CN111304270B

CN111304270B - 一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法

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Publication number: CN111304270B
Application number: CN202010111929.7A
Authority: CN
Inventors: 江波; 张涛; 郑露华; 姚小琳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-02-24
Also published as: WO2021169096A1; US20210292800A1; CN111304270A

Abstract

本发明公开了一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种可用于生产聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精的方法，利用本发明的方法反应2～6h，即可使反应液中麦芽五糖基海藻糖的含量高达57.2～77.3％，占反应液中麦芽糊精总量的50～90％。利用本发明的方法制备得到的麦芽糊精中，非还原性低聚合度麦芽糊精仅有麦芽五糖基海藻糖一种，且非还原性低聚合度麦芽糊精的含量可达麦芽糊精总量的50～90％，因此，利用本发明的方法制备非还原性低聚合度麦芽糊精仅需过滤，无需多余的分离纯化步骤，即可获得纯度很高的非还原性低聚合度麦芽糊精，生产成本较低。

Description

一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法

技术领域

本发明涉及一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法，属于生物技术领域。

背景技术

麦芽糊精是指以淀粉为原料，将淀粉经酸法或酶法低程度水解得到的DE值在20％以下的产品。其主要成分为聚合度(即DP值)在10以上的糊精和聚合度在10以下的低聚糖。

由于麦芽糊精可作为增稠剂、乳化剂或稳定剂等配料添加到食品中，可作为赋形剂、填充剂等配料添加到药品中，且可作为优良载体添加到日化产品中，因此，麦芽糊精在食品、医药和日化等领域均具有重要的应用，这也意味着麦芽糊精具有很大的市场。

但是，受到现有麦芽糊精制备方法的局限，目前生产得到的麦芽糊精中，高聚合度的麦芽糊精(一般为DE值在4％～12％的麦芽糊精)含有较多的直链糊精且DP值分布不均匀，添加了此类麦芽糊精的溶液放置一段时间后容易出现沉淀(具体可见参考文献：李才明,李阳,顾正彪,洪雁,程力,李兆丰.麦芽糊精的支化修饰及其特性研究进展[J].中国食品学报.2018(10):1-8)，低聚合度的麦芽糊精(一般为DE值在13％～20％的麦芽糊精)则具有很高的还原能力，易与其他物质发生反应，并且，当其与氨基酸或蛋白质共存时易产生美拉德反应，降低了含有此类麦芽糊精的产品的质量。

另外，受到现有麦芽糊精制备方法的局限，目前生产得到的麦芽糊精均是多种物质(包括葡萄糖、麦芽糖、低聚糖和多聚糖等)的混合物，这大大提高了聚合度均一的麦芽糊精产品的分离纯化难度，进而增加了聚合度均一的麦芽糊精产品的分离纯化成本。

上述缺陷均大大限制了麦芽糊精市场的进一步发展。因此，急需找到一种成本低的可用于生产聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低的可用于生产聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产麦芽糊精的方法，所述方法为先将环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)、环糊精降解酶(CDase)和/或麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)加入淀粉和/或环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，然后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将淀粉加入水或缓冲液中，得到淀粉溶液，然后将淀粉溶液进行糊化，得到糊化淀粉溶液，再将环糊精葡萄糖基转移酶、环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入糊化淀粉溶液中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精；

或者，所述方法为先将环糊精加入水或缓冲液中，得到环糊精溶液，然后将环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精；

或者，所述方法为先将淀粉加入水或缓冲液中，得到淀粉溶液，然后将淀粉溶液进行糊化，得到糊化淀粉溶液，再将环糊精葡萄糖基转移酶和环糊精降解酶加入糊化淀粉溶液中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精；

或者，所述方法为先将环糊精加入水或缓冲液中，得到环糊精溶液，然后将环糊精降解酶加入环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述环糊精降解酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶在糊化淀粉溶液中的添加量为6～10U/g_淀粉；所述环糊精降解酶在糊化淀粉溶液中的添加量为3～7U/g_淀粉；所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶在糊化淀粉溶液中的添加量为10～100U/g_淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精降解酶在环糊精溶液中的添加量为0.5～5U/g_环糊精；所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶在环糊精溶液中的添加量为10～100U/g_环糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为25～65℃、pH为5.0～8.5。

在本发明的一种实施方式中，所述糊化为将淀粉溶液在沸水浴中以100～200r/min的速度搅拌20～40min。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为玉米淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉和/或小麦淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精为还原性麦芽糊精和/或非还原性麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将淀粉加入水或缓冲液中，得到淀粉溶液，然后将淀粉溶液进行糊化，得到糊化淀粉溶液，再将环糊精葡萄糖基转移酶、环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入糊化淀粉溶液中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得非还原性麦芽糊精；

或者，所述方法为先将环糊精加入水或缓冲液中，得到环糊精溶液，然后将环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得非还原性麦芽糊精；

或者，所述方法为先将淀粉加入水或缓冲液中，得到淀粉溶液，然后将淀粉溶液进行糊化，得到糊化淀粉溶液，再将环糊精葡萄糖基转移酶和环糊精降解酶加入糊化淀粉溶液中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得还原性麦芽糊精；

或者，所述方法为先将环糊精加入水或缓冲液中，得到环糊精溶液，然后将环糊精降解酶加入环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得还原性麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述非还原性麦芽糊精为麦芽四糖基海藻糖(4-O-α-maltopentaosylα-D-glucoside)、麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltohexaosylα-D-glucoside)和/或麦芽六糖基海藻糖(4-O-α-maltoheptosylα-D-glucoside)。

在本发明的一种实施方式中，所述非还原性麦芽糊精为麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltohexaosylα-D-glucoside)。

本发明还提供了利用方法制备得到的麦芽糊精。

本发明还提供了上述方法在制备麦芽糊精、含有麦芽糊精的食品、含有麦芽糊精的药品或含有麦芽糊精的日化产品中的应用。

本发明还提供了环糊精葡萄糖基转移酶、环糊精降解酶和/或麦芽寡糖基海藻糖合成酶在生产非还原性麦芽糊精中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可用于生产聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精的方法，利用本发明的方法反应2～6h，即可使反应液中麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltohexaosylα-D-glucoside)的含量高达57.2～77.3％，占反应液中麦芽糊精总量的50～90％。

(2)利用本发明的方法制备得到的麦芽糊精中，非还原性低聚合度麦芽糊精仅有麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltohexaosylα-D-glucoside)一种，并且，利用本发明的方法制备得到的麦芽糊精中，非还原性低聚合度麦芽糊精的含量可达麦芽糊精总量的50～90％，因此，利用本发明的方法制备非还原性低聚合度麦芽糊精仅需过滤，无需多余的分离纯化步骤，即可获得纯度很高的非还原性低聚合度麦芽糊精，生产成本较低。

(3)本发明提供了一种可用于生产还原性低聚合度麦芽糊精的方法，利用本发明的方法反应2～6h，即可使反应液中还原性麦芽糊精的含量高达19.1～44.9％。

附图说明

图1：标准品的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图2：反应液4中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图3：反应液11中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图4：反应液13中产物的液相分布图(65％乙腈浓度)。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、E.coli BL21(DE3)购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pET-28a(+)载体购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的玉米淀粉购自上海阿拉丁有限公司；下述实施例中涉及的β-环糊精购自上海生工有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

下述实施例中涉及的制备方法如下：

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的制备方法如下：

合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)；使用限制性内切酶HindⅢ和Nde I对合成得到的基因与pET-28a(+)载体进行酶切后，使用T₄连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到连接产物；将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pET-28a(+)-CGTase；将获得的重组质粒pET-28a(+)-CGTase导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CGTase；将获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CGTase划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养12h，获得发酵液；将发酵液离心，获得发酵上清液，此发酵上清液即为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液，命名为CGTase。

环糊精降解酶(CDase)的制备方法如下：

合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的环糊精降解酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)；参照制备CGTase的方法获得氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的环糊精降解酶的粗酶液，命名为CDase。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)的制备方法如下：

合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)；参照制备CGTase的方法获得氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液，命名为MTSase。

糊化淀粉溶液的制备方法如下：

将玉米淀粉加入浓度为20mM的磷酸钠缓冲液中，得到玉米淀粉浓度为30g/L的玉米淀粉溶液；将玉米淀粉溶液在沸水浴中以150r/min的速度搅拌30min，得到糊化淀粉溶液。

环糊精溶液的制备方法如下：

将β-环糊精加入浓度为20mM的磷酸钠缓冲液中，得到β-环糊精浓度为20g/L的环糊精溶液。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

反应液中葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精含量的检测方法：

采用高效液相色谱(HPLC)法；

色谱柱：氨基柱(Shodex NH2P-50 4E)；

流动相：乙腈：水＝60～70％(v/v)；

标准品：称取葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)、麦芽三糖(DP3)、麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)、麦芽六糖(DP6)、麦芽七糖(DP7)、α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)或γ-环糊精(γ-CD)(纯度＝99.5％)的标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50mL，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用(标准品的液相分布见图1)；

样品制备：将反应结束的反应液12000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用；

试样的测定：先用流动相以1mL/min的流速冲洗管路30min，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池60min，走基线，待基线走稳后，将标准溶液和制备好的试样分别进样10μL；根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以内标法计算糖组分的比例。

环糊精葡萄糖基转移酶酶活的检测方法：

在250μL浓度为30g/L的糊化淀粉溶液中加入10μL CGTase，然后用20mM磷酸缓冲液补足至500μL，得到反应体系；将反应体系在温度为55℃、pH为7.0的条件下反应10min后煮沸灭酶后，通过液相检测环糊精的生成量，得到CGTase的环糊精葡萄糖基转移酶酶活。

环糊精葡萄糖基转移酶酶活的定义：在温度为55℃、pH为7.0的条件下，1min内作用于糊化淀粉生成1μmol环糊精所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

环糊精降解酶酶活的检测方法：

在250μL浓度为20g/L的β-环糊精溶液中加入10μL CDase，然后用20mM磷酸缓冲液补足至500μL，得到反应体系；将反应体系在温度为35℃、pH为7.5的条件下反应30min后煮沸灭酶后，通过液相检测麦芽七糖的生成量，得到CDase的环糊精葡萄糖基转移酶酶活。

环糊精降解酶酶活的定义：在温度为35℃、pH为7.5的条件下，1min内作用于β-环糊精生成1μmol麦芽七糖所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活的检测方法：

在250μL浓度为20g/L的麦芽糊精溶液中加入5μL MTSase，然后用20mM磷酸缓冲液补足至500μL，得到反应体系；将反应体系在温度为45℃、pH为7.0的条件下反应10min后煮沸灭酶后，通过DNS法检测反应液中还原力的下降量，得到MTSase的麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活的定义：在温度为45℃、pH为7.0的条件下，1min内作用于麦芽糊精转化1μmolα-1,4糖苷键所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

反应液DE值(还原值)的检测方法(DNS比色法)：

具体可见参考文献：彦繁鹤,周金梅,吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发.36(02):126-128。

DE值(还原值)的定义：体系中还原糖的量占固形物总量的比值。

实施例1：麦芽糊精的制备(单酶)

具体步骤如下：

方案一：将CGTase以7U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为55℃、pH为7.0的条件下酶反应3h，获得反应液1。

方案二：将CDase以5U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为35℃、pH为7.5的条件下酶反应4h，获得反应液2。

方案三：将MTSase以45U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得酶反应3。

方案四：将CDase以1.5U/g_环糊精的添加量加入β-环糊精溶液中，于温度为35℃、pH为7.5的条件下酶反应4h，获得反应液4。

方案五：将MTSase以15U/g_环糊精的添加量加入β-环糊精溶液中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得酶反应5。

检测反应液1～5中麦芽糊精的聚合度分布，非还原性麦芽七糖(即麦芽六糖基海藻糖，4-O-α-maltoheptosylα-D-glucoside)用NDP7表示(反应液1～5中麦芽糊精的聚合度分布见表1，反应液4中产物的液相分布见图2)。

由表1可知，CGTase、CDase和MTSase无法单独作用于淀粉生成聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精，CDase和MTSase也无法单独作用于环糊精生成聚合度均一的非还原性低聚合度麦芽糊精，其中，由CDase反应获得的反应液中还原性低聚合度麦芽糊精的含量最高且聚合度最均一。

表1反应液1～5中麦芽糊精的聚合度分布

实施例2：麦芽糊精的制备(酶耦合+一步法)

具体步骤如下：

方案一：将CGTase、CDase分别以7U/g_淀粉和5U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为40℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得反应液6。

方案二：将CDase、MTSase分别以1.5U/g_环糊精和15U/g_环糊精的添加量加入β-环糊精溶液中，于温度为40℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得反应液7。

方案三：将CGTase、CDase、MTSase分别以7U/g_淀粉、5U/g_淀粉和45U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为40℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得反应液8。

检测反应液6～8中麦芽糊精的聚合度分布(反应液6～8中麦芽糊精的聚合度分布见表2)。

由表2可知，MTSase是生成非还原性低聚合度麦芽糊精的关键，若无MTSase，则无法生成非还原性低聚合度麦芽糊精；并且，由表2可知，以环糊精为底物，利用CDase和MTSase一步法生成非还原性低聚合度麦芽糊精的产量和均一性都很高。

表2反应液6～8中麦芽糊精的聚合度分布

实施例3：麦芽糊精的制备(酶耦合+分步法)

具体步骤如下：

方案一：先将CGTase以7U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为55℃、pH为7.0的条件下酶反应3h，然后将CDase以5U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为35℃、pH为7.5的条件下酶反应4h，获得反应液9。

方案二：先将CGTase以7U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为55℃、pH为7.0的条件下酶反应3h，然后将CDase以5U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为35℃、pH为7.5的条件下酶反应4h，最后将MTSase以45U/g_淀粉的添加量加入糊化淀粉溶液中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得反应液10。

方案三：先将CDase以1.5U/g_环糊精的添加量加入β-环糊精溶液中，于温度为35℃、pH为7.5的条件下酶反应4h，然后将MTSase以15U/g_环糊精的添加量加入β-环糊精溶液中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应4h，获得反应液11。

检测反应液9～11中麦芽糊精的聚合度分布(反应液9～11中麦芽糊精的聚合度分布见表3，反应液11中产物的液相分布见图3)。

由表3可知，MTSase是生成非还原性低聚合度麦芽糊精的关键，若无MTSase，则无法生成非还原性低聚合度麦芽糊精；并且，由表3可知，利用分步法制备非还原性低聚合度麦芽糊精的产量和均一性远不如实施例2中的方案二(一步法)。

以淀粉为底物时，只有当双酶或三酶串联反应时才能生成单一聚合度的麦芽糊精。

表3检测反应液9～11中麦芽糊精的聚合度分布

实施例4：酶添加量对麦芽糊精产率的影响

在实施例2的方案二的基础上，将CDase的添加量分别替换为0.5U/g_环糊精、1.5U/g_环糊精、2.5U/g_环糊精、3.5U/g_环糊精、4.5U/g_环糊精，获得反应液12～16。

检测反应液12～16中麦芽糊精的聚合度分布(检测结果见表4，反应液13中产物的液相分布见图4)。

由表4可知，当CDase的添加量为1.5U/g_环糊精的添加量时，反应液中低聚合度非还原性麦芽糊精的含量最高且聚合度最均一。

表4检测反应液12～16中麦芽糊精的聚合度分布

实施例5：酶反应时间对麦芽糊精产率的影响

在实施例2的方案二的基础上，将反应时间分别替换为30min，1h，2h，4h，6h获得反应液17～21。

检测反应液17～21中麦芽糊精的聚合度分布(检测结果见表5)。

由表5可知，当反应进行到4h时，反应液中低聚合度非还原性麦芽糊精的含量最高且聚合度最均一。

表5检测反应液17～21中麦芽糊精的聚合度分布

实施例6：非还原性麦芽七糖DE值的测定

取实施例2中的反应液7，将反应液7通过半制备液相得到纯度92％(v/v)的NDP7，通过DNS比色法测定NDP7的DE值，测定结果见表6。

由表6可知，NDP7的DE值很低，仅有3％，说明NDP7确为非还原性的糖类。

表6 NDP7 DE值的测定

糖制剂	纯度(％)	DE值(％)
			NDP7	92	3

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 682

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Arg Phe Met Lys Leu Thr Ala Val Trp Thr Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ser Pro Val His Ala Ala Pro Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val Ile Tyr Gln Ile Phe

35 40 45

Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn Asn Pro Thr Gly Ala

50 55 60

Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Asp

65 70 75 80

Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly Met

85 90 95

Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ser

100 105 110

Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val His Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp

115 120 125

Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Thr Met Gln Asp

130 135 140

Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His Asn Ile Lys Val Ile

145 150 155 160

Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Ser Asp Asp Pro

165 170 175

Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Asn Leu Leu Gly

180 185 190

Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His His Tyr Gly Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu

210 215 220

Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp Val Tyr Leu Lys Asp

225 230 235 240

Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Ile Arg Val Asp

245 250 255

Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Phe Met Ser Thr

260 265 270

Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly

275 280 285

Ile Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe Ala Asn Glu Ser Gly

290 295 300

Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys Ala Arg Gln Val Phe

305 310 315 320

Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys Ala Met Leu Glu Gly

325 330 335

Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp

340 345 350

Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn Gly Asp Arg Arg Lys

355 360 365

Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Ala

370 375 380

Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly Gly Asn Asp Pro Asp

385 390 395 400

Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Thr Thr Thr Ala Tyr Gln

405 410 415

Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Ile Ala

420 425 430

Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val Ile Ile Tyr

435 440 445

Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val Ala Ile Asn Arg Asn

450 455 460

Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val Thr Ser Leu Pro Gln

465 470 475 480

Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu Asn Gly Asn Thr Leu

485 490 495

Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe Thr Leu Ala Pro Gly

500 505 510

Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala Thr Ala Pro Ile Ile

515 520 525

Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly Val Thr Ile Thr Ile

530 535 540

Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Gly Lys Gly Thr Val Tyr Phe Gly Thr

545 550 555 560

Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu Asp Thr Gln Ile

565 570 575

Gln Val Lys Ile Pro Ala Val Pro Gly Gly Ile Tyr Asp Ile Arg Val

580 585 590

Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp Asn Phe Glu Val

595 600 605

Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile Asn Asn Ala Thr

610 615 620

Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn Val Ser Glu Leu

625 630 635 640

Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val

645 650 655

Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro Ala Gly

660 665 670

Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys

675 680

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Met Ile Met Leu Glu Ala Val Tyr His Arg Met Gly Gln Asn Trp

1 5 10 15

Ser Tyr Ala Tyr Asn Asp Ser Thr Leu His Ile Arg Ile Arg Thr Lys

20 25 30

Arg Asp Asn Val Pro Arg Ile Asp Leu His Cys Gly Glu Lys Tyr Asp

35 40 45

Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Thr Ile Pro Met Glu Arg Met Ala Ser Asp

50 55 60

Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Arg Tyr Arg Arg

65 70 75 80

Leu Val Tyr Tyr Phe Ala Leu His Ser Asp Asn Gly Asp Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Met Glu Lys Gly Phe Phe Asp Gln Pro Pro Lys Val Met Tyr Glu

100 105 110

Gly Leu Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Asn Arg Gln Asp Val His Thr Pro

115 120 125

Pro Ala Trp Val Lys Glu Ala Ile Phe Tyr Gln Ile Phe Pro Glu Arg

130 135 140

Phe Ala Asn Gly Asp Pro Ser Asn Asp Pro Glu Gly Val Gln Glu Trp

145 150 155 160

Gly Gly Thr Pro Ser Ala Gly Asn Phe Phe Gly Gly Asp Leu Gln Gly

165 170 175

Val Ile Asp His Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Leu Gly Val Asn Ala Leu

180 185 190

Tyr Phe Asn Pro Leu Phe Ala Ala Thr Thr Asn His Lys Tyr Asp Thr

195 200 205

Ala Asp Tyr Met Lys Ile Asp Pro Gln Phe Gly Thr Asn Glu Lys Leu

210 215 220

Lys Glu Leu Val Asp Ala Cys His Ala Arg Gly Met Arg Val Leu Leu

225 230 235 240

Asp Ala Val Phe Asn His Cys Gly His Thr Phe Pro Pro Phe Val Asp

245 250 255

Val Leu Asn Asn Gly Leu Asn Ser Arg Tyr Ala Asp Trp Phe His Val

260 265 270

Arg Glu Trp Pro Leu Arg Val Val Asp Gly Ile Pro Thr Tyr Asp Thr

275 280 285

Phe Ala Phe Glu Pro Ile Met Pro Lys Leu Asn Thr Gly Asn Glu Glu

290 295 300

Val Lys Ala Tyr Leu Leu Asn Val Gly Arg Tyr Trp Leu Glu Glu Met

305 310 315 320

Gly Leu Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Asn Glu Val Asp His Gln

325 330 335

Phe Trp Arg Glu Phe Arg Ser Glu Ile Lys Arg Ile Asn Pro Ser Ala

340 345 350

Tyr Ile Leu Gly Glu Ile Met His Asp Ser Met Pro Trp Leu Gln Gly

355 360 365

Asp Gln Phe Asp Ala Val Met Asn Tyr Pro Phe Thr Asn Ile Leu Leu

370 375 380

Asn Phe Phe Ala Arg Arg Leu Thr Asn Ala Ala Glu Phe Ala Gln Ala

385 390 395 400

Ile Gly Thr Gln Leu Ala Gly Tyr Pro Gln Gln Val Thr Glu Val Ser

405 410 415

Phe Asn Leu Leu Gly Ser His Asp Thr Thr Arg Leu Leu Thr Leu Cys

420 425 430

Ser Gly Asn Val Glu Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Phe Gln Leu Thr

435 440 445

Tyr Gln Gly Thr Pro Cys Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Asp

450 455 460

Gly Glu Tyr Asp Pro Leu Asn Arg Lys Cys Met Glu Trp Asp Lys Ser

465 470 475 480

Lys Gln Asn Thr Glu Leu Leu Ala Phe Phe Arg Ser Met Ile Ser Leu

485 490 495

Arg Lys Ala His Pro Ala Leu Arg Gly Ser Gly Leu Arg Phe Leu Pro

500 505 510

Val Leu Glu His Pro Gln Leu Leu Val Tyr Glu Arg Trp Asp Asp Asn

515 520 525

Glu Arg Phe Leu Ile Met Leu Asn Asn Glu Asp Ala Pro Val Asn Val

530 535 540

Val Ile Pro Ala Ala Gln Pro Gly Ala Ser Trp Arg Thr Val Asn Gly

545 550 555 560

Glu Pro Cys Ala Val Val Glu Glu Ser Ser Ile Gln Ala Ala Leu Pro

565 570 575

Pro Tyr Gly Tyr Ala Ile Leu His Ala Pro Ile Ala Gly Thr Ala Glu

580 585 590

<210> 3

<211> 776

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gly Arg Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Lys Gly

1 5 10 15

Phe Thr Leu Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Pro Tyr Leu His Ser Leu

20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Gly

35 40 45

Ser Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu

50 55 60

Arg Gly Gly Pro Glu Gly Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ala Arg Ala

65 70 75 80

Ala Gly Met Gly Val Leu Ile Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val

85 90 95

Ala Thr Pro Ala Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly

100 105 110

Arg Gln Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala

115 120 125

Gly Gly Arg Ile Arg Leu Pro Val Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp

130 135 140

Gln Leu Glu Ile Arg Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe

145 150 155 160

Pro Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asp Ala Pro Arg Asp Val

165 170 175

His Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Ile Gly Trp Arg Arg Ala Asp Asn

180 185 190

Glu Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Gly Val

195 200 205

Arg Val Glu Ile Pro Ala Val Phe Asp Glu Ala His Gln Glu Val Val

210 215 220

Arg Trp Phe Arg Glu Asp Leu Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Pro

225 230 235 240

Asp Gly Leu Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Val

245 250 255

Thr Gly Gly Ala Tyr Leu Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu

260 265 270

Gln Leu Pro Ala Ser Phe Glu Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala

275 280 285

Leu Ala Asp Val Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Arg Gly Gln Glu Pro

290 295 300

Leu Asp Arg Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Gln Asp Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Arg Ile Thr Asp Gly Ile Leu

325 330 335

His Ser Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Gly Asp Ala Asn

340 345 350

Val Ser Ile Asp Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Glu Ile Ile Ala Ala

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Glu Val Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Cys Glu Leu Ala Ala Arg Arg Arg Pro Glu Leu Asp Gln Ala

385 390 395 400

Ile Gln Ala Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Glu Leu Ala

405 410 415

Arg Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Asp Pro Thr Glu Phe Ala Val Glu Pro Asp Glu Phe His Ala

450 455 460

Arg Leu Ala Arg Arg Gln Ala Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ser Glu Val Ala Gly Asp Trp Glu Lys Ala Leu Asn Arg Leu

500 505 510

Arg Asp Leu Ala Pro Leu Pro Asp Gly Pro Leu Ser Ala Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Ile Ala Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Tyr

530 535 540

Tyr Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Asn Trp Thr

545 550 555 560

Asp Pro Ala Pro Ala Phe Glu Glu Lys Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Val Glu Ala Leu Val Glu

580 585 590

Leu Leu Glu Pro Tyr Gly Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Thr Glu Phe

610 615 620

Trp Asp Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Phe Ser Phe

625 630 635 640

Asp Asp Arg Arg Ala Ala Leu Glu Gln Leu Asp Ala Gly Asp Leu Pro

645 650 655

Ala Ser Phe Thr Asp Glu Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala

660 665 670

Leu Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Thr Gly Tyr Arg Pro

675 680 685

Val Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ala Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Arg

690 695 700

Gly Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro

705 710 715 720

Tyr Gly Leu Glu Gln Ser Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu

725 730 735

Asn Thr Ala Met Lys Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Pro Gly

740 745 750

Ala Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Ser Phe Pro Val Ala Leu Leu

755 760 765

Val Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser

770 775

<210> 4

<211> 2051

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaaagat ttatgaaact aacagccgta tggacactct ggttatccct cacgctgggc 60

cttttgagcc cggtccatgc agccccggat acctcggtat ccaacaagca gaatttcagc 120

acggatgtca tatatcagat cttcaccgac cggttctcgg acggcaatcc ggccaacaat 180

ccgaccggcg cggcatttga cggatcatgt acgaatcttc gcttatactg cggcggcgac 240

tggcaaggca tcatcaacaa aatcaacgac ggttatttga ccggcatggg cattacggcc 300

atctggattt cacagcctgt cgagaatatc tacagcgtga tcaactactc cggcgtccat 360

aatacggctt atcacggcta ctgggcgcgg gacttcaaga agaccaatcc ggcctacgga 420

acgatgcagg acttcaaaaa cctgatcgac accgcgcatg cgcataacat aaaagtcatc 480

atcgactttg caccgaacca tacatctccg gcttcttcgg atgatccttc ctttgcagag 540

aacggccgct tgtacgataa cggcaacctg ctcggcggat acaccaacga tacccaaaat 600

ctgttccacc attatggcgg cacggatttc tccaccattg agaacggcat ttataaaaac 660

ctgtacgatc tggctgacct gaatcataac aacagcagcg tcgatgtgta tctgaaggat 720

gccatcaaaa tgtggctcga cctcggggtt gacggcattc gcgtggacgc ggtcaagcat 780

atgccattcg gctggcagaa gagctttatg tccaccatta acaactacaa gccggtcttc 840

accttcggcg aatggttcct tggcatcaat gagattagtc cggaatacca tcaattcgct 900

aacgagtccg ggatgagcct gctcgatttc cgctttgccc agaaggcccg gcaagtgttc 960

agggacaaca ccgacaatat gtacggcctg aaagcgatgc tggagggctc tgaagtagac 1020

tatgcccagg tgaatgacca ggtgaccttc atcgacaatc atgacatgga gcgtttccac 1080

accagcaatg gcgacagacg gaagctggag caggcgctgg cctttaccct gacttcacgc 1140

ggtgtgcctg ccatctatta cggcagcgag cagtatatgt ctggcgggaa tgatccggac 1200

aaccgtgctc ggattccttc cttctccacg acgacgaccg catatcaagt catccaaaag 1260

ctcgctccgc tccgcaaatc caacccggcc atcgcttacg gttccacaca ggagcgctgg 1320

atcaacaacg atgtgatcat ctatgaacgc aaattcggca ataacgtggc cgttgttgcc 1380

attaaccgca atatgaacac accggcttcg attaccggcc ttgtcacttc cctcccgcag 1440

ggcagctata acgatgtgct cggcggaatt ctaaacggca atacgttaac cgtgggtgct 1500

ggcggtgcag cttccaactt tactttggct cctggcggca ctgctgtatg gcagtacaca 1560

accgatgcca cagctccgat catcggcaat gtcggcccga tgatggccaa gccaggggtc 1620

acgattacga ttgacggccg cggattcggc tccggcaagg gaacggttta cttcggtaca 1680

acggcagtca ctggcgcgga catcgtagct tgggaagata cacaaatcca ggtgaaaatc 1740

cctgcggtcc ctggcggcat ctatgatatc agagttgcca acgcagccgg agcagccagc 1800

aacatctacg acaatttcga ggtgctgacc ggagaccagg tcaccgttcg gttcgtaatc 1860

aacaatgcca caacggcgct gggacagaat gtgttcctca cgggcaatgt cagcgagctg 1920

ggcaactggg atccgaacaa cgcgatcggc ccgatgtata atcaggtcgt ctaccaatac 1980

ccgacttggt attatgatgt cagcgttccg gcaggccaaa cgattgaatt taaattcctg 2040

aaaaagcata a 2051

<210> 5

<211> 1775

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatgatta tgctggaagc cgtttaccac cggatgggac aaaactggtc ctatgcctac 60

aatgattcga ccttgcatat ccgcatccgc accaagcggg acaatgtccc gcgcatcgac 120

ctgcactgcg gcgagaagta cgatccggag aagtacaagg aaaccattcc catggagcgt 180

atggcttctg acggactgtt tgattattgg caagccgccg tgcagcccag ataccgtaga 240

ttagtttatt acttcgcgct gcattccgac aacggcgatg ccgtttactt tatggagaag 300

ggattctttg atcagccgcc caaggtgatg tatgaaggat tgttcgactt cccttatctg 360

aatcggcagg atgtgcacac gcctccggca tgggttaagg aagcgatatt ctatcagatt 420

ttccccgagc gcttcgcgaa cggcgatccg tccaacgatc ccgaaggcgt gcaggaatgg 480

ggaggtacgc ccagcgccgg caatttcttc ggcggggatt tgcaaggcgt gatcgatcat 540

ctggactatc taagcgatct gggcgttaat gctttgtatt tcaaccccct attcgcggcc 600

accaccaacc ataaatacga tacggcggac tatatgaaga tcgaccccca attcggcacg 660

aacgaaaagc tcaaggagct ggtcgatgcc tgccatgccc ggggcatgcg cgtgctgctg 720

gacgccgtgt tcaaccactg cggccatacg tttccgccgt tcgtggacgt gttgaacaac 780

ggtctgaatt cgcgttacgc ggattggttc catgttcggg aatggcctct gcgggtcgtt 840

gacgggattc cgacctacga tacgttcgca ttcgaaccaa tcatgcccaa gctcaatacc 900

ggcaatgaag aagtgaaggc ttacctgttg aatgtcggcc gttactggct ggaggagatg 960

gggctggacg gctggcggct ggatgtcgcc aatgaggtgg accatcaatt ctggcgggaa 1020

ttccggagcg agatcaaacg gatcaatcct tcggcctata tcttaggcga gattatgcat 1080

gattccatgc cgtggctgca aggcgaccaa ttcgacgcgg tcatgaatta tcccttcacg 1140

aacatcctgc tgaacttctt cgcccgcagg ctgacgaacg cggccgaatt cgcccaggcg 1200

atcggcacgc agctcgccgg ttatccgcag caggttacgg aagtgtcatt caatctgctc 1260

ggcagccatg acacgacgag gctattgacg ttgtgcagcg gcaatgtgga gcgcatgaag 1320

ctggcgacct tattccagct gacctatcag gggacgccat gcatctatta cggcgacgag 1380

atcggcatgg acggcgagta tgaccccctc aaccgcaagt gcatggaatg ggacaagagc 1440

aagcagaata cggagctgct tgcgttcttc cggagcatga tcagcctgcg caaggctcac 1500

cctgcgctgc gcggaagcgg actgcgcttc ctgccggtgc tggagcaccc gcagttgctg 1560

gtctatgagc gctgggacga taatgagcga ttcctcatca tgctgaataa tgaggatgct 1620

cccgtgaacg ttgttatccc ggcagctcag cccggcgctt cttggcgcac cgtgaacggc 1680

gagccatgcg cagtagtcga ggaaagttcg atacaggcgg ctctccctcc ttacggttat 1740

gccatactgc atgcgcctat agcaggaacg gctga 1775

<210> 6

<211> 2331

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgggcagaa cgccagtctc cacgtacagg ctgcagatca ggaagggatt cacactcttc 60

gacgcggcca aaaccgttcc gtacctgcac tcgctcggcg tcgactgggt ctacctttct 120

ccggtcctga ctgccgagca gggctccgac cacgggtacg acgtcaccga tccctccgcc 180

gtcgaccccg aacgcggcgg gccggagggc ctcgcggcgg tttccaaggc ggcccgcgcc 240

gcgggcatgg gcgtgctgat cgacatcgtg cccaaccacg tgggcgtcgc gacgccggcg 300

cagaacccct ggtggtggtc gctgctcaag gagggacgcc agtcccgtta cgcggaggcg 360

ttcgacgtcg attgggacct cgccggggga cgcatccggc tgccggtgct cggcagcgac 420

gatgacctcg accagctcga aatcagggac ggggagctgc ggtactacga ccaccgattc 480

ccgctcgccg agggaaccta cgccgaaggc gacgccccgc gggatgtcca cgcccggcag 540

cactacgagc tcatcggctg gcgccgcgcg gacaacgagc tgaactaccg ccgctttttc 600

gcggtgaaca cgctcgccgg cgtccgcgtg gaaatccccg ccgtcttcga cgaggcacac 660

caggaggtgg tgcgctggtt ccgcgaggac cttgcggacg gcctgcggat cgaccacccg 720

gacggcctcg ctgaccccga ggggtacctg aagcgactcc gggaagtcac cggcggcgct 780

tacctgctga tcgaaaagat cctggagccg ggggagcagc tgcccgccag cttcgagtgt 840

gaaggcacca caggctacga cgccctcgcc gacgtcgacc gggttctcgt ggacccgcgc 900

ggccaggaac cgctggaccg gcttgacgcg tccctgcgtg gcggcgagcc cgccgactac 960

caggacatga tccgcggaac caagcgccgg atcaccgacg gtatcctgca ctcggagatc 1020

ctgcggctgg cccggctggt tccgggcgac gccaacgttt caatcgacgc cggagccgac 1080

gctctcgccg aaatcatcgc cgccttcccg gtctaccgca cctacctgcc ggagggcgcc 1140

gaggtcctga aggaggcgtg cgagcttgcc gcgcgtaggc ggccggaact cgaccaggcc 1200

atccaggctc tgcagccgct gctgctggac acggacctcg agcttgcccg gcgcttccag 1260

cagacctcgg gcatggtcat ggccaagggc gtggaggaca ccgcgttctt ccgctacaac 1320

cgcctgggca ccctcacgga agtgggcgcc gaccccaccg agttcgccgt ggagccggac 1380

gagttccacg cccggctggc acgccggcag gccgagcttc cgctgtccat gacgacgctg 1440

agcacgcacg acaccaagcg cagcgaggac acccgagcaa ggatttcggt catttccgag 1500

gttgcgggtg actgggaaaa ggccttgaac cggctgcgcg acctggcccc gctgccggac 1560

ggcccgctgt ccgcgctgct ctggcaggcc attgccggcg cctggcccgc cagccgggaa 1620

cgcctgcagt actacgcgct gaaggccgcg cgtgaagcgg ggaactcgac caactggacc 1680

gatccggccc ccgcgttcga ggagaagctg aaggccgcgg tcgacgccgt gttcgacaat 1740

cccgccgtgc aggccgaggt ggaagccctc gtcgagctcc tggagccgta cggagcttcg 1800

aactccctcg ccgccaagct cgtgcagctg accatgcccg gcgtcccgga cgtctaccag 1860

ggcacggagt tctgggaccg gtcgctgacg gacccggaca accggcggcc gttcagcttc 1920

gacgaccgcc gcgccgcgct ggagcagctg gatgccggcg accttcccgc gtcatttacc 1980

gatgagcgga cgaagctgct agtgacgtcg cgcgcgctgc ggctgcgccg ggaccgtccg 2040

gagctgttca cggggtaccg gccggtcctg gccagcgggc ccgccgccgg gcacctgctc 2100

gcgttcgacc gcggcaccgc ggcggcgccg ggtgcattga ccctcgccac gcggcttccc 2160

tacgggctgg aacagtcggg tggatggcgg gacaccgccg tcgaacttaa caccgccatg 2220

aaagacgaac tgaccggtgc cggcttcgga ccgggggcag tgaagatcgc cgacatcttc 2280

cggtcgttcc ccgttgcgct gctggtgccg cagacaggag gagagtcata a 2331

Claims

1.一种一步法生产麦芽糊精的方法，其特征在于，所述麦芽糊精为非还原性麦芽糊精，

先将环糊精加入水或缓冲液中，得到环糊精溶液，然后将环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入环糊精中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液，最后从含有麦芽糊精的反应液中获得麦芽糊精；

所述环糊精降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述环糊精降解酶在环糊精溶液中的添加量为1.5～2.5U/g_环糊精；所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶在环糊精溶液中的添加量为10～15U/g_环糊精；

所述反应的温度为40～45℃、pH为7.0～7.5，反应时间为2～6h。

2.如权利要求1所述的一种一步法生产麦芽糊精的方法，其特征在于，所述非还原性麦芽糊精为麦芽四糖基海藻糖(4-O-α-maltopentaosylα-D-glucoside)、麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltohexaosylα-D-glucoside)和/或麦芽六糖基海藻糖(4-O-α-maltoheptosylα-D-glucoside)。

3.如权利要求1所述的一种一步法生产麦芽糊精的方法，其特征在于，所述将环糊精降解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入环糊精中进行反应时，反应时间是4h。

4.如权利要求1所述的一种一步法生产麦芽糊精的方法，其特征在于，所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精。