CN112779235B

CN112779235B - 一种生物催化合成多种黄酮苷的方法

Info

Publication number: CN112779235B
Application number: CN202110046315.XA
Authority: CN
Inventors: 王健博; 文泽星
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112779235A

Abstract

本发明公开了一种生物催化合成多种黄酮苷的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过蛋白质工程改造糖基转移酶以获得更高产率与区域选择性的突变体，所得的突变体VFAH作为生物催化剂，以槲皮素，山奈酚，木犀草素或异鼠李素作为受体底物，UDP‑葡萄糖作为供体底物，催化合成多种黄酮苷。其中以槲皮素作为受体底物时，产率相比野生型提高约90倍，区域选择性也大于98％，对于底物山奈酚，木犀草素或异鼠李素，在保持高的区域选择性和转化率的同时，主要糖基化产物发生改变，因此本发明提供的突变体在黄酮苷的合成方面具有应用价值。

Description

一种生物催化合成多种黄酮苷的方法

技术领域

本发明涉及一种生物催化合成多种黄酮苷的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

黄酮苷，作为一种生物活性物质，广泛存在于植物中，是黄酮类化合物多样性的重要来源之一。黄酮苷是通过一种称为糖基化的方法生产的，该方法被认为是植物次生代谢产物的关键修饰。糖基化对黄酮类化合物的化学性质产生多种影响，通常会改变植物体内的代谢、生物活性、吸收及生物利用度。黄酮苷的生物活性广泛，包括抗氧化、免疫调节、降血糖和抗肿瘤等活性。目前黄酮苷的来源有三种途径，一是从植物中提取分离，但是许多具有良好活性的黄酮苷在植物中的含量较低；二是化学合成方法，化学合成法又分为全合成和半合成，但通常黄酮苷产率低，选择性差，需要官能团的多步保护和去保护作用，因此难以实现多种黄酮类化合物的合成应用；三是酶催化生物合成方法，酶催化生物合成法因操作简单、条件温和、副产物少、收率高和高效绿色环保等特点而广受关注。目前酶催化生物合成黄酮苷最常用的酶有两种：糖基转移酶和糖苷合成酶。黄酮苷通常是通过植物和微生物中的糖基转移酶将活性糖供体上的糖分子转移到黄酮类受体来催化合成的，并且黄酮类化合物的骨架上的任一羟基都可糖基化，不同位置上的糖基化对其生物活性及对人体健康的潜在益处具有重大影响。

采用糖基转移酶可直接利用活性供体上的糖分子催化合成黄酮苷。由于许多糖基转移酶区域选择性专一和底物特异性，使用单一的糖基转移酶很难实现底物的不同位点的糖基化，这在一定程度上限制了结构多样的黄酮苷的合成。

发明内容

本发明旨在通过蛋白质工程手段改造印度芒果(Mangifera indica)来源的糖基转移酶MiCGT，提高产能和区域选择性。本发明还提供了一种利用糖基转移酶突变体VFAH(W93V-V124F-F191A-R282H)进行的生物催化合成多种黄酮苷的方法。该方法具有条件温和，环境友好，高的区域选择性等优点。

本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶MiCGT突变体VFAH，并编码如下(a)或(b)的氨基酸：

(a)其序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸，

(b)含有第93位缬氨酸(Val)，第124位苯丙氨酸(Phe)，第191位丙氨酸(Ala)，第282位组氨酸(His)，并且与(a)有50％同源性以上的糖基转移酶MiCGT的突变体。

本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶MiCGT突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达上述的糖基转移酶MiCGT突变体VFAH。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pET系列的质粒为载体构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pET28a为载体，将SEQ ID NO:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中重组表达SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶。

本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分：TB培养基，诱导剂为4-6g/Lα-乳糖一水合物,优选温度为18～25℃，转速160～200rpm，表达时长为18-20h。

本发明的一个实施方式中，接种时加入约0.05％葡萄糖。

本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌的蛋白纯化，具体包括如下步骤：用预冷的离心机收集表达菌体，缓冲溶液洗两次，加入少量溶菌酶，液氮速冻，冰水浴解冻，超声破碎，高速离心，采用His-镍柱亲和纯化及脱盐柱脱盐。

本发明的第五个目的是提供应用本发明的糖基转移酶MiCGT突变体VFAH合成多种黄酮苷的方法。

本发明的一种实施方式中，所述方法是于40-60mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲体系中，投入酶量为40-100μg/100μL，pH＝7.0～8.0，30-40℃条件下，受体底物浓度为0.1-0.8mM，UDP-葡萄糖浓度为受体底物浓度的2-5倍，反应转速为800-1200rpm，反应时间为2-6h。

本发明的第六个目的是提供糖基转移酶突变体VFAH在食品、制药等领域的应用。

有益效果：

(1)本发明是使用来源于印度芒果(Mangifera indica)的糖基转移酶MiCGT生产芒果苷的基础上进行蛋白质工程改造，获得的突变体VFAH(W93V-V124F-F191A-R282H)作为生物催化剂，与野生酶MiCGT相比，以槲皮素作为底物，得到产物3-氧-葡萄糖槲皮素，酶活达到约763.4U/mg，产率从近1％提高到90％。

(2)该酶经过改造后，其突变体VFAH对于底物山奈酚，木犀草素，异鼠李素的与野生型的区域选择性不同，改变了合成的主要糖基化产物并保持较高的区域选择性与转化率，如图3至图8所示，具有重要的应用价值。

附图说明

图1：槲皮素与糖基转移酶MiCGT的突变体VFAH和野生型的反应混合液的HPLC色谱图。

图2：槲皮素与突变体VFAH或野生型反应产生的产物1a和1b的一级质谱和二级质谱谱图。

图3：山奈酚与糖基转移酶MiCGT的突变体VFAH和野生型的反应混合液的HPLC色谱图。

图4：山奈酚与突变体VFAH或野生型反应产生的单糖基化产物2a和2b及双糖基化产物2c的质谱谱图。

图5：木犀草素与糖基转移酶MiCGT的突变体VFAH和野生型的反应混合液的HPLC色谱图。

图6：木犀草素与突变体VFAH或野生型反应产生的主要产物2a和2b的质谱谱图。

图7：异鼠李素与糖基转移酶MiCGT的突变体VFAH和野生型的反应混合液的HPLC色谱图。

图8：异鼠李素与突变体VFAH或野生型反应产生的单糖基化产物4a和4b及双糖基化产物4c的质谱谱图。

具体实施方式

本发明中所采用的化学药品，均以商业途径购买获得。

糖基转移酶的比活力测定：在200μL反应缓冲液中进行糖基转移酶的活性测定，其中包括1mM UDP-葡萄糖，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)和约50μg的突变体纯化的酶。在30℃孵育5分钟，然后通过添加相同体积的甲醇终止反应，通过HPLC分析。一个单位的酶活性定义为1min消耗1μmol受体底物或生成1μmol产物的酶量。

实施例里采用的培养基配方如下：

固体培养基配方(1L)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g。，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

LB培养基配方(1L)：酵母提取粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

TB培养基配方(1L)：酵母提取物24g、蛋白胨12g、甘油4mL。加入900mL去离子水，使溶解后高压蒸汽灭菌，再加入100mL经同样灭菌操作后的0.17M KH₂PO₄/0.72M K₂HPO₄的溶液。(注：氯化钠购自阿拉丁，其余均购自生工生物有限公司)

产物黄酮苷分析方法：高效液相色谱及质谱分析。其相应液相检测方法为5-μmC18柱，流动相为：A相(H₂O含0.1％甲酸)与B相(甲醇含0.1％甲酸)。梯度洗脱程序为：35％B，1.5min，35％-80％B 5.5min，80％B,5min，80％-35％B，1min and 35％B，4min。

实施例1：糖基转移酶MiCGT蛋白质工程改造

突变体的设计和制备：

(1)以序列如SEQ ID NO.3所示的基因与载体pET28a构建的重组质粒MiCGT-pET28a为模板(Dawei,et al."Probing the Catalytic Promiscuity of a Regio-andStereospecific C-Glycosyltransferase from Mangifera indica."AngewandteChemie.)，设计突变引物。

表1突变引物

(2)突变体的构建：

以重组质粒MiCGT-pET28a为模板PCR扩增W93V单突变体片段，反应体系如下表所示：

表2 PCR扩增W93V单突变体片段

PCR反应程序：变性98℃，10秒；退火58℃，5秒；延伸68℃，5秒/kb。

再以上述扩增得到的片段作为引物，PCR扩增W93V单突变体质粒，PCR体系如下：

表3 PCR扩增W93V单突变体质粒

再以上述获得的W93V单突变体质粒作为模板，PCR扩增突变体片段W93V-V124F，以次类推，获得VFAH(W93V-V124F-F191A-R282H)突变体的编码基因。

实施例2：糖基转移酶MiCGT突变体VFAH的表达纯化

把含有糖基转移酶MiCGT的突变体VFAH基因的表达质粒pET28a通过化学转化到感受态细胞BL21中，取适量菌液涂在含卡那霉素的固体培养基上，37℃下培养12-15h。挑一个含转化重组质粒的单菌落到LB培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素)，于37℃培养过夜。取1％LB培养物接种到TB培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素和过膜除菌的0.05％葡萄糖)，随后在37℃下培养至生长对数期，即OD值为0.6～0.8，加入5g/Lα-乳糖一水合物作为诱导剂，转到25℃160rpm条件下进行表达18-20h。

用4℃预冷的离心机收集表达菌体，以含10％甘油的50mM(pH＝8.0)NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液洗两次，再加入少量溶菌酶，液氮速冻，冰水浴解冻，超声破碎，高速离心，采用His-镍柱亲和纯化(以含10％甘油和10mM咪唑的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗杂蛋白，以含10％甘油和500mM咪唑的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗脱目的蛋白，及利用脱盐柱脱盐(脱盐缓冲溶液为含10％甘油的50mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液)。测定突变体VFAH对槲皮素的比活力约为763.4U/mg。

实施例3：糖基转移酶MiCGT及其突变体VFAH催化槲皮素合成黄酮苷

在200μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为1mM，底物槲皮素浓度为0.4mM，DMSO(v/v，5％)，EDTA(5mM)，生物催化剂纯酶的量约为80微克，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加等体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图1和图2可以看出，突变体VFAH催化槲皮素可以得到产物3-氧-葡萄糖槲皮素(1a)，产率约90％，而野生酶能得到产物1a和1b，其中产物1a的产率低于1％。突变体较野生酶区域选择性更高的同时，其3-氧-葡萄糖槲皮素(1a)产率提高了约90倍。

实施例4：糖基转移酶MiCGT及其突变体VFAH催化山奈酚合成黄酮苷

在200μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为1mM，底物槲皮素浓度为0.2mM，DMSO(v/v，5％)，生物催化剂纯酶的量约为80微克，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加等体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图3和图4可以看出，突变体VFAH催化山奈酚得到以产物2a为主的产物，而野生型可生产得到产物2a、2b和2c，且以产物2b为主，突变体实现了山奈酚主要糖基化产物的改变且具有高的区域选择性。

实施例5：糖基转移酶MiCGT及其突变体VFAH催化木犀草素合成黄酮苷

由图5和图6可以看出，突变体VFAH催化木犀草素得到以产物3a为主的产物，而野生型是以产物3b为主的产物，突变体实现了异鼠李素主要糖基化产物的改变且具有较高的区域选择性。

实施例6：糖基转移酶MiCGT及其突变体VFAH催化异鼠李素合成黄酮苷

由图7和图8可以看出，突变体VFAH催化木犀草素得到以产物4a为主的产物，而野生型是以产物4b为主的产物，突变体实现了异鼠李素主要糖基化产物的改变且具有较高的区域选择性。

对比例1：

具体实施方式同实施例1，区别在于，对位点M21进行突变为丙氨酸，按照实施例2～3制备得到酶突变体，并用于与槲皮素的催化反应，结果显示产物1a的产率低于1％，与野生型接近，相比突变体VFAH(W93V-V124F-F191A-R282H)低了约90倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南师范大学

<120> 一种生物催化合成多种黄酮苷的方法

<130> BAA201341A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Ala Ser Asp Ala Leu Asn Ser Cys Pro His Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Gly Met Gly His Leu Thr Pro Cys Leu Arg Phe Ala Ala

20 25 30

Thr Leu Val Gln His His Cys Arg Val Thr Ile Ile Thr Asn Tyr Pro

35 40 45

Thr Val Ser Val Ala Glu Ser Arg Ala Ile Ser Leu Leu Leu Ser Asp

50 55 60

Phe Pro Gln Ile Thr Glu Lys Gln Phe His Leu Leu Pro Phe Asp Pro

65 70 75 80

Ser Thr Ala Asn Thr Thr Asp Pro Phe Phe Leu Arg Val Glu Ala Ile

85 90 95

Arg Arg Ser Ala His Leu Leu Asn Pro Leu Leu Ser Ser Ile Ser Pro

100 105 110

Pro Leu Ser Ala Leu Val Ile Asp Ser Ser Leu Phe Ser Ser Phe Val

115 120 125

Pro Val Ala Ala Asn Leu Asp Leu Pro Ser Tyr Val Leu Phe Thr Ser

130 135 140

Ser Thr Arg Met Cys Ser Leu Glu Glu Thr Phe Pro Ala Phe Val Ala

145 150 155 160

Ser Lys Thr Asn Phe Asp Ser Ile Gln Leu Asp Asp Val Ile Glu Ile

165 170 175

Pro Gly Phe Ser Pro Val Pro Val Ser Ser Val Pro Pro Val Ala Leu

180 185 190

Asn Leu Asn His Leu Phe Thr Thr Met Leu Ile Gln Asn Gly Gln Ser

195 200 205

Phe Arg Lys Ala Asn Gly Ile Leu Ile Asn Thr Phe Glu Ala Leu Glu

210 215 220

Gly Gly Ile Leu Pro Gly Ile Asn Asp Lys Arg Ala Ala Asp Gly Leu

225 230 235 240

Pro Pro Tyr Cys Ser Val Gly Pro Leu Leu Pro Cys Lys Phe Glu Lys

245 250 255

Thr Glu Cys Ser Ala Pro Val Lys Trp Leu Asp Asp Gln Pro Glu Gly

260 265 270

Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser His Phe Ala Leu Ser Ser Glu

275 280 285

Gln Ile Lys Glu Leu Gly Asp Gly Leu Ile Arg Ser Gly Cys Arg Phe

290 295 300

Leu Trp Val Val Lys Cys Lys Lys Val Asp Gln Glu Asp Glu Glu Ser

305 310 315 320

Leu Asp Glu Leu Leu Gly Arg Asp Val Leu Glu Lys Ile Lys Lys Tyr

325 330 335

Gly Phe Val Ile Lys Asn Trp Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Asp His

340 345 350

Arg Ala Val Gly Gly Phe Val Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Ser Met

355 360 365

Glu Ala Val Trp His Gly Val Pro Met Leu Val Trp Pro Gln Phe Gly

370 375 380

Asp Gln Lys Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Arg Ser Gly Leu Gly Met

385 390 395 400

Trp Val Lys Arg Trp Gly Trp Gly Thr Gln Gln Leu Val Lys Gly Glu

405 410 415

Glu Ile Gly Glu Arg Ile Lys Asp Leu Met Gly Asn Asn Pro Leu Arg

420 425 430

Val Arg Ala Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Arg Lys Ala Ile Glu Val

435 440 445

Gly Gly Ser Ser Glu Lys Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu Asn Trp Lys

450 455 460

Lys Thr Ser Arg Lys Thr

465 470

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtgcca gtgatgcttt aaacagctgc ccgcacgttg cattgctgct gagcagcggt 60

atgggtcatt taaccccgtg cttacgtttc gccgcaacct tagttcagca ccattgccgc 120

gtgaccatca tcaccaacta ccctacagtg agcgtggccg aaagccgtgc aatcagctta 180

ctgttaagcg acttcccgca gatcaccgaa aaacaattcc atttactgcc gttcgacccg 240

agcaccgcaa acacaaccga tccgttcttt ctgcgcgtgg aagcaattcg ccgtagcgcc 300

cacttactga atccgctgtt aagcagtatc agtcctccgc tgagtgcact ggtgatcgat 360

agctctttat ttagcagttt tgtgccggtt gccgccaatt tagatctgcc gagctacgtg 420

ctgtttacca gcagcacccg catgtgctct ttagaggaaa catttccggc cttcgtggcc 480

agcaaaacca atttcgacag catccagctg gacgacgtga tcgagatccc gggttttagc 540

ccggttccgg tgagtagtgt gccgccggtt gcgctgaatt taaaccattt atttaccacc 600

atgctgatcc agaatggcca gagctttcgc aaagccaatg gcatcttaat caataccttc 660

gaagctttag aaggcggtat tttaccgggc attaatgaca agcgtgccgc cgacggctta 720

ccgccgtatt gcagcgttgg tccgttactg ccgtgcaaat ttgagaagac cgaatgcagc 780

gccccggtga agtggctgga cgaccagccc gaaggtagtg tggtgtacgt gagctttggc 840

agtcattttg ctttaagcag cgaacagatt aaggagctgg gcgatggttt aatccgtagt 900

ggttgccgct ttttatgggt ggtgaagtgc aagaaggtgg accaagaaga tgaggaaagt 960

ctggacgagc tgctgggccg tgatgtgctg gagaaaatta aaaagtatgg ctttgtgatt 1020

aaaaactggg tgaatcagca agaaatttta gatcaccgtg cagtgggtgg ctttgtgacc 1080

catggcggct ggaatagcag tatggaggcc gtttggcatg gtgtgcctat gctggtttgg 1140

ccgcagtttg gcgaccagaa gatcaacgcc gaagtgatcg aacgcagcgg tttaggtatg 1200

tgggtgaaac gttggggctg gggtacccag cagttagtga aaggcgaaga aatcggcgag 1260

cgtattaaag atttaatggg caataatccg ctgcgcgtgc gtgcaaaaac tttacgcgaa 1320

gaagcccgca aagcaatcga agtgggcggc agcagtgaaa aaacactgaa ggagctgatc 1380

gagaactgga agaagaccag ccgtaaaacc taa 1413

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagtgcca gtgatgcttt aaacagctgc ccgcacgttg cattgctgct gagcagcggt 60

atgggtcatt taaccccgtg cttacgtttc gccgcaacct tagttcagca ccattgccgc 120

gtgaccatca tcaccaacta ccctacagtg agcgtggccg aaagccgtgc aatcagctta 180

ctgttaagcg acttcccgca gatcaccgaa aaacaattcc atttactgcc gttcgacccg 240

agcaccgcaa acacaaccga tccgttcttt ctgcgctggg aagcaattcg ccgtagcgcc 300

cacttactga atccgctgtt aagcagtatc agtcctccgc tgagtgcact ggtgatcgat 360

agctctttag ttagcagttt tgtgccggtt gccgccaatt tagatctgcc gagctacgtg 420

ctgtttacca gcagcacccg catgtgctct ttagaggaaa catttccggc cttcgtggcc 480

agcaaaacca atttcgacag catccagctg gacgacgtga tcgagatccc gggttttagc 540

ccggttccgg tgagtagtgt gccgccggtt tttctgaatt taaaccattt atttaccacc 600

atgctgatcc agaatggcca gagctttcgc aaagccaatg gcatcttaat caataccttc 660

gaagctttag aaggcggtat tttaccgggc attaatgaca agcgtgccgc cgacggctta 720

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gccccggtga agtggctgga cgaccagccc gaaggtagtg tggtgtacgt gagctttggc 840

agtcgctttg ctttaagcag cgaacagatt aaggagctgg gcgatggttt aatccgtagt 900

ggttgccgct ttttatgggt ggtgaagtgc aagaaggtgg accaagaaga tgaggaaagt 960

ctggacgagc tgctgggccg tgatgtgctg gagaaaatta aaaagtatgg ctttgtgatt 1020

aaaaactggg tgaatcagca agaaatttta gatcaccgtg cagtgggtgg ctttgtgacc 1080

catggcggct ggaatagcag tatggaggcc gtttggcatg gtgtgcctat gctggtttgg 1140

ccgcagtttg gcgaccagaa gatcaacgcc gaagtgatcg aacgcagcgg tttaggtatg 1200

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cgtattaaag atttaatggg caataatccg ctgcgcgtgc gtgcaaaaac tttacgcgaa 1320

gaagcccgca aagcaatcga agtgggcggc agcagtgaaa aaacactgaa ggagctgatc 1380

gagaactgga agaagaccag ccgtaaaacc taa 1413

Claims

1.一种糖基转移酶MiCGT的突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述糖基转移酶MiCGT突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列载体。

5.表达权利要求1所述糖基转移酶MiCGT突变体的基因工程菌。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。

7.含有权利要求1所述的糖基转移酶MiCGT突变体的生物催化剂。

8.一种生物催化合成多种黄酮苷的方法，其特征在于，所述方法是用UDP-葡萄糖为糖基供体，以权利要求7所述的糖基转移酶MiCGT突变体作为生物催化剂，在含槲皮素、山奈酚、木犀草素或异鼠李素的体系中反应。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物催化剂投入量为40-100 μg/100 μL，受体底物浓度为0.1-0.8 mM，UDP-葡萄糖浓度为受体底物浓度的2-5倍，转速800-1200rpm，反应2-6 h。

10.权利要求1所述糖基转移酶MiCGT突变体在食品或制药领域的应用。