CN112708649B

CN112708649B - 一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法

Info

Publication number: CN112708649B
Application number: CN202110165418.8A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 王蕾; 陈晟; 易子玲; 魏贝贝
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-06
Filing date: 2021-02-06
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-02-06
Also published as: CN112708649A

Abstract

本发明公开了一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法，属于生物技术领域。本发明所将淀粉加入水或缓冲液中进行糊化和液化，得到液化淀粉溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至液化液中进行合成反应得到中间反应液；将α‑淀粉酶及α‑葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖部分得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖。本发明主要解决了原料使用成本高，操作工艺流程复杂，产品纯度低等问题，优势体现在包含非功能性成分含量低，无其他副产物。

Description

一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法

技术领域

本发明涉及一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法，属于生物技术领域。

背景技术

低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharide，IMO)又称为异麦芽低聚糖、异麦芽寡糖、分支低聚糖等，它属于淀粉糖的一种，主要成分为含有一个或多个α-1,6糖苷键的寡聚葡萄糖。IMO不易被人体消化酶利用，具有低血糖指数特征，可用于糖尿病患者的健康糖替代品。此外，IMO还可被肠道益生菌特别是双歧杆菌分解利用，产生短链脂肪酸，抑制肠道有害菌，因此作为一种重要的功能性低聚糖，IMO广泛应用于食品等行业。由于低聚异麦芽糖属于非消化性的一种低聚糖，并且，低聚异麦芽糖具有低血糖、预防龋齿、促进益生菌生长、提高人体免疫力等多种生理功能，因此，它被人体食用后，可以在促进肠道内双歧杆菌生长的同时，起到很好的益生作用。

低聚异麦芽糖的聚合度通常在2～10之间，主要功能成分是异麦芽糖、潘糖、异潘糖和异麦芽三糖。它是由日本研究者首先发现、开发商品化的生产技术并应用于食品开发当中，其广泛存在于马铃薯、大麦、小麦等农作物中，也存在于一些如清酒、酱油、蜂蜜此类发酵产品中，于1985年推入市场销售，我国在1994年也开始投入对低聚异麦芽糖的研发工作当中，并将其投入工业化生产进入我国市场，同时美国、欧洲等地的许多国家也都在大力开发低聚异麦芽糖的应用潜能。

目前，有关于低聚异麦芽糖的生产方法围绕生物酶转化主要有三大类，其中，第一类是以淀粉质原料进行加工生产，主要涉及步骤有原料的液化、糖化以及利用如α-葡萄糖苷酶类进行转苷反应制备低聚异麦芽糖，但是，利用此方法生产低聚异麦芽糖的得率低，后续产品分离成本高(具体可见参考专利CN1721545A低聚异麦芽糖糖化转苷生产工艺、CN104131051A一种低聚异麦芽糖的制备方法等)；第二类是以高浓度的葡萄糖溶液作为原料，通过聚合从而逆合制备低聚异麦芽糖，但是，此方法使用的原料成本较高，并且，由于现有的聚合酶效率较低，使用此方法生产低聚异麦芽糖的得率也较低(具体可见参考专利CN108546724A高纯度低聚异麦芽糖及其制备方法等)；第三类就是以蔗糖作为原料，使用葡聚糖蔗糖酶首先合成右旋糖酐类葡聚糖随后通过水解制备低聚异麦芽糖，但是，利用此方法生产低聚异麦芽糖需要蔗糖原料，相对于淀粉质原料来说成本较高，此外，该方法只能利用蔗糖中的葡萄糖部分，因此低聚异麦芽糖对蔗糖的理论得率不超过50％(具体可见参考专利WO2016029198A1PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ISOMALTOOLIGOSACCHARIDES等)。

上述缺陷均大大限制了低聚异麦芽糖市场的进一步发展。因此，急需找到一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供一种生产低聚异麦芽糖的方法，所述方法为将淀粉加入水或缓冲液中进行糊化和液化，得到液化淀粉溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至液化液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖；所述淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉；

或者，所述方法为将麦芽糊精加入水或缓冲液中的到糊精溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至糊精溶液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖。

所述合成酶是4,6-α-葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.-)、右旋糖酐糊精酶(EC2.4.1.2)中的一种或两种。所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述淀粉脱支酶能够催化水解淀粉链分支点处1,6-β-D-糖苷键的酶，可选用：普鲁兰酶、异淀粉酶。

所述合成反应的温度为25～55℃、pH为4～7.5、时间为12～24h。

在本发明的一种实施方式中，当合成酶为4,6-α-葡萄糖基转移酶时，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶在液化淀粉溶液中的添加量为100～5000U/g淀粉。

在本发明的一种实施方式中，当合成酶为右旋糖酐糊精酶时，所述右旋糖酐糊精酶在液化淀粉溶液中的添加量为5～100U/g麦芽糊精或淀粉。

在本发明的一种实施方式中，当淀粉脱支酶是普鲁兰酶时，普鲁兰酶在液化淀粉溶液中的添加量为10～100U/g麦芽糊精或淀粉。

所述α-淀粉酶是指1,4-D-葡聚糖水解酶，可选用高温淀粉酶。所述糖化酶是指α-1,4-葡萄糖水解酶。

所述去除未反应的底物及产物中的直链寡糖的反应过程中，以经第一步合成反应后的淀粉或麦芽糊精为底物时，使用高温淀粉酶和糖化酶进行处理；高温淀粉酶的反应温度和时间分别为90-100℃、30-60min，糖化酶的反应温度和时间分别为50-70℃反应30-60min。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶在中间反应液中的添加量为不少于1000U/g麦芽糊精或淀粉。

在本发明的一种实施方式中，将α-葡萄糖苷酶添加至中间反应液进行中间处理反应时，所述α-葡萄糖苷酶在中间反应液中的添加量为1～20U/g麦芽糊精或淀粉。

在本发明的一种实施方式中，将糖化酶添加至中间反应液进行反应时，所述α-葡萄糖苷酶在中间反应液中的添加量为不少于660U/g麦芽糊精或淀粉。

所述右旋糖酐水解酶包含右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11)和/或异麦芽三糖右旋糖酐酶(EC3.2.1.95)。所述异麦芽三糖右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述水解反应的温度为30～70℃、pH为3.5～7、时间为2～8h。

在本发明的一种实施方式中，当右旋糖酐水解酶为右旋糖酐酶时，所述右旋糖酐酶在处理后反应液中的添加量为5～500U/g麦芽糊精或淀粉。

在本发明的一种实施方式中，当右旋糖酐水解酶为异麦芽三糖右旋糖酐酶时，所述异麦芽三糖右旋糖酐酶在处理后反应液中的添加量为10～200U/g麦芽糊精或淀粉。

本发明还提供了利用上述方法制备得到的低聚异麦芽糖。

本发明上述制备低聚异麦芽糖的方法还可以进一步用于制备含有低聚异麦芽糖的产品，例如用于糖尿病患者的健康糖替代品，例如用于控制血糖、预防龋齿、促进益生菌生长、提高人体免疫力的产品。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖的方法，此方法为以廉价的淀粉或麦芽糊精为原料，将淀粉先经4,6-α-葡萄糖基转移酶和/或右旋糖酐糊精酶处理，再经右旋糖酐酶和/或异麦芽三糖右旋糖酐酶处理以生产低聚异麦芽糖，其中，α-4,6-葡聚糖基转移酶可以淀粉或淀粉降解物为底物合成具有连续或间断连续α-1,6-键的右旋糖酐类葡聚糖，右旋糖酐糊精酶可以淀粉或淀粉降解物为底物合成具有连续α-1,6-键的右旋糖酐，右旋糖酐酶可以水解具有连续α-1,6-键的葡聚糖并生成以异麦芽糖为主的具有不同聚合度低聚异麦芽糖混合物，异麦芽三糖右旋糖酐酶可以识别具有连续α-1,6-键葡聚糖的非还原端并水解生成异麦芽三糖；利用此方法生产低聚异麦芽糖的得率可高达73％。

(2)本发明提供了一种生产低聚异麦芽糖的方法，利用此方法制备得到的低聚异麦芽糖平均聚合度在2～3、IMO含量60～81％，因此，利用此方法制备低聚异麦芽糖分离纯化步骤简单。

(3)IMO中异麦芽三糖或潘糖等三糖含量是体现低聚异麦芽糖功能性的主要成分，其含量高低反映了产品质量的好坏，也影响产品的价格和应用前景。本发明提供了一种生产低聚异麦芽糖的方法，通过改变右旋糖酐酶和异麦芽三糖右旋糖酐酶的配比可调节IMO中三糖和二糖的比率，异麦芽三糖的比率最高可达90％，因此，利用此方法制备低聚异麦芽糖质量佳，应用前景大。

附图说明

图1合成步骤右旋糖酐产物钙柱HPLC检测图谱。其中，7.385min处及5.377min处出峰为三糖及以上有效右旋糖酐，8.550min处为异麦芽糖，10.588min处为葡萄糖，其他小峰及几乎无出峰处为体系中的杂质。

图2降解步骤氨基柱HPLC检测图谱，其中3.511min处为溶剂峰(乙腈)，9.854min处为异麦芽三糖出峰，其他小峰为杂质或极微量的寡糖。

图3合成步骤加入4,6-α-葡聚糖转移酶及普鲁兰酶时，使用1H NMR核磁氢谱对产生的右旋糖酐进行键型检测，5.4ppm左右为α-1,4，4.99ppm附近为α-1,6，二者比例为1：8.31。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli JM109及BL21(DE3)感受态细胞为实验室自制得到；下述实施例中涉及的；下述实施例中涉及的pET-20b(+)质粒、pET-15b(+)质粒合成自上海捷瑞公司；下述实施例中涉及的磷酸柠檬酸缓冲液按照表格配置；下述实施例中涉及的麦芽糊精购自菏泽天邦公司；下述实施例中涉及的木薯淀粉购自菏泽天邦公司；下述实施例中涉及的普鲁兰酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的高温α-淀粉酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的α-葡萄糖苷酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的糖化酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。

TB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉24g/L、甘油5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L、KH₂PO₄ 2.31g/L。

MD固体培养基：葡萄糖20g/L，琼脂糖20g/L，YNB 13.4g/L。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，YNB 13.4g/L，硫酸铵10g/L，K₂HPO₄·3H₂O3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L。

BMGY培养基：BMMY基础上添加甘油10g/L。

下述实施例中涉及的制备方法如下：

α-4,6-葡聚糖基转移酶的制备方法如下：

合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的α-4,6-葡聚糖基转移酶的基因。

使用限制性内切酶NdeⅠ和Hind III对合成得到的基因与pET-15b(+)质粒进行酶切后，使用T₄连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到重组质粒pET-15b(+)-gtfb；将重组质粒pET-15b(+)-gtfb转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中，得到重组大肠杆菌JM109/pET-15b(+)-gtfb；将重组大肠杆菌JM109/pET-15b(+)-gtfb划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液进行质粒提取；随后按相同操作转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-15b(+)-gtfb涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落，即稳定适合发酵的转化子；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量转接至TB液体培养基(含有0.4μmol/L氨苄青霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养2h后，于25℃恒温培养箱中继续诱导发酵12h，得到发酵液；将发酵液于4℃的条件下离心20min，所得上清液即为粗酶液。

异麦芽三糖右旋糖酐酶的制备方法如下：

合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的异麦芽三糖右旋糖酐酶的基因；使用限制性内切酶NcoⅠ和Hind III对合成得到的基因与pET-20b(+)质粒进行酶切后，使用T₄连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到重组质粒pET-20b(+)-imtd；将重组质粒pET-20b(+)-imtd转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中，得到重组大肠杆菌JM109/pET-20b(+)-imtd；将重组大肠杆菌JM109/pET-20b(+)-imtd涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液进行质粒提取；随后按相同操作转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-20b(+)-imtd涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落，即稳定适合发酵的转化子；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量转接至TB液体培养基(含有0.4μmol/L氨苄青霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养2h后，于25℃恒温培养箱中继续诱导发酵48h，得到发酵液；将发酵液于4℃的条件下离心20min，所得上清液即为粗酶液。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

反应液中右旋糖酐含量和得率的检测方法：

采用高效液相色谱(HPLC)法检测反应液中右旋糖酐的含量；使用安捷伦1260HPLC色谱仪，示差折光检测器，Waters Ca色谱柱，检测柱温为80℃，流动相是纯净水，以0.5mL/min的流速、进样量为10μL的样品进样检测；

其中，反应液中右旋糖酐得率的计算公式为：得率＝测得三糖及以上聚合度产物峰面积之和/产物总峰面积×100％。

反应液中异麦芽糖、葡萄糖、异麦芽三糖含量、得率及键型的检测方法：

采用高效液相色谱(HPLC)法检测反应液中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量；使用安捷伦1260HPLC色谱仪，示差折光检测器，Agilent ZORBAX NH2(4.6×250mm)色谱柱，检测柱温35℃，流动相是70％～78％乙腈，以0.8mL/min的流速、进样量为10μL的样品进样检测；

其中，反应液中异麦芽糖、葡萄糖、异麦芽三糖得率的计算公式为：得率＝各产物峰面积/标样峰面积×标样浓度/底物浓度×100％。

利用AVANCE III 400MHz数字NMR核磁共振光谱仪(Bruker BiospinInternational AG)测定抗性糊精的键型比例。准确称取30～40mg样品溶于500μL D2O(D,99.9％)中，漩涡震荡至彻底溶解后用移液器打入核磁管中进行测定，温度为60℃。将三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP0.03％)溶解在样品中作为内标。

α-4,6-葡聚糖基转移酶酶活的检测方法：碘液显色法检测：底物配制：1g/L直链淀粉母液：40mg的直链淀粉加入2mL的蒸馏水充分润湿，加入2mL的2M的NaOH溶液，漩涡振荡充分溶解；用时取500uL的直链淀粉母液加250uL的2M的HCl溶液，然后加入3250μL的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 7.0)配成0.125％的底物。

鲁戈碘液：0.26g碘与2.60g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配制，确保碘完全溶解)；用时取100μL的鲁戈碘液，加入50μL的2M的HCl溶液然后补水到26mL配成碘显色液。

反应时，取200uL的底物于1.5mL离心管中，35℃温浴10min。加入200μL的GtfB酶液35℃反应10min，反应结束后取200μL反应液加入到3800μL的碘显色液中显示5min，分光光度计测定660nm下的吸光度。对照用缓冲液代替酶液，空白取200μL的缓冲液加入到3800μL的碘显色液中显示5min。

α-4,6-葡聚糖基转移酶酶活的定义：在37℃条件下单位时间吸光值下降一个百分点定义为一个酶活单位。

酶活(U/mL)＝[100×D(稀释倍数)×(A对照-A实验)]/[10min×0.1mL×(A对照-A空白)]。

异麦芽三糖右旋糖酐酶酶活的检测方法：使用DNS法检测酶活，先配制1％的葡聚糖2万底物，取1ml于具塞试管中，随后加入0.9ml缓冲液置于40℃恒温水浴锅中温浴10min，随后加入0.1ml酶液，反应10min后加入3mlDNS终止反应。将具塞试管放入沸水持续煮沸7min后立即放入冰水混合物中冷却，随后向试管中补充10ml水至体系为15ml，混匀后在540nm下检测吸光值，依据吸光值计算得到酶活。

异麦芽三糖右旋糖酐酶酶活的定义：在40℃条件下，1min内酶水解葡聚糖底物生成的还原糖量为一个酶活力单位(1U)。

DE值(还原值)的检测方法(DNS比色法)：

具体可见参考文献：彦繁鹤,周金梅,吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发.36(02):126-128。

DE值(还原值)的定义：体系中还原糖的量占固形物总量的比值。

实施例1：低聚异麦芽糖的制备

具体步骤如下：

将麦芽糊精加入磷酸缓冲液中，加热溶解，得到浓度为15％的糊精溶液；将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)、普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g麦芽糊精、30U/g麦芽糊精和0.04g/L的添加量添加至糊精溶液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g麦芽糊精或淀粉的添加量添加至中间反应液，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g麦芽糊精或淀粉的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液和氯霉素(防止反应时感染杂菌)分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。

检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后，稀释4倍，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测水解反应液中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。

由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的占比为79％，检测图谱如图1；α-1,6键型占比为88.9％左右，核磁图谱如图3，水解反应液中低聚异麦芽糖得率为79％，并且，水解反应液中产物中有90％以上为异麦芽三糖。

实施例2：低聚异麦芽糖的制备

具体步骤如下：

将木薯淀粉加入适量磷酸缓冲液(50mM pH6.0)中配制为15％的悬浊液待糊化液化，搅拌至其成为悬浊液，加入10U/g淀粉的CGTase，置于85℃水浴锅中，当其全部粘稠时开始计时7min进行液化过程，随后煮沸灭酶10min。将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)、普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g淀粉、20U/g淀粉和0.04g/L的添加量添加至淀粉液化液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g淀粉添加量添加到中间反应液中，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g淀粉的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液和氯霉素分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。

检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后，稀释4倍，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法(钙柱，下同)检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法(钙柱，下同)检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。

由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的得率为72.4％，水解反应液中低聚异麦芽糖得率为77.3％，并且，其中异麦芽三糖占比为90％以上。

图3中5.4nnm左右为α-1,4，5.0nnm左右为α-1,6。

实施例3：低聚异麦芽糖的制备

具体步骤如下：将麦芽糊精加入磷酸缓冲液中，加热溶解，得到浓度为15％的糊精溶液；将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)，普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g麦芽糊精、30U/g麦芽糊精和0.04g/L的添加量添加至麦芽糊精溶液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g麦芽糊精添加量添加到中间反应液中，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g麦芽糊精的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQID NO:2)的粗酶液以及氯霉素分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。

检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后稀释，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。

由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的得率为75.33％，水解反应液中异麦芽三糖产率为78％。

对比例1

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液替换为商品右旋糖酐酶(购自夏盛公司)，且将商品右旋糖酐酶的添加量替换为5000U/g右旋糖酐，得到反应液4。

将反应液4煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。

由检测结果可知，水解反应液中异麦芽糖的得率为50％，几乎未检测到异麦芽三糖。

对比例2

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液替换为商品右旋糖酐酶(购自夏盛公司)，且将商品右旋糖酐酶的添加量替换为500U/g右旋糖酐，50℃下反应2h得到水解反应液。

由检测结果可知，反应液4中异麦芽糖的得率为21.5％、异麦芽三糖的得率为28.1％、葡萄糖的得率为1.6％，低聚异麦芽糖得率较低。

序列：

SEQ ID NO:1

QANDGHWYLFTADGTAASRVAKWAGTYYYFDPQTHLRVDDNYVQSQWGDWYMFGKDGRIATGLYKWDKNNQWYYFDPVTYLKVTNKWVDGNYYDEDGAQAISKLVTINNRLYYFDDQGKEISNQFRTIHGDKYYFGNDSAAVTGQQTIDGKVYKFSNYGYLLGNRYGKIENGKLNIYSLADNSLIKTVEAGPWENMAYSMDSNSINNIDGYISYTGWYRPYGTSQDGKTWYPTTVADWRPILMYVWPSKDVQVKFIQYFVNHGYENSNYGLTAGSVKDLSENTASIKLNEVAQNLRYVIEQHVVAAKSTSQLANDINNFITTIPELSKASELSVVNSYGYKPDNSGSVDDDQVIFVNNDSKNQKIGNTSYADSNYRLMNRTINNQNGDNNSDDSPELLVGNDIDNSNPVVQAENLNWEYFLLNYGKFMNYNPNGNFDGFRIDAADNIDADVLDQAAQLINSIYNTKGNQANANDHLIYNEGYHLGAANMLDRKSNPELYMDSGYFYTLENVLGRASDRDDINNLITNSIVNRQNDVSENVATPNWSFVTNHDQRKNLINQIVIDDHPGVADIMSDGYKAEYVNQAWKEFYADQARTDKKYTQYNLPAQYALLLTNKDTVPQVYYGDLYDETDQYMQNKSVYYDAITTLMKARKSYVSGGQSMIKINDHLLTSVRYGKGIIDGNVSMTDILGRNSGIAVVVGNDAQMANQTISINMGKAHANQAYKQLLGTIDSGLTSSDTTIYHTDSNGVLNVTVKGYSNPYVSGYLGVWVPLNGGANITTKASEVTNQSDKTYSSNAALDSHVIYEDFSLFQPEPTSKAEHAYNIIADNASLFNELGITDFWMAPAYTPFNTSRYNEGYSMTDRYNLGTEANLTKYGSGEELSNAIAALHDAGLKVQEDLVMNQMIGFSGQEAVTVTRTDGHAKQLTVDGKTFANQIYFAYTRGGGEGQKNYGGKYLDELQKKYPELFTTKAVSTGVAPDPSVHITEWSAKYQNGTSLQNIGIGLAVKLANGDYAYLNDSNNKAFNTTLPETMSSADYYANIEDD

SEQ ID NO:2

NPTKPVEDAPVTADVGNLHTWWHDNAVYNTDSPTENGEVRRSSFYDVQVAQAHQPDKFFDSFAYMSIPRSGKGKVGYTKEDGAEFSSEANLSMSWSSFEYAKDVWVDVSLKTGQTISSADEVQIRPSSYDFEKKLVDEDTIRIKVPYSDAGYRFSVEFDPQLYTSYNDMSGNSGKLTTVAEGNRPIHTEPMNSMMIFAEPKLQGEEEKRLIPNPSSGSIHYPEEGEVKDLNTVTEEIIYFKPGTYHMGSDYHAVLPPNVKWVYLAPGAYVKGAFRFFHDNQAQYKVTGYGVLSGEQYVYEADTANNYNALSGASNCHVTCVKMLQFESSNIGQQLDLQGVTINEPPYHSFVVYAHEGEKEIGVENFRMNVENYKQVGSWYWQTDGIELYQGGTMKNTFFNANDDVLKMYHSDVTIDNTVIWKNENGPVIQWGWTPRNIDNVNVTDTTVIHNRMYWKDPKYNTCILNSSSHWEDMGSTAKADPNTTVKNMRFENITVEGMTNCAMRIYALSNTENIHVKNLSIDSWNGLDWTSQVSHLKRYTNSAGEKVTIGNEIPDGNGLALENYSVGGEIIEKSGDNWNDYKLGRLGFDGENWDSWNAWKSTP

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法

<130> BAA200816A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1046

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Ala Asn Asp Gly His Trp Tyr Leu Phe Thr Ala Asp Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ala Ser Arg Val Ala Lys Trp Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Pro

20 25 30

Gln Thr His Leu Arg Val Asp Asp Asn Tyr Val Gln Ser Gln Trp Gly

35 40 45

Asp Trp Tyr Met Phe Gly Lys Asp Gly Arg Ile Ala Thr Gly Leu Tyr

50 55 60

Lys Trp Asp Lys Asn Asn Gln Trp Tyr Tyr Phe Asp Pro Val Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Val Thr Asn Lys Trp Val Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Glu Asp

85 90 95

Gly Ala Gln Ala Ile Ser Lys Leu Val Thr Ile Asn Asn Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Phe Asp Asp Gln Gly Lys Glu Ile Ser Asn Gln Phe Arg Thr Ile

115 120 125

His Gly Asp Lys Tyr Tyr Phe Gly Asn Asp Ser Ala Ala Val Thr Gly

130 135 140

Gln Gln Thr Ile Asp Gly Lys Val Tyr Lys Phe Ser Asn Tyr Gly Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Gly Asn Arg Tyr Gly Lys Ile Glu Asn Gly Lys Leu Asn Ile

165 170 175

Tyr Ser Leu Ala Asp Asn Ser Leu Ile Lys Thr Val Glu Ala Gly Pro

180 185 190

Trp Glu Asn Met Ala Tyr Ser Met Asp Ser Asn Ser Ile Asn Asn Ile

195 200 205

Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr Ser

210 215 220

Gln Asp Gly Lys Thr Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala Asp Trp Arg Pro

225 230 235 240

Ile Leu Met Tyr Val Trp Pro Ser Lys Asp Val Gln Val Lys Phe Ile

245 250 255

Gln Tyr Phe Val Asn His Gly Tyr Glu Asn Ser Asn Tyr Gly Leu Thr

260 265 270

Ala Gly Ser Val Lys Asp Leu Ser Glu Asn Thr Ala Ser Ile Lys Leu

275 280 285

Asn Glu Val Ala Gln Asn Leu Arg Tyr Val Ile Glu Gln His Val Val

290 295 300

Ala Ala Lys Ser Thr Ser Gln Leu Ala Asn Asp Ile Asn Asn Phe Ile

305 310 315 320

Thr Thr Ile Pro Glu Leu Ser Lys Ala Ser Glu Leu Ser Val Val Asn

325 330 335

Ser Tyr Gly Tyr Lys Pro Asp Asn Ser Gly Ser Val Asp Asp Asp Gln

340 345 350

Val Ile Phe Val Asn Asn Asp Ser Lys Asn Gln Lys Ile Gly Asn Thr

355 360 365

Ser Tyr Ala Asp Ser Asn Tyr Arg Leu Met Asn Arg Thr Ile Asn Asn

370 375 380

Gln Asn Gly Asp Asn Asn Ser Asp Asp Ser Pro Glu Leu Leu Val Gly

385 390 395 400

Asn Asp Ile Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu Asn

405 410 415

Trp Glu Tyr Phe Leu Leu Asn Tyr Gly Lys Phe Met Asn Tyr Asn Pro

420 425 430

Asn Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Asp Asn Ile Asp

435 440 445

Ala Asp Val Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ser Ile Tyr Asn

450 455 460

Thr Lys Gly Asn Gln Ala Asn Ala Asn Asp His Leu Ile Tyr Asn Glu

465 470 475 480

Gly Tyr His Leu Gly Ala Ala Asn Met Leu Asp Arg Lys Ser Asn Pro

485 490 495

Glu Leu Tyr Met Asp Ser Gly Tyr Phe Tyr Thr Leu Glu Asn Val Leu

500 505 510

Gly Arg Ala Ser Asp Arg Asp Asp Ile Asn Asn Leu Ile Thr Asn Ser

515 520 525

Ile Val Asn Arg Gln Asn Asp Val Ser Glu Asn Val Ala Thr Pro Asn

530 535 540

Trp Ser Phe Val Thr Asn His Asp Gln Arg Lys Asn Leu Ile Asn Gln

545 550 555 560

Ile Val Ile Asp Asp His Pro Gly Val Ala Asp Ile Met Ser Asp Gly

565 570 575

Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Asn Gln Ala Trp Lys Glu Phe Tyr Ala Asp

580 585 590

Gln Ala Arg Thr Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Leu Pro Ala Gln

595 600 605

Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Gln Val Tyr Tyr

610 615 620

Gly Asp Leu Tyr Asp Glu Thr Asp Gln Tyr Met Gln Asn Lys Ser Val

625 630 635 640

Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala Arg Lys Ser Tyr Val

645 650 655

Ser Gly Gly Gln Ser Met Ile Lys Ile Asn Asp His Leu Leu Thr Ser

660 665 670

Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ile Ile Asp Gly Asn Val Ser Met Thr Asp

675 680 685

Ile Leu Gly Arg Asn Ser Gly Ile Ala Val Val Val Gly Asn Asp Ala

690 695 700

Gln Met Ala Asn Gln Thr Ile Ser Ile Asn Met Gly Lys Ala His Ala

705 710 715 720

Asn Gln Ala Tyr Lys Gln Leu Leu Gly Thr Ile Asp Ser Gly Leu Thr

725 730 735

Ser Ser Asp Thr Thr Ile Tyr His Thr Asp Ser Asn Gly Val Leu Asn

740 745 750

Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn Pro Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Gly

755 760 765

Val Trp Val Pro Leu Asn Gly Gly Ala Asn Ile Thr Thr Lys Ala Ser

770 775 780

Glu Val Thr Asn Gln Ser Asp Lys Thr Tyr Ser Ser Asn Ala Ala Leu

785 790 795 800

Asp Ser His Val Ile Tyr Glu Asp Phe Ser Leu Phe Gln Pro Glu Pro

805 810 815

Thr Ser Lys Ala Glu His Ala Tyr Asn Ile Ile Ala Asp Asn Ala Ser

820 825 830

Leu Phe Asn Glu Leu Gly Ile Thr Asp Phe Trp Met Ala Pro Ala Tyr

835 840 845

Thr Pro Phe Asn Thr Ser Arg Tyr Asn Glu Gly Tyr Ser Met Thr Asp

850 855 860

Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Glu Ala Asn Leu Thr Lys Tyr Gly Ser Gly

865 870 875 880

Glu Glu Leu Ser Asn Ala Ile Ala Ala Leu His Asp Ala Gly Leu Lys

885 890 895

Val Gln Glu Asp Leu Val Met Asn Gln Met Ile Gly Phe Ser Gly Gln

900 905 910

Glu Ala Val Thr Val Thr Arg Thr Asp Gly His Ala Lys Gln Leu Thr

915 920 925

Val Asp Gly Lys Thr Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Phe Ala Tyr Thr Arg

930 935 940

Gly Gly Gly Glu Gly Gln Lys Asn Tyr Gly Gly Lys Tyr Leu Asp Glu

945 950 955 960

Leu Gln Lys Lys Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Thr Lys Ala Val Ser Thr

965 970 975

Gly Val Ala Pro Asp Pro Ser Val His Ile Thr Glu Trp Ser Ala Lys

980 985 990

Tyr Gln Asn Gly Thr Ser Leu Gln Asn Ile Gly Ile Gly Leu Ala Val

995 1000 1005

Lys Leu Ala Asn Gly Asp Tyr Ala Tyr Leu Asn Asp Ser Asn Asn

1010 1015 1020

Lys Ala Phe Asn Thr Thr Leu Pro Glu Thr Met Ser Ser Ala Asp

1025 1030 1035

Tyr Tyr Ala Asn Ile Glu Asp Asp

1040 1045

<210> 2

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asn Pro Thr Lys Pro Val Glu Asp Ala Pro Val Thr Ala Asp Val Gly

1 5 10 15

Asn Leu His Thr Trp Trp His Asp Asn Ala Val Tyr Asn Thr Asp Ser

20 25 30

Pro Thr Glu Asn Gly Glu Val Arg Arg Ser Ser Phe Tyr Asp Val Gln

35 40 45

Val Ala Gln Ala His Gln Pro Asp Lys Phe Phe Asp Ser Phe Ala Tyr

50 55 60

Met Ser Ile Pro Arg Ser Gly Lys Gly Lys Val Gly Tyr Thr Lys Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ala Glu Phe Ser Ser Glu Ala Asn Leu Ser Met Ser Trp Ser

85 90 95

Ser Phe Glu Tyr Ala Lys Asp Val Trp Val Asp Val Ser Leu Lys Thr

100 105 110

Gly Gln Thr Ile Ser Ser Ala Asp Glu Val Gln Ile Arg Pro Ser Ser

115 120 125

Tyr Asp Phe Glu Lys Lys Leu Val Asp Glu Asp Thr Ile Arg Ile Lys

130 135 140

Val Pro Tyr Ser Asp Ala Gly Tyr Arg Phe Ser Val Glu Phe Asp Pro

145 150 155 160

Gln Leu Tyr Thr Ser Tyr Asn Asp Met Ser Gly Asn Ser Gly Lys Leu

165 170 175

Thr Thr Val Ala Glu Gly Asn Arg Pro Ile His Thr Glu Pro Met Asn

180 185 190

Ser Met Met Ile Phe Ala Glu Pro Lys Leu Gln Gly Glu Glu Glu Lys

195 200 205

Arg Leu Ile Pro Asn Pro Ser Ser Gly Ser Ile His Tyr Pro Glu Glu

210 215 220

Gly Glu Val Lys Asp Leu Asn Thr Val Thr Glu Glu Ile Ile Tyr Phe

225 230 235 240

Lys Pro Gly Thr Tyr His Met Gly Ser Asp Tyr His Ala Val Leu Pro

245 250 255

Pro Asn Val Lys Trp Val Tyr Leu Ala Pro Gly Ala Tyr Val Lys Gly

260 265 270

Ala Phe Arg Phe Phe His Asp Asn Gln Ala Gln Tyr Lys Val Thr Gly

275 280 285

Tyr Gly Val Leu Ser Gly Glu Gln Tyr Val Tyr Glu Ala Asp Thr Ala

290 295 300

Asn Asn Tyr Asn Ala Leu Ser Gly Ala Ser Asn Cys His Val Thr Cys

305 310 315 320

Val Lys Met Leu Gln Phe Glu Ser Ser Asn Ile Gly Gln Gln Leu Asp

325 330 335

Leu Gln Gly Val Thr Ile Asn Glu Pro Pro Tyr His Ser Phe Val Val

340 345 350

Tyr Ala His Glu Gly Glu Lys Glu Ile Gly Val Glu Asn Phe Arg Met

355 360 365

Asn Val Glu Asn Tyr Lys Gln Val Gly Ser Trp Tyr Trp Gln Thr Asp

370 375 380

Gly Ile Glu Leu Tyr Gln Gly Gly Thr Met Lys Asn Thr Phe Phe Asn

385 390 395 400

Ala Asn Asp Asp Val Leu Lys Met Tyr His Ser Asp Val Thr Ile Asp

405 410 415

Asn Thr Val Ile Trp Lys Asn Glu Asn Gly Pro Val Ile Gln Trp Gly

420 425 430

Trp Thr Pro Arg Asn Ile Asp Asn Val Asn Val Thr Asp Thr Thr Val

435 440 445

Ile His Asn Arg Met Tyr Trp Lys Asp Pro Lys Tyr Asn Thr Cys Ile

450 455 460

Leu Asn Ser Ser Ser His Trp Glu Asp Met Gly Ser Thr Ala Lys Ala

465 470 475 480

Asp Pro Asn Thr Thr Val Lys Asn Met Arg Phe Glu Asn Ile Thr Val

485 490 495

Glu Gly Met Thr Asn Cys Ala Met Arg Ile Tyr Ala Leu Ser Asn Thr

500 505 510

Glu Asn Ile His Val Lys Asn Leu Ser Ile Asp Ser Trp Asn Gly Leu

515 520 525

Asp Trp Thr Ser Gln Val Ser His Leu Lys Arg Tyr Thr Asn Ser Ala

530 535 540

Gly Glu Lys Val Thr Ile Gly Asn Glu Ile Pro Asp Gly Asn Gly Leu

545 550 555 560

Ala Leu Glu Asn Tyr Ser Val Gly Gly Glu Ile Ile Glu Lys Ser Gly

565 570 575

Asp Asn Trp Asn Asp Tyr Lys Leu Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Glu

580 585 590

Asn Trp Asp Ser Trp Asn Ala Trp Lys Ser Thr Pro

595 600

Claims

1.一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，以淀粉质类原料为底物，经合成酶在淀粉脱支酶的辅助下进行合成反应合成右旋糖酐类葡聚糖；经α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶处理未反应的底物及产物中的直链寡糖后，再经右旋糖酐水解酶水解合成步骤的产物得到低聚异麦芽糖；

所述合成酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的4,6-α-葡萄糖基转移酶，所述右旋糖酐水解酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的异麦芽三糖右旋糖酐酶。

2.根据权利要求1所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，

所述方法为将淀粉加入水或缓冲液中进行糊化和液化，得到液化淀粉溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至液化液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液进行去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至中间处理后反应液进行水解反应得到水解反应液得到低聚异麦芽糖。

3.根据权利要求1所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，

所述方法为将麦芽糊精加入水或缓冲液中的到糊精溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至糊精溶液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液进行去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至中间处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖。

4.如权利要求2所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述合成反应的温度为25~55℃、pH为4~7.5、时间为12~24 h；

4,6-α-葡萄糖基转移酶在液化淀粉溶液中的添加量为100~5000 U/g淀粉；

当淀粉脱支酶是普鲁兰酶时，普鲁兰酶在液化淀粉溶液中的添加量为10~100 U/g麦芽糊精或淀粉。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，经α-淀粉酶及糖化酶处理未反应的底物及产物中的直链寡糖时，α-淀粉酶的反应温度和时间分别为90-100℃、30-60min，糖化酶的反应温度和时间分别为50-70℃、30-60min；

α-淀粉酶的添加量为不少于1000 U/g麦芽糊精或淀粉，添加糖化酶时，糖化酶的添加量为不少于660 U/g麦芽糊精或淀粉。

6.如权利要求1-4任一项所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，右旋糖酐水解酶的水解反应的温度为30~70℃、pH为3.5~7、时间为2~8 h；

异麦芽三糖右旋糖酐酶在处理后反应液中的添加量为10~200U/g麦芽糊精或淀粉。

7.如权利要求1所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述低聚异麦芽糖的平均聚合度在2~3、IMO含量60~81%。

8.如权利要求1所述的一种生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述淀粉选自绿豆淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、菱角淀粉、莲藕淀粉，荸荠淀粉、玉米淀粉、番薯粉、葛粉、木薯粉。