 345 350

Gln Asn Asn Asn Pro Ser Phe Val Lys Gln Gln Phe Ile Trp Asn Lys

355 360 365

Asp Ser Glu Tyr His Gly Gly Gly Asp Ala Trp Phe Gln Gly Gly Tyr

370 375 380

Leu Lys Tyr Gly Asn Asn Pro Leu Thr Pro Thr Thr Asn Ser Asp Tyr

385 390 395 400

Arg Gln Pro Gly Asn Ala Phe Asp Phe Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp

405 410 415

Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu Asn Trp Leu His Tyr

420 425 430

Leu Met Asn Phe Gly Thr Ile Thr Ala Gly Gln Asp Asp Ala Asn Phe

435 440 445

Asp Ser Ile Arg Ile Asp Ala Val Asp Phe Ile His Asn Asp Thr Ile

450 455 460

Gln Arg Thr Tyr Asp Tyr Leu Arg Asp Ala Tyr Gln Val Gln Gln Ser

465 470 475 480

Glu Ala Lys Ala Asn Gln His Ile Ser Leu Val Glu Ala Gly Leu Asp

485 490 495

Ala Gly Thr Ser Thr Ile His Asn Asp Ala Leu Ile Glu Ser Asn Leu

500 505 510

Arg Glu Ala Ala Thr Leu Ser Leu Thr Asn Glu Pro Gly Lys Asn Lys

515 520 525

Pro Leu Thr Asn Met Leu Gln Asp Val Asp Gly Gly Thr Leu Ile Thr

530 535 540

Asp His Thr Gln Asn Ser Thr Glu Asn Gln Ala Thr Pro Asn Tyr Ser

545 550 555 560

Ile Ile His Ala His Asp Lys Gly Val Gln Glu Lys Val Gly Ala Ala

565 570 575

Ile Thr Asp Ala Thr Gly Ala Asp Trp Thr Asn Phe Thr Asp Glu Gln

580 585 590

Leu Lys Ala Gly Leu Glu Leu Phe Tyr Lys Asp Gln Arg Ala Thr Asn

595 600 605

Lys Lys Tyr Asn Ser Tyr Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Leu Met Leu

610 615 620

Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Arg Met Tyr Tyr Gly Asp Met Tyr Gln

625 630 635 640

Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Asn Lys Ser Ile Tyr Tyr Asp Ala Leu

645 650 655

Val Ser Leu Met Thr Ala Arg Lys Ser Tyr Val Ser Gly Gly Gln Thr

660 665 670

Met Ser Val Asp Asn His Gly Leu Leu Lys Ser Val Arg Phe Gly Lys

675 680 685

Asp Ala Met Thr Ala Asn Asp Leu Gly Thr Ser Ala Thr Arg Thr Glu

690 695 700

Gly Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Asp Pro Lys Leu Gln Leu Asn Asp

705 710 715 720

Ser Asp Lys Val Thr Leu Asp Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln Lys

725 730 735

Tyr Arg Ala Val Ile Leu Thr Thr Arg Asp Gly Leu Ala Thr Phe Asn

740 745 750

Ser Asp Gln Ala Pro Thr Ala Trp Thr Asn Asp Gln Gly Thr Leu Thr

755 760 765

Phe Ser Asn Gln Glu Ile Asn Gly Gln Asp Asn Thr Gln Ile Arg Gly

770 775 780

Val Ala Asn Pro Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Trp Val Pro Val

785 790 795 800

Gly Ala Ser Asp Asn Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ala Thr Thr Thr Glu

805 810 815

Asn His Asp Gly Lys Val Leu His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser Asn

820 825 830

Leu Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Pro Lys Ala Thr Thr His

835 840 845

Asp Glu Leu Thr Asn Val Val Ile Ala Lys Asn Ala Asp Val Phe Asn

850 855 860

Asn Trp Gly Ile Thr Ser Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Arg Ser Ser

865 870 875 880

Gly Asp His Thr Phe Leu Asp Ser Thr Ile Asp Asn Gly Tyr Ala Phe

885 890 895

Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Phe Asn Thr Pro Thr Lys Tyr Gly Thr

900 905 910

Asp Gly Asp Leu Arg Ala Thr Ile Gln Ala Leu His His Ala Asn Met

915 920 925

Gln Val Met Ala Asp Val Val Asp Asn Gln Val Tyr Asn Leu Pro Gly

930 935 940

Lys Glu Val Val Ser Ala Thr Arg Ala Gly Val Tyr Gly Asn Asp Asp

945 950 955 960

Ala Thr Gly Phe Gly Thr Gln Leu Tyr Val Thr Asn Ser Val Gly Gly

965 970 975

Gly Gln Tyr Gln Glu Lys Tyr Ala Gly Gln Tyr Leu Glu Ala Leu Lys

980 985 990

Ala Lys Tyr Pro Asp Leu Phe Glu Gly Lys Ala Tyr Asp Tyr Trp Tyr

995 1000 1005

Lys Asn Tyr Ala Asn Asp Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Thr Leu Ser

1010 1015 1020

His Gly Asp Arg Glu Ser Ile Pro Ala Asp Val Ala Ile Lys Gln

1025 1030 1035

Trp Ser Ala Lys Tyr Met Asn Gly Thr Asn Val Leu Gly Asn Gly

1040 1045 1050

Met Gly Tyr Val Leu Lys Asp Trp His Asn Gly Gln Tyr Phe Lys

1055 1060 1065

Leu Asp Gly Asp Lys Ser Thr Leu Pro Gln Ile

1070 1075

<210> 2

<211> 3339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatggccc aagccggtca ctatatcacg aagaatggca acgactggca atacgatacg 60

aatggtgagc ttgcgaaagg cctgcgccag gacagtaatg gtaaattacg ctactttgac 120

ttgactacgg gcatccaggc aaagggtcaa ttcgtcacca tcggccagga gacgtattat 180

tttagtaagg accacgggga cgcacaatta ttgcctatgg taacagaagg gcattatgga 240

actatcactt taaaacaggg acaggataca aagactgcgt gggtttaccg tgaccaaaat 300

aatacaatcc tgaaaggact tcagaatatc aatggtacgc ttcaattctt tgatccatat 360

acgggagaac agcttaaggg cggtgttgct aaatatgacg ataaactttt ctactttgag 420

tcgggcaaag gtaacctggt gtcaactgta gctggtgact atcaagatgg acactatatt 480

tcgcaagatg gccagacgcg ttatgcagac aagcagaacc aactggttaa agggttggtc 540

actgtaaatg gagcgctgca gtacttcgac aacgcgacgg gaaaccaaat taaaaatcaa 600

caagtaatcg tcgatggtaa gacatactat ttcgacgaca aaggaaacgg agaatactta 660

tttaccaata ctttggacat gagtactaat gcgttttcca ctaaaaatgt ggcgttcaat 720

catgatagtt cgtcgtttga tcacaccgtg gacggatttt tgacagcaga tacatggtac 780

cgccctaaat caattcttgc taacggtaca acctggcgtg atagcactga taaggacatg 840

cgccctttga ttactgtctg gtggcccaat aagaacgtgc aagttaatta cttaaacttt 900

atgaaagcca acgggttgtt gacaactgcc gcgcaatata cattacattc tgaccaatac 960

gatttgaacc aagcggcgca ggatgtgcag gtcgcgattg aacgtcgcat cgcctctgaa 1020

cacgggactg attggctgca aaaattgctg tttgagagtc aaaacaacaa tccatcgttc 1080

gtgaagcaac agttcatttg gaacaaagat tcggagtatc acggaggcgg ggacgcctgg 1140

tttcagggtg ggtatttgaa gtacggaaac aatccgctga cacccaccac caactccgat 1200

tatcgccaac cagggaacgc tttcgacttt ctgttggcca acgacgtgga taatagcaat 1260

ccagttgtcc aagcagaaaa cctgaattgg ctgcactatc tgatgaattt tgggacaatc 1320

acagcaggcc aagatgatgc aaattttgac tccattcgca tcgacgctgt agatttcatc 1380

cataatgata ccattcaacg cacgtatgac tatttacgtg atgcttatca ggtgcaacag 1440

tcagaggcta aggcaaatca gcatattagc cttgtggagg cgggattaga tgctggtact 1500

agtacgattc acaatgacgc gcttattgag agtaatttac gtgaagcagc tacgttgagc 1560

ttaacgaatg aacccgggaa aaataagcca ttgacgaata tgcttcagga tgtggatggc 1620

gggacgctga tcacggatca cacgcaaaac agtaccgaaa accaggccac tcccaattac 1680

agcattattc atgctcatga caaaggagtg caggagaaag tcggtgctgc gattaccgac 1740

gccaccgggg cagactggac caactttact gacgaacagt taaaagccgg gttggagctg 1800

ttttataagg accaacgtgc gactaacaaa aaatataatt catacaatat tcccagtatt 1860

tatgcactga tgttgaccaa taaggataca gtaccacgta tgtattatgg tgatatgtat 1920

caagatgatg ggcaatatat ggcaaataaa agcatttatt atgatgcact ggtctccttg 1980

atgacggcgc gcaagtcata cgtatcggga ggtcaaacaa tgtccgtcga taaccacggt 2040

ttgcttaagt cagtacgttt cggcaaggac gctatgacgg cgaatgattt aggtacgagc 2100

gcaactcgca ccgagggcct gggagttatc attggcaacg acccgaaatt acaactgaat 2160

gacagtgata aggtcacttt ggacatggga gcggcgcaca aaaatcagaa ataccgtgct 2220

gtcatcctta ccacccgtga cgggctggcc acatttaact ctgatcaagc ccccactgct 2280

tggacgaatg accagggtac tttgactttc tccaatcagg aaattaatgg gcaggataat 2340

acacaaatcc gcggagtcgc taatccgcaa gtaagtggct acttagcggt atgggtcccc 2400

gtgggcgcgt cggacaacca ggacgcacgc accgcggcca ctaccacaga gaatcatgac 2460

ggtaaggttc ttcattcaaa cgccgctctt gactctaact taatctacga aggtttctcg 2520

aacttccagc ccaaggcaac cacgcacgac gaactgacta acgttgtgat cgccaaaaac 2580

gcggatgtgt tcaacaactg gggcatcacg tcattcgaaa tggcccctca ataccgctca 2640

tcgggggacc atactttcct ggattccact atcgacaacg gttatgcgtt cacggatcgc 2700

tacgatttgg gctttaatac cccaacaaaa tatggcacgg acggggattt acgcgcgact 2760

attcaggcgc tgcaccatgc caatatgcag gtcatggcgg acgtcgtgga taatcaagta 2820

tacaacttac ccggtaagga ggtcgtcagc gctactcgcg caggggttta tggtaatgac 2880

gatgccacag gatttggaac acaactgtac gtcacaaact cggtgggggg cggccaatac 2940

caagagaaat acgccgggca gtatcttgaa gcgcttaagg ctaaatatcc agacttgttc 3000

gaggggaagg cttatgacta ttggtacaaa aactacgcaa atgacggatc gaacccttat 3060

tatacgttga gccacggaga ccgcgagtct attcctgcag atgtcgcgat taaacagtgg 3120

tcagcaaagt acatgaacgg taccaacgtc cttggtaacg gcatgggata tgttttaaag 3180

gattggcaca atggacagta tttcaaactt gatggggaca aatccacatt gccccagatt 3240

aaaggggaat taaaacttga aggaaagccg atcccgaatc ctttattagg acttgatagt 3300

acccgtacag gccatcatca ccatcatcac taagaattc 3339

Claims

1.一种制备抗性糊精的方法，其特征在于，以淀粉或含有淀粉的物质为底物，利用4,6-α-葡萄糖基转移酶和分支蔗糖酶进行反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)；所述分支蔗糖酶来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉，或淀粉衍生物；所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉；所述薯类淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉等薯类淀粉；所述淀粉衍生物为麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉等淀粉衍生物；所述含有淀粉的物质为大米蛋白肽。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将液化后的反应液冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，添加普鲁兰酶底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶，35-40℃反应20-30h；

(3)调pH值5.0-6.0，加入蔗糖和分支蔗糖酶，40-45℃反应20-30h；

(4)步骤(3)反应结束后，将反应体系升温至90-95℃灭酶，并加入α-淀粉酶，反应20-40min；

(5)步骤(4)反应结束后，冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶，置于50-60℃反应30min；

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的添加量为2000-5000U/g底物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分支蔗糖酶的添加量为0.5-5U/mL底物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蔗糖在反应体系中的终浓度为2-40g/100mL。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述悬浊液的浓度为10-20g/100mL。

9.权利要求1-8任一项所述方法制备得到的抗性糊精。

10.权利要求1-8任一项所述方法，或权利要求9所述抗性糊精在食品、保健品或化妆品领域中的应用。