CN108034645B - 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明对环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸进行突变，得到的突变体的酶活可达野生酶的2.5倍，并且本发明得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体纯化简单，适于工业化生产。

Description

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用
技术领域
本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
维生素C(VC)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。另外，维生素C还能促进胶原蛋白的合成，还原已形成的黑色素，对保持皮肤弹性、美白、除皱有一定的作用。广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。但是VC二位碳的羟基极不稳定，非常容易氧化降解而限制了其应用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，例如酶产量较低，催化制备AA-2G转化率低等。因此，利用基因工程和酶工程手段，提高环糊精葡萄糖基转移酶的产量，将更加有利于工业化生产。
发明内容
发明第一个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，包括含有一个或两个相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶活性氨基酸残基的取代。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶发生一个或两个氨基酸位点的突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的产量有所提高。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第124位的赖氨酸(Lys)、450位的甘氨酸(Gly)、465位的异亮氨酸(Ile)、641位的异亮氨酸(Ile)、647位的赖氨酸(Lys)或631位的异亮氨酸(Ile)中的一个或者两个位点进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第124位的赖氨酸(Lys)突变为谷氨酸(Glu),突变体命名为K124E。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第450位的甘氨酸(Gly)突变为丝氨酸(Ser),突变体命名为G450S。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第465位的异亮氨酸(Ile)突变为苯丙氨酸(Phe),突变体命名为I465F。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第641位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr),突变体命名为I641T。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第647位的赖氨酸(Lys)突变为谷氨酸(Glu),突变体命名为K647E。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第631位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr),突变体命名为I631T。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第641位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr)，同时将第647位的赖氨酸(Lys)突变为谷氨酸(Glu)，突变体命名为I641T/K647E。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第641位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr)，同时将第631位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr),突变体命名为I641T/I631T。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第647位的赖氨酸(Lys)突变为谷氨酸(Glu)，同时将第631位的异亮氨酸(Ile)突变为苏氨酸(Thr),突变体命名为K647E/I631T。
本发明第二个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心上清即为环糊精葡萄糖基转移酶突变体的粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明的有益效果为：
本法提供了一种产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体I641T、K647E、I631T、I641T/K647E、I641T/I631T、K647E/I631T环糊精葡萄糖基转移酶酶活分别为氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的2.5倍、2.4倍、1.7倍、1.4倍、1.6倍、2倍。产量高，纯化简单，适于工业化生产。
附图说明
图1SDS-PAGE电泳图
图2突变体I641T最适温度
图3突变体I641T温度稳定性
图4突变体I641T最适pH
图5突变体I641T pH稳定性
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1
TB培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1，甘氨酸7.5g·L-1
酶活定义：利用α-CD包埋甲基橙的性质采用比色法测定α-环化活力。一个酶活单位(U)定义为在该条件下1min内生成1μmolα-CD所需要的酶量。
活力测定步骤：
(1)预热：取2mL预先配置好的1％的麦芽糊精DE9-13(50mM，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。
(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加入0.2mL 3M HCl终止反应，加入0.2mL 0.44mmol·L-1甲基橙溶液。
(3)测量：将上述反应液16℃下保温15min，在505nm处测定吸光值并计算酶活力。
实施例1：环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备
(1)突变体的制备
根据氨基酸序列位SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，分别设计并合成引入K124E、G450S、I465F、I641T、K647E、I631T突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，将第124位Lys的密码子变成Glu的密码子，第450位Gly的密码子突变为Ser的密码子，第465位Ile的密码子突变为Phe的密码子，第641位Ile密码子变成Thr密码子，第647位Lys密码子变成Glu密码子，第631位Ile密码子变成Thr密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到环糊精葡萄糖基转移酶。
突变体K124E、G450S、I465F、I641T、K647E、I631T的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET20b(+)为模板。
引入K124E突变的定点突变引物为：
正向引物：5'-GCGGCGCATGCTGAAGGTATTAAGGTG-3'(下划线为突变碱基)
反向引物：5'-CACCTTAATACCTTCAGCATGCGCCGC-3'(下划线为突变碱基)
引入G450S突变的定点突变引物为：
正向引物：5'-TGTTTACCGCGCTGCCGGCTAGCACCTACACCGAT-3'(下划线为突变碱基)
反向引物：5'-ATCGGTGTAGGTGCTAGCCGGCAGCGCGGTAAACA-3'(下划线为突变碱基)引入I465F突变的定点突变引物为：
正向引物:5'-CTGGACGGTAACACCTTTCAGGTTGGC-3'(下划线为突变碱基)
反向引物:5'-GCCAACCTGAAAGGTGTTACCGTCCAG-3'(下划线为突变碱基)
引入I641T突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GCCGGAGGGTAAAACTACCGAGTTTAAATTC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GAATTTAAACTCGGTAGTTTTACCCTCCGGC-3’(下划线为突变碱基)
引入K647E突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGAGTTTAAATTCATCGAAAAAGACTCTCAGGGC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GCCCTGAGAGTCTTTTTCGATGAATTTAAACTCG-3’(下划线为突变碱基)
引入I631T突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CCCGACTTGGTATACCGATGTTTCTGTGC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GCACAGAAACATCGGTATACCAAGTCGGG-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL,dNTPs Mix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，随后25个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
(2)突变菌株的制备
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。重组菌命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-K124E、BL21(DE3)/pET20b(+)-G450S、BL21(DE3)/cgt/pET20b(+)-I465F、BL21(DE3)/pET20b(+)-I641T、BL21(DE3)/pET20b(+)-K647E、BL21(DE3)/pET20b(+)-I631T。
实施例2单突变环糊精葡萄糖基转移酶活力及可溶性表达分析
(1)突变体酶的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养60h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液。以野生cgt/pET20b(+)/E.coli BL21(DE3)发酵得到的上清液为野生酶对照。
野生型环糊精葡萄糖基转移酶和突变体酶的摇瓶培养60h酶活力列于表中，其中I641T、K647E效果最显著，酶活分别为野生酶的2.5倍和2.4倍。
表1野生环糊精葡萄糖转移酶及其突变体的酶活
酶 野生酶 I641T K647E I631T K124E G450S I465F
酶活/U·mL<sup>-1</sup> 50 125 120 86 42 50 43
(3)可溶性表达分析
将突变体取菌浓相同的菌液离心，1mL 50mM磷酸缓冲液悬浮沉淀，冰浴超声破碎，超声参数为功率400W，超声2s，间隔3s,工作80次；取破碎后的沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE采用12％的分离胶和4％的浓缩胶，考马斯亮蓝R250染色。SDS-PAGE(图1)所示环糊精葡萄糖基转移酶大小在66kDa，结果表明，突变体I641T的破壁沉淀条带与野生酶相比，条带更淡，表明突变体I641T包涵体降低。
实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶双突变体的制备及表达
(1)突变体的制备
将上述三个位点进行突变组合，设计双突变，分别获得突变体I641T/K647E、I641T/I631T、I631T/K647E，双突变体酶的制备方法，分别以单突变体酶的I641T、I631T、K647E基因序列为模板，分别设计并合成引物引入双突变，测定序列，将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到环糊精葡萄糖基转移酶。突变体I641T/K647E、I641T/I631T、I631T/K647E的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET20b(+)为模板。
引入K647E突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGAGTTTAAATTCATCGAAAAAGACTCTCAGGGC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GCCCTGAGAGTCTTTTTCGATGAATTTAAACTCG-3’(下划线为突变碱基)引入I641T突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GCCGGAGGGTAAAACTACCGAGTTTAAATTC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GAATTTAAACTCGGTAGTTTTACCCTCCGGC-3’(下划线为突变碱基)
引入I631T突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CCCGACTTGGTATACCGATGTTTCTGTGC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GCACAGAAACATCGGTATACCAAGTCGGG-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL,dNTPs Mix(2.5mM)4μL,正向引物(10μM)1μL,反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min，随后25个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
(2)重组菌株的构建
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确，重组菌命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-I641T/K647E、BL21(DE3)/pET20b(+)-I641T/I631T、BL21(DE3)/pET20b(+)-I631T/K647E。
(3)突变体酶的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养60h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液。以单突变发酵得到的上清液为野生酶对照。
(4)突变体酶活测定
测定双突变I641T/K647E、I641T/I631T、I631T/K647E酶活，环糊精葡萄糖基转移酶野生酶、单突变和双突变体酶的摇瓶培养60h酶活力列于表2中，其中双突变和单突变酶活比野生酶酶活有所提高。
表2环糊精葡萄糖转移酶突变体的酶活
Figure GDA0002404308580000061
实施例4突变体粗酶液的浓缩
将实施例2和实施例3中获得的酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8～10小时沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的50mM KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 6.0)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清透析后获得浓缩酶液。
浓缩酶液的酶活分别为野生菌350U/mL、I641T 900U/mL、K647E 700U/mL、I631T550U/mL、I641T/K647E 500U/mL、I641T/I631T 550U/mL、I631T/K647E 600U/mL。
实施例5 HPLC检测2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的产量
在反应器中加入50g/L的L-抗坏血酸、50g/L的液化马铃薯淀粉(DE值5左右)作为底物，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.0，将野生酶和突变酶的浓缩酶夜调节酶活至300U/mL，分别加入250U野生酶和突变酶，在35℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60U葡萄糖淀粉酶，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时后取样并加入同体积的三氯乙酸溶液(10％，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心10min,取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，Agilent SB-Aq 5μm(4.6mm×250mm)，LC-9A紫外检测器；流动相为20mM的稀磷酸，流速0.8mL min-1；柱温35℃。
野生酶和突变体生产AA-2G的产量如表3所示，突变体AA-2G产量约33.5g/L，野生酶产量为33.01g/L，突变I641T、K647E、I631T、I641T/K647E、I641T/I631T、I631T/K647E对酶转化合成AA-2G不产生影响。
表3野生环糊精葡萄糖转移酶以及突变体生产AA-2G的产量
Figure GDA0002404308580000071
实施例6发酵罐发酵突变酶产量
种子活化：将野生菌和重组菌BL21(DE3)/pET20b(+)-I641T分别接种于含有100μg·m L-1Amp抗生素的LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱中培养10-12h，挑取单菌落接种于含有100μg·m L-1Amp抗生素的LB液体培养基，37℃，200r·min-1，培养8-10h。
种子培养：从上一步活化的菌液中吸取100μL菌液接种于50mL种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养8-10h。
3L发酵罐培养：本实验采用infors 3.6L全自动发酵罐，初始装液量为1.2L。将上一步所得的种子液以8％的接种量接入发酵罐中，同时加入100μg·m L-1Amp抗生素，设置罐内初始溶氧为100％，初始转速300r·min-1；设置pH值为7.0，接入种子后，设置罐内初始溶氧与转速相偶联以控制罐内溶氧维持在30％左右，接种7-8h后发酵罐内碳源耗尽出现溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h-1指数流加补料液进行补料。每隔4h取样一次。整个发酵过程中通过流加25％氨水调节pH，使罐内pH始终维持在7.0左右，当OD600达到15时，补加甘氨酸，甘氨酸终浓度为10g·L-1，当OD600达到50时，I641T突变体以0.3g·L-1·h-1的流速流加乳糖进行诱导，诱导温度为32℃。野生菌以0.2g·L-1·h-1的流速流加乳糖进行诱导，诱导温度为32℃。
发酵结束后，提取上清获得粗酶液，野生酶和突变体I641T的酶活分别为：290U/mL、750U/mL，可见突变体I641T的酶活较野生酶有很大的提升。
实施例7酶学性质测定
(1)最适温度及温度稳定性
以DE9-13麦芽糊精为底物(pH 5.5)，在30-80℃范围内，每隔10℃测定CGTase酶活，定义最高酶活力为100％，计算各个温度下的相对酶活，以确定酶的最适温度；测定酶的热稳定性，将酶在40℃，定期取样测定酶的残留酶活(定义初始酶活力为100％)，突变体I641T随温度酶活力变化如图2所示，可见突变体酶活的最适温度为50℃。突变体I641T的温度稳定性如图3，在40℃时半衰期为9d。
(2)最适pH及pH稳定性
不同pH的用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制不同pH的底物DE9-13麦芽糊精，在50℃条件下，pH4.0-8.0范围内每间隔0.5个单位测定酶活，定义最高酶活力为100％，计算其它各pH条件下突变酶的相对酶活，以确定突变酶的最适pH；将突变酶在上述pH缓冲液中于4℃放置，定时取样，测定残留酶活(初始酶活为100％)，突变体I641T随pH酶活力变化如图4所示，可见突变体酶活的最适pH为6.0。突变体I641T的pH稳定性如图5所示，在pH5.0-8.0范围内10天后，残留酶活仍在60％以上，在pH5.0以下，该酶的稳定性较差。
由此可见，突变体I641T的酶学性质相对稳定，适合工业化的生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
氨基酸序列表
<110> 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用
<120> 江南大学
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln
1 5 10 15
Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser
20 25 30
Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly
35 40 45
Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr
50 55 60
Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val
65 70 75 80
Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr
85 90 95
Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser
100 105 110
Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val
115 120 125
Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn
130 135 140
Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly
165 170 175
Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp
180 185 190
Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys
195 200 205
Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met
210 215 220
Asp Ala Val Arg His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp
225 230 235 240
Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu
245 250 255
Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser
260 265 270
Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val
275 280 285
Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln
290 295 300
Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile
305 310 315 320
Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg
325 330 335
Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro
340 345 350
Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro
355 360 365
Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr
370 375 380
Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu
385 390 395 400
Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val
405 410 415
Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg
420 425 430
Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro
435 440 445
Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr
450 455 460
Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro
465 470 475 480
Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile
485 490 495
Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr
500 505 510
Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly
515 520 525
Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val
530 535 540
Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser
545 550 555 560
Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr
565 570 575
Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn
580 585 590
Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn
595 600 605
Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr
610 615 620
Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr
625 630 635 640
Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp
645 650 655
Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly
660 665 670
Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn
675 680
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcggcgcatg ctgaaggtat taaggtg 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caccttaata ccttcagcat gcgccgc 27
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgtttaccgc gctgccggct agcacctaca ccgat 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atcggtgtag gtgctagccg gcagcgcggt aaaca 35
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ctggacggta acacctttca ggttggc 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gccaacctga aaggtgttac cgtccag 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gccggagggt aaaactaccg agtttaaatt c 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gaatttaaac tcggtagttt taccctccgg c 31
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cgagtttaaa ttcatcgaaa aagactctca gggc 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gccctgagag tctttttcga tgaatttaaa ctcg 34
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
cccgacttgg tataccgatg tttctgtgc 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gcacagaaac atcggtatac caagtcggg 29

Claims (8)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第641位的异亮氨酸突变为苏氨酸。
2.表达权利要求1所述突变体重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心上清即为环糊精葡萄糖基转移酶突变体的粗酶液。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述质粒为cgt/pET20b(+)。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
6.编码权利要求1所述突变体的基因。
7.携带权利要求6所述基因的质粒或微生物。
8.权利要求1所述突变体在制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用。
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应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达;郭永华等;《微生物学报》;20161231;第56卷(第10期);第1551-1560页，尤其是摘要 *

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