CN111394292A - 一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过10个不同强度的启动子依次优化三条神经氨酸合成途径中关键酶UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖‑2‑差向异构酶、N‑乙酰氨基葡萄糖‑6‑磷酸异构酶，以及氨基葡萄糖‑6‑磷酸‑N‑乙酰基转移酶、N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶和N‑乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平，降低了酶的表达对细胞造成的蛋白合成压力，并进一步将三条神经氨酸整合到同一株枯草芽孢杆菌工程菌中，获得了N‑乙酰神经氨酸产量提高的枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平下的产量达到了10.4g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌NeuAc产量奠定了基础。

Description

一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，导致成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过UDP-N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuC关键酶合成途径，N-乙酰氨基葡萄糖为前体的Age关键酶合成途径，以及N-乙酰氨基葡萄-6磷酸为前体的NanE关键酶合成途径，由于途径涉及较多外源酶蛋白，同时引入多个酶蛋白容易导致细胞压力，不利于细胞生长和产物合成，因此难以实现多途径复合的策略，这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为实现三条途径在枯草芽孢杆菌中高效表达，且不造成细胞代谢压力，本发明通过筛选不同强度的启动子对关键代谢途径的基因表达水平进行合理调控，以提高神经氨酸的含量。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，利用启动子强化了UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)和N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6～15。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)。

在一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.6～8任一所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.11～15任一所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.6所示的启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶的表达。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.11所示的启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.6～8或SEQ ID NO.12～14任一所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.6所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，并用SEQ ID NO.15所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并用SEQ ID NO.6所示的启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并用SEQ ID NO.11所示的启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并用SEQ ID NO.6所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。

本发明的第二个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量的方法，是向枯草芽孢杆菌中引入脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以不同强度的启动子分别强化NeuC和NeuB参与的由UDP-N-乙酰葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的途径，强化Gna1、Age和NeuB参与的由葡萄糖胺-6-磷酸合成N-乙酰神经氨酸的途径，以及Gna1、NanE和NeuB参与的由6-磷酸-N-乙酰甘露糖苷合成N-乙酰神经氨酸的途径。

在一种实施方式中，所述方法通过多个启动子强化枯草芽孢杆菌UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平；所述启动子具有如SEQ ID NO.6～15任一所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSGN6-comK，其构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production in Bacillussubtilis》中。

本发明的第三个目是提供一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，是将上述任一所述的重组枯草芽孢杆菌在含唾液酸的环境中培养，以生产神经氨酸。

在一种实施方式中，所述培养是在30～37℃培养16～72h。

在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得OD为6～10的种子液，再以按体积比计1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。

在一种实施方式中，所述发酵是在含有葡萄糖60g/L，胰蛋白胨6g/L，酵母粉12g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钾12.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁3g/L的培养基中进行。

本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备含神经氨酸或其衍生产品中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于制备药物或保健品。

在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦(Zanamivir)或奥司他韦(Oseltamivir)。

有益效果：

(1)本发明通过筛选不同来源的N-乙酰神经氨酸合酶，确定了在低表达水平下仍有较高催化活性的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并将其整合于重组枯草芽孢杆菌基因组上；

(2)本发明通过以10个不同强度启动子分别优化三条神经氨酸合成途径关键酶UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)和N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)在基因组上的表达水平，并降低了关键酶NeuB的表达水平，从而降低了其对细胞造成的蛋白合成压力；并使枯草芽孢杆菌发酵72h后的N-乙酰神经氨酸产量达7.6g/L以上，具有很好的代谢工程应用前景。

附图说明

图1为神经氨酸合成途径图。

具体实施方式

UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；Neisseria meningitidis来源的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

启动子P1～P10的和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～15；

大肠杆菌来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.21所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

Moritella viscosa来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.23所示，核苷酸序列如SEQID NO.24所示。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。

神经氨酸检测方法：采用Agilent液相色谱进行检测，色谱柱为Aminex HPX-87Hcolumn(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mM硫酸，流速为0.5mL/min，N-乙酰神经氨酸的出峰时间约为9.8分钟。

实施例1构建基因组重组整合NeuC片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NeuC-L-F:

5’-GCGAACAGGCATCCTATACACTGGGACAA-3’和

NeuC-L-R:5’-ACCGAGCTCGAATTCTTATTAGACGGAGTCTTTTTTGCTTTTGCCAATCAGACGTGTAA-3’，扩增重组整合NeuC左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.6～15所示的启动子P1～P10的片段；

合成如SEQ ID NO.16所示的NeuC基因序列；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NeuC-R-L：

5’-ACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGACGGAGTCTTTTTTTATTTCGTTTTTAAGAAGTAGG-3’和NeuC-R-R：

5’-CTAACACAATCCATTTTGAAGATGCCTTTTTGCA-3’，扩增重组整合NeuC右臂基因片段；

将扩增得到的NeuC左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.1～10所示)、NeuC基因片段和NeuC右臂片段通过融合PCR技术构建成重组整合NeuC基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为NeuC1～NeuC10；其中，NeuC1对应含有SEQ ID NO.6所示的P1启动子的NeuC融合片段，NeuC2对应含有SEQ ID NO.7所示的P2启动子的NeuC融合片段，以此类推，NeuC10对应含有SEQ ID NO.15所示的P10启动子的NeuC融合片段。

实施例2构建基因组重组整合NanE片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NanE-L-F:5’-GTGTTCGTAGTCTCTCGGGAGAGTCATTCCATGA-3’和NanE-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCGCGTTTAAGAGAACAGGCCTTGGTTTGTGACA-3’，扩增重组整合NanE左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.6～15所示的启动子P1～P10的片段；

合成如SEQ ID NO.17所示的NanE基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NanE-R-L：

5’-GAATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCATGACTGTCAGTTCTTTCAGCCGCT-3’和NanE-R-R：

5’-CAACGATTGCGTTTAATGTCAGCATCAGCCCATACA-3’，扩增重组整合NanE右臂基因片段。

将扩增得到的NanE左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.6～15所示)、NanE基因片段和NanE右臂片段通过融合PCR技术，构建成重组整合NanE基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为NanE1～NanE10；其中，NanE1对应含有SEQ ID NO.6所示的P1启动子的NanE融合片段，NanE2对应含有SEQ ID NO.7所示的P2启动子的NanE融合片段，以此类推，NanE10对应含有SEQ ID NO.15所示的P10启动子的NanE融合片段。

实施例3构建基因组重组整合Gna1片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Gna1-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Gna1-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Gna1左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.6～15所示的启动子P1～P10的片段；

合成如SEQ ID NO.18所示的编码Gna1的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Gna1-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Gna1-R-R：5’-CCTACTTAAGCTGCTACCACTTGTGA-3’，扩增重组整合Gna1右臂基因片段。

将扩增得到的Gna1左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.6～15所示)、Gna1基因片段和Gna1右臂片段通过融合PCR技术，构建成重组整合Gna1基因的片段，根据启动子的不同将其分别命名为Gna11～Gna110；其中，Gna11对应含有SEQ ID NO.6所示的P1启动子的Gna1融合片段，Gna12对应含有SEQ ID NO.7所示的P2启动子的Gna1融合片段，以此类推，Gna110对应含有SEQ ID NO.15所示的P10启动子的Gna1融合片段。

实施例4构建基因组重组整合Age片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Age-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Age-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Age左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.6～15所示的启动子P1～P10的片段；

合成如SEQ ID NO.19所示的编码Age的基因片段；

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以引物Age-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Age-R-R：5’-ATAACCAACGCAGCAAGTGGCAACCT-3’，扩增重组整合Age右臂基因片段。

将扩增得到的Age左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.6～15所示)、Age基因片段和Age右臂片段通过融合PCR技术，构建成重组整合Age基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为Age1～Age10；其中，Age1对应含有SEQ ID NO.6所示的P1启动子的Age融合片段，Age2对应含有SEQ ID NO.7所示的P2启动子的Age融合片段，以此类推，Age10对应含有SEQ ID NO.15所示的P10启动子的Age融合片段。

实施例5构建基因组重组整合NeuB片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NeuB-L-F:5’-CGGTGTCTGTATATCACAAAAATAGTGAGCAGGGTAACGA-3’和NeuB-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCCACCTATTTTGTTACAGCGTGTGCCACTTTTATGCA-3’，扩增重组整合NeuB左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.6～15所示的启动子P1～P10的片段；

合成如SEQ ID NO.20所示的编码Age的基因片段；

以引物NeuB-G-L：5’-ATGCAAAACAACAACGAATTTAAAATCGGCA-3’和NeuB-G-R：5’-CGGGATTTCCCGGCAGTCTGACAAGTTATTCTGCAATAGTTATTCGATATCTGTTTTCTTAATCTGAGCTCCTTTGCGGA-3’扩增NeuB片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NeuB-R-L：5’-TAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGCTTGAACAGCTTTTTTTGAATACCTTGTCCAGCT-3’和NeuB-R-R：5’-GCGTCATCGCAGTTTTTGCACCTGACT-3’扩增重组整合NeuB右臂基因片段。

将扩增得到的NeuB左臂基因片段、启动子片段(分别如SEQ ID NO.6～15所示)、NeuB基因片段和NeuB右臂片段通过融合PCR技术，构建成重组整合NeuB基因片段；根据启动子的不同将其分别命名为NeuB1～NeuB10；其中，NeuB1对应含有SEQ ID NO.6所示的P1启动子的NeuB融合片段，NeuB2对应含有SEQ ID NO.7所示的P2启动子的NeuB融合片段，以此类推，NeuB10对应含有SEQ ID NO.15所示的P10启动子的NeuB融合片段。

实施例6重组整合Gna1基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例3构建的重组整合Gna11～Gna110的基因片段转化至枯草芽孢杆菌BSGN6-comK(构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production inBacillus subtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BS-Gna1-1～BS-Gna1-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1-1～BS-Gna1-10接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h。最终测定发酵液中检测到N-乙酰神经氨酸(NeuAc)前体物质N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)产量分别为：8.4g/L、8.1g/L、8.1g/L、7.9g/L、7.8g/L、7.2g/L、7.8g/L、7.1g/L、7.2g/L、7.2g/L。

实施例7重组整合Age基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例4构建的重组整合Age1～Age10的基因片段转化至实施例6构建的重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSG-Age-1～BSG-Age-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-1～BSG-Age-10接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h，测定发酵液中N-乙酰神经氨酸(NeuAc)前体物质N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)的产量分别为：0.5g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.4g/L、0.1g/L、2.8g/L、3.2g/L、2.9g/L、3.1g/L、3.5g/L。

实施例8重组整合NeuB基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例5构建的重组整合NeuB1～NeuB10的基因片段转化至实施例7构建的重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-10基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSGA-NeuB-1～BSGA-NeuB-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSGA-NeuB-1～BSGA-NeuB-10接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h。测定发酵液中NeuAc产量的分别为：7.6g/L、3.4g/L、3.1g/L、2.8g/L、3.7g/L、2.2g/L、1.9g/L、2.1g/L、1.7g/L、1.9g/L。

实施例9重组整合NeuC基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例1构建的重组整合NeuC1～NeuC10的基因片段转化至实施例8构建的重组枯草芽孢杆菌BSGA-NeuB-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSGAN-NeuC-1～BSGAN-NeuC-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSGAN-NeuC-1～BSGAN-NeuC-10接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h，测定发酵液中检测到NeuAc产量分别为：6.8g/L、6.6g/L、7.1g/L、8.1g/L、7.8g/L、9.1g/L、5.6g/L、5.8g/L、7.1g/L、7.9g/L。

实施例10重组整合NanE基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例2构建的重组整合NanE1～NanE10的基因片段转化至实施例9构建的重组枯草芽孢杆菌BSGAN-NeuC-6基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSGANC-NanE-1～BSGANC-NanE-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSGANC-NanE-1～BSGANC-NanE-10接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h。测定发酵液中的NeuAc产量，结果分别为：10.4g/L、9.6g/L、9.2g/L、8.5g/L、8.4g/L、8.9g/L、9.0g/L、9.2g/L、9.0g/L、8.8g/L，对比例1：仅通过强化Age-NeuB途径合成NeuAc

按照实施例6～7相同的策略，不以启动子调控Age或NeuB的表达，仅通过强化Age-NeuB途径合成NeuAc，在37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h的NeuAc产量最高只能达到2.75g/L。

对比例2：不同来源N-乙酰神经氨酸合酶对表达效果的影响

分别以实施例5相同的策略，将E.coli K1和Moritella viscosa等来源的NeuB基因在枯草芽孢杆菌BSGN6-comK中表达，并通过不同启动子调控表达。在实施例10相同的培养条件下，发酵16～72h后的神经氨酸产量如表1所示。

表1表达不同来源NeuB的重组枯草芽孢杆菌神经氨酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Arg Ile Leu Cys Ile Thr Gly Thr Arg Ala Asp Phe Gly Lys

1 5 10 15

Leu Lys Pro Leu Leu Ala Tyr Ile Glu Asn His Pro Asp Leu Glu Leu

20 25 30

His Leu Ile Val Thr Gly Met His Met Met Lys Thr Tyr Gly Arg Thr

35 40 45

Tyr Lys Glu Val Thr Arg Glu Asn Tyr Gln His Thr Tyr Leu Phe Ser

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Gly Glu Pro Met Gly Ala Val Leu Gly Asn Thr Ile

65 70 75 80

Thr Phe Ile Ser Arg Leu Ser Asp Glu Ile Glu Pro Asp Met Val Met

85 90 95

Ile His Gly Asp Arg Leu Glu Ala Leu Ala Gly Ala Ala Val Gly Ala

100 105 110

Leu Ser Ser Arg Leu Val Cys His Ile Glu Gly Gly Glu Leu Ser Gly

115 120 125

Thr Val Asp Asp Ser Ile Arg His Ser Ile Ser Lys Leu Ser His Ile

130 135 140

His Leu Val Ala Asn Glu Gln Ala Val Thr Arg Leu Val Gln Met Gly

145 150 155 160

Glu Lys Arg Lys His Ile His Ile Ile Gly Ser Pro Asp Leu Asp Val

165 170 175

Met Ala Ser Ser Thr Leu Pro Ser Leu Glu Glu Val Lys Glu Tyr Tyr

180 185 190

Gly Leu Pro Tyr Glu Asn Tyr Gly Ile Ser Met Phe His Pro Val Thr

195 200 205

Thr Glu Ala His Leu Met Pro Gln Tyr Ala Ala Gln Tyr Phe Lys Ala

210 215 220

Leu Glu Leu Ser Gly Gln Asn Ile Ile Ser Ile Tyr Pro Asn Asn Asp

225 230 235 240

Thr Gly Thr Glu Ser Ile Leu Gln Glu Leu Leu Lys Tyr Gln Ser Asp

245 250 255

Lys Phe Ile Ala Phe Pro Ser Ile Arg Phe Glu Tyr Phe Leu Val Leu

260 265 270

Leu Lys His Ala Lys Phe Met Val Gly Asn Ser Ser Ala Gly Ile Arg

275 280 285

Glu Ala Pro Leu Tyr Gly Val Pro Ser Ile Asp Val Gly Thr Arg Gln

290 295 300

Ser Asn Arg His Met Gly Lys Ser Ile Ile His Thr Asp Tyr Glu Thr

305 310 315 320

Lys Asn Ile Phe Asp Ala Ile Gln Gln Ala Cys Ser Leu Gly Lys Phe

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Thr Phe Asn Gly Gly Asp Thr Arg Thr Ser Thr Glu

340 345 350

Arg Phe Ala Glu Val Ile Asn Asn Pro Glu Thr Trp Asn Val Ser Ala

355 360 365

Gln Lys Arg Phe Ile Asp Leu Asn Leu

370 375

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Leu Leu Ala Gln Leu Asp Gln Lys Ile Ala Ala Asn Gly Gly

1 5 10 15

Leu Ile Val Ser Cys Gln Pro Val Pro Asp Ser Pro Leu Asp Lys Pro

20 25 30

Glu Ile Val Ala Ala Met Ala Leu Ala Ala Glu Gln Ala Gly Ala Val

35 40 45

Ala Ile Arg Ile Glu Gly Val Ala Asn Leu Gln Ala Thr Arg Ala Val

50 55 60

Val Ser Val Pro Ile Ile Gly Ile Val Lys Arg Asp Leu Glu Asp Ser

65 70 75 80

Pro Val Arg Ile Thr Ala Tyr Ile Glu Asp Val Asp Ala Leu Ala Gln

85 90 95

Ala Gly Ala Asp Ile Ile Ala Ile Asp Gly Thr Asp Arg Pro Arg Pro

100 105 110

Val Pro Val Glu Thr Leu Leu Ala Arg Ile His His His Gly Leu Leu

115 120 125

Ala Met Thr Asp Cys Ser Thr Pro Glu Asp Gly Leu Ala Cys Gln Lys

130 135 140

Leu Gly Ala Glu Ile Ile Gly Thr Thr Leu Ser Gly Tyr Thr Thr Pro

145 150 155 160

Glu Thr Pro Glu Glu Pro Asp Leu Ala Leu Val Lys Thr Leu Ser Asp

165 170 175

Ala Gly Cys Arg Val Ile Ala Glu Gly Arg Tyr Asn Thr Pro Ala Gln

180 185 190

Ala Ala Asp Ala Met Arg His Gly Ala Trp Ala Val Thr Val Gly Ser

195 200 205

Ala Ile Thr Arg Leu Glu His Ile Cys Gln Trp Tyr Asn Thr Ala Met

210 215 220

Lys Lys Ala Val Leu

225

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser His Ile Phe Asp Ala Ser Val Leu Ala Pro His Ile Pro Ser

1 5 10 15

Asn Leu Pro Asp Asn Phe Lys Val Arg Pro Leu Ala Lys Asp Asp Phe

20 25 30

Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Val Gly Asn

35 40 45

Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe Glu Ala Met Arg Thr Ser

50 55 60

Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu Asp Ser Asn Ser Gln Lys

65 70 75 80

Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu Met Lys Phe Ile His Gly

85 90 95

Ala Gly Ser Arg Gly Arg Val Glu Asp Val Val Val Asp Thr Glu Met

100 105 110

Arg Arg Gln Lys Leu Gly Ala Val Leu Leu Lys Thr Leu Val Ser Leu

115 120 125

Gly Lys Ser Leu Gly Val Tyr Lys Ile Ser Leu Glu Cys Val Pro Glu

130 135 140

Leu Leu Pro Phe Tyr Ser Gln Phe Gly Phe Gln Asp Asp Cys Asn Phe

145 150 155 160

Met Thr Gln Arg Phe

165

<210> 4

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu

1 5 10 15

Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

20 25 30

Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Gln Gly Lys Val Tyr Asp Thr

35 40 45

Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Thr Phe Ser Met

50 55 60

Leu Cys Asn Gln Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys Ile Ala Arg

65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gln His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn

85 90 95

Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gln Pro Tyr

100 105 110

Asn Ile Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln Tyr Ala

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ala Lys Asp Val Ala Met Gln Ala Tyr

130 135 140

Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met Ile

165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe

195 200 205

Leu Asp Gln Glu Gln Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly

210 215 220

Ser His Ile Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu Ile Asn Pro Gly His Gly

225 230 235 240

Ile Glu Ala Met Trp Phe Ile Met Asp Ile Ala Arg Arg Lys Asn Asp

245 250 255

Ser Lys Thr Ile Asn Gln Ala Val Asp Val Val Leu Asn Ile Leu Asn

260 265 270

Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala

275 280 285

Ala Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp

290 295 300

Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr

305 310 315 320

Gly Arg Asp Ala Cys Trp Ala Trp Tyr Gln Lys Met His Asp Tyr Ser

325 330 335

Trp Gln His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu

340 345 350

Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys

355 360 365

Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Met Tyr Leu Cys Trp Gln Gln Phe

370 375 380

Glu Ala Leu Ser

385

<210> 5

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gln Asn Asn Asn Glu Phe Lys Ile Gly Asn Arg Ser Val Gly Tyr

1 5 10 15

Asn His Glu Pro Leu Ile Ile Cys Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly

20 25 30

Ser Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Ala Glu Val Val Lys His Gln Thr His Ile Val Glu Asp Glu Met Ser

50 55 60

Asp Glu Ala Lys Gln Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr

65 70 75 80

Glu Ile Met Glu Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu

85 90 95

Lys Glu Tyr Val Glu Ser Lys Gly Met Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe

100 105 110

Ser Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Gln Arg Met Asp Ile Pro Ala Tyr

115 120 125

Lys Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Val

130 135 140

Ala Ser Phe Gly Lys Pro Ile Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile

145 150 155 160

Glu Ser Ile Lys Lys Ser Val Glu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Pro

165 170 175

Tyr Ala Leu Leu His Cys Thr Asn Ile Tyr Pro Thr Pro Tyr Glu Asp

180 185 190

Val Arg Leu Gly Gly Met Asn Asp Leu Ser Glu Ala Phe Pro Asp Ala

195 200 205

Ile Ile Gly Leu Ser Asp His Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Cys Leu Gly

210 215 220

Ala Val Ala Leu Gly Gly Ser Ile Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Arg

225 230 235 240

Met Asp Arg Pro Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asn Pro Asp Thr

245 250 255

Phe Lys Glu Leu Lys Gln Gly Ala His Ala Leu Lys Leu Ala Arg Gly

260 265 270

Gly Lys Lys Asp Thr Ile Ile Ala Gly Glu Lys Pro Thr Lys Asp Phe

275 280 285

Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Asp Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Leu

290 295 300

Leu Ser Gly Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Asn Gly Asp Phe

305 310 315 320

Ser Val Asn Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Gly Lys Val Ala Ala Cys Asn

325 330 335

Ile Arg Lys Gly Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ile Glu

340 345

<210> 6

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcatagacct gaaaaggtct ttttttgtac tcttaataat aaaaagaaga tgaaacttgt 60

ttaaggattg aacgtagtag ataataatat taaaactgag aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 7

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

attattctta acttttacga aactttgata taataacaaa cgtatatatt agtaatttac 60

ggcttatttt ccttgtgagc gtaaaaataa atgtgactat aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 8

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacaatgaa actttttttt ataaaaaacg actattttag gatttcattc ttgtattaaa 60

tagagttgta tttattggaa atttaactca taatgaaagt aatttaaagg aggtgataaa 120

a 121

<210> 9

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttttcttgac gcccttttga gggaggagta aaatgaaatt gtcaataaat cttaataaag 60

tgcttacaat tgaaagaagt gggggaagag attaaaggag gtgataaaa 109

<210> 10

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgccgcc gccggggctg 120

tttgcgttct tgccgtgatt tcgtgtacca ttggtttact tatttttttg ccaaggctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 11

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttttcgaatg attaaatttt ttgtttttta taaaggtttt ttactatttt gtgaacaatc 60

aaggtagaat caaattgcaa acagtggtaa aatatcgttg aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 12

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttgc ttaatcctac aattcttgat 60

ataatattct catagtttga aaaaggaggt gataaaa 97

<210> 13

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaacaaaatt cgacaaagtt cactgaattt tcacaaaaga tttatgtttc agcaggaatt 60

gtaaagggta aaagagaaat agatacatat ccttaataaa ggaggtgata aaa 113

<210> 14

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg ttgatataat ttaaatttta 60

tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat aaatgtagtg aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 15

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttga cactcttttg agaatatgtt atattatcag 60

aaaggaggtg ataaaa 76

<210> 16

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgaaaagaa ttttatgcat cacaggaaca cgcgcagatt ttggcaaact gaaaccgctg 60

cttgcgtata ttgaaaatca tccggatctg gaacttcatt taatcgttac aggaatgcat 120

atgatgaaaa catacggcag aacatacaaa gaagtgacac gcgaaaacta ccaacataca 180

tacctgtttt caaaccaaat tcagggcgaa ccgatgggag cagtgctggg caacacaatc 240

acatttatct ctagactttc agatgaaatc gaaccggata tggtcatgat ccatggagat 300

agacttgaag cattagcggg agcagcggtg ggcgcgttat caagccgcct ggtctgtcat 360

attgaaggcg gagaattaag cggcacagtc gatgattcta ttcgccattc aatcagcaaa 420

cttagccata tccatctggt tgctaacgaa caagccgtta caagacttgt gcagatggga 480

gaaaaacgca aacatatcca tattatcggc tcaccggatt tagatgtgat ggcttcttca 540

acactgccga gccttgaaga agtcaaagaa tattatggac tgccgtacga aaactacggc 600

atctcaatgt ttcatccggt tacaacagaa gctcatctta tgccgcaata tgctgcccag 660

tattttaaag ccctggaact ttcaggacag aacattatca gcatttatcc gaataacgat 720

acaggcacag aaagcatcct tcaagaactg ctgaaatacc agagcgataa atttatcgct 780

tttccgtcta tcagatttga atattttctg gttcttctga aacatgccaa atttatggtg 840

ggaaatagct ctgctggcat tcgcgaagcc ccgctgtatg gagtcccgag catcgatgtt 900

ggcacaagac aatctaatcg ccatatggga aaatcaatca tccatacaga ttacgaaaca 960

aaaaacattt ttgatgcaat ccaacaggcg tgctctctgg gcaaatttga agcagatgat 1020

acatttaacg gcggagatac aagaacatct acagaacgct ttgcagaagt cattaataac 1080

ccggaaacat ggaatgtttc agcgcagaaa agatttatcg atttaaacct gtaa 1134

<210> 17

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgtctctgc ttgcgcaact tgatcagaaa attgcagcga atggcggatt aatcgtttca 60

tgccaaccgg tgccggatag cccgctggat aaaccggaaa ttgtggctgc catggcgctt 120

gcagcggaac aagcaggagc ggtggctatt agaatcgaag gcgtcgctaa cttacaggcg 180

acacgcgctg ttgtgtctgt cccgattatc ggaatcgtta aaagagatct tgaagattca 240

ccggttcgca ttacagccta tatcgaagat gtggatgcct tagcacaagc gggagctgat 300

attatcgcta ttgatggcac agatagaccg cgcccggtcc cggttgaaac attactggcc 360

agaatccatc atcatggact tttagcaatg acagattgct caacaccgga agatggctta 420

gcctgtcaga aactgggcgc agaaattatc ggaacaacac tgagcggcta tacaacaccg 480

gaaacaccgg aagaaccgga tctggcgctt gtcaaaacac tttctgatgc gggatgcaga 540

gttattgctg aaggccgcta taatacaccg gcgcaagctg ccgatgctat gagacatgga 600

gcctgggcag tgacagtcgg cagcgcaatt acacgcttag aacatatctg tcagtggtat 660

aacacagcca tgaagaaagc agttctgtaa 690

<210> 18

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgagccata tcttcgacgc atctgtactg gctccacata ttcctagtaa ccttcctgat 60

aatttcaagg tgagaccact ggcaaaggat gatttttcga agggatatgt cgacctgctg 120

tcacaattga cgtcagttgg aaaccttgac caagaagcat ttgagaaacg atttgaggcg 180

atgagaacaa gcgtaccgaa ttatcacatc gtagtaattg aggattccaa cagccagaaa 240

gtggtggcgt ctgctagttt ggttgttgaa atgaaattca ttcatggggc cggatcaagg 300

ggtcgtgttg aagatgttgt cgtcgataca gaaatgcgcc ggcaaaaatt aggtgccgtg 360

cttttaaaaa ctttggtgtc acttggcaaa tctttaggcg tctacaaaat aagcctcgaa 420

tgcgtcccgg aattactccc gttctattcc caatttggct ttcaggatga ctgtaatttt 480

atgacccagc gcttttaa 498

<210> 19

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgggcaaaa acttacaagc tctggcccag ctttataaaa atgccctgct taacgatgtg 60

cttccgtttt gggaaaatca ttcattagat agcgaaggcg gatattttac atgcctggat 120

agacagggca aagtctacga tacagataaa tttatctggc ttcaaaaccg ccaggtttgg 180

acattttcta tgctttgtaa ccagctggaa aaaagagaaa actggctgaa aatcgctcgc 240

aatggagcca aatttctggc acaacatggc agagatgatg aaggaaactg gtattttgct 300

ttaacacgcg gcggagaacc gctggttcaa ccgtataata tttttagcga ttgctttgca 360

gcgatggcct tttctcagta tgcattagcg tcaggagaag aatgggcaaa agatgttgct 420

atgcaagcct ataataacgt gctgagacgc aaagataacc cgaaaggcaa atacacaaaa 480

acatatccgg gaacaagacc gatgaaagct ttagccgttc cgatgattct ggcgaacctg 540

acacttgaaa tggaatggtt actgccgcaa gaaacactgg aaaatgtgct tgctgccaca 600

gtccaggaag ttatgggcga ttttcttgat caagaacagg gattaatgta tgaaaacgtc 660

gctccggatg gctcacatat cgattgcttt gaaggacgcc tgattaatcc gggccatgga 720

atcgaagcga tgtggtttat tatggatatc gctagacgca aaaacgatag caaaacaatc 780

aaccaggcgg ttgatgttgt gttaaatatc ctgaactttg cttgggataa cgaatacggc 840

ggactttact actttatgga tgcagcgggc catccgccgc aacagctgga atgggatcaa 900

aaactttggt gggtgcatct tgaaagctta gtcgcactgg cgatgggcta tagattaaca 960

ggacgcgatg catgttgggc gtggtatcaa aaaatgcatg attattcttg gcagcatttt 1020

gcagatccgg aatatggcga atggtttgga tatcttaaca gacgcggcga agtgcttctg 1080

aacctgaaag gcggaaaatg gaaaggatgc tttcatgtcc cgagagccat gtatctgtgt 1140

tggcaacagt ttgaagcact ttcataa 1167

<210> 20

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgcaaaaca acaacgaatt taaaatcggc aacagatcag tcggatataa tcatgaaccg 60

cttattatct gcgaaattgg catcaaccat gaaggaagct taaaaacagc ctttgaaatg 120

gtcgatgcag cgtataatgc cggagcagaa gttgtgaaac atcaaacaca tatcgttgaa 180

gatgaaatgt ctgatgaagc caaacaggtg atcccgggca acgcagatgt ctcaatctac 240

gaaatcatgg aaagatgtgc gctgaacgaa gaagatgaaa tcaaactgaa agaatacgtt 300

gaaagcaaag gaatgatctt tatctctaca ccgttttcac gcgctgccgc acttagatta 360

cagcgcatgg atattccggc ctataaaatc ggctctggag aatgcaacaa ctacccgctg 420

atcaaactgg tggcaagctt tggcaaaccg atcatcctgt ctacaggaat gaactcaatc 480

gaaagcatca aaaaatcagt tgaaatcatc agagaagcgg gcgtgccgta tgctctgctt 540

cattgtacaa acatttatcc gacaccgtat gaagatgttc gcctgggcgg aatgaatgat 600

ctttcagaag cctttccgga tgcaattatc ggccttagcg atcatacatt agataactat 660

gcatgcctgg gagcggtggc tcttggcgga tctatcctgg aaagacattt tacagataga 720

atggatcgcc cgggcccgga tatcgtctgt tcaatgaatc cggatacatt taaagaactg 780

aaacaaggag cccatgcact gaaacttgcg agaggcggca agaaagatac aattatcgct 840

ggcgaaaaac cgacaaaaga ttttgcgttt gctagcgtcg ttgcggataa agatattaag 900

aaaggcgaac tgctgtctgg agataacctg tgggtcaaaa gaccgggcaa cggagatttt 960

agcgttaacg aatacgaaac actttttggc aaagtggcgg cttgcaatat ccgcaaagga 1020

gctcagatta agaaaacaga tatcgaataa 1050

<210> 21

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly

1 5 10 15

Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser

35 40 45

Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Ser Gln Leu Glu Met Thr Lys Lys Leu Glu Met Lys Tyr Asp Asp

65 70 75 80

Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe

85 90 95

Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys

100 105 110

Gln Lys Ile Trp Lys Ile Pro Ser Gly Glu Leu Leu Asn Leu Pro Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys

165 170 175

Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile

180 185 190

Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp

195 200 205

His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile

210 215 220

Thr Phe Ile Glu Lys His Phe Thr Leu Asp Lys Ser Met Ser Gly Pro

225 230 235 240

Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile

245 250 255

Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val

260 265 270

Thr Ala Ser Glu Arg Lys Asn Lys Ile Val Ala Arg Lys Ser Ile Ile

275 280 285

Ala Lys Thr Glu Ile Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Glu Lys Asn Ile

290 295 300

Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile

325 330 335

Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu

340 345

<210> 22

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atgtctaaca tctacatcgt ggcagaaatc ggctgcaatc ataacggatc agtcgatatc 60

gcgagagaaa tgattttaaa agctaaagaa gccggcgtga acgctgtcaa atttcaaaca 120

tttaaagccg ataaactgat cagcgcaatt gcgccgaaag cagaatacca aatcaaaaac 180

acaggagaat tagaatctca gctggaaatg acgaaaaaac tggaaatgaa atacgatgat 240

taccttcatc tgatggaata cgcagtcagc ctgaatcttg atgtttttag cacaccgttt 300

gatgaagatt ctattgattt tctggcgtca ctgaaacaaa aaatctggaa aattccgtca 360

ggcgaactgc ttaaccttcc gtacctggaa aaaatcgcta aacttccgat cccggataag 420

aaaattatca ttagcacagg catggccaca atcgatgaaa tcaaacagtc tgtctcaatc 480

tttatcaata acaaagtccc ggttggaaac atcacaatcc tgcattgtaa cacagaatat 540

ccgacaccgt ttgaagatgt taaccttaac gctatcaacg atctgaaaaa acattttccg 600

aaaaacaaca tcggcttttc tgatcattca agcggatttt atgcagcgat tgctgccgtt 660

ccgtatggca tcacatttat cgaaaaacat tttacactgg ataaaagcat gtctggaccg 720

gatcatcttg cttcaatcga accggatgaa ctgaaacatc tttgcattgg cgttagatgt 780

gtggaaaaat cactgggatc aaatagcaaa gttgtgacag ccagcgaaag aaaaaacaaa 840

atcgttgcac gcaaatctat catcgcgaaa acagaaatca aaaaaggaga agtgttttca 900

gagaaaaata tcacaacaaa aagaccgggc aacggaatta gcccgatgga atggtataat 960

ttactgggca aaatcgcgga acaagatttt atcccggatg aacttatcat ccatagcgaa 1020

tttaaaaacc agggagaata a 1041

<210> 23

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Met Thr Asn Pro Val Phe Glu Ile Ser Gly Arg Lys Val Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Leu Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly Ser

20 25 30

Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Ile Glu Gly Gly Ala

35 40 45

Glu Ile Ile Lys His Gln Thr His Val Ile Glu Asp Glu Met Ser Ser

50 55 60

Glu Ala Lys Lys Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr Glu

65 70 75 80

Ile Met Asp Arg Cys Ser Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu Lys

85 90 95

Lys Tyr Ile Glu Ser Lys Gly Ala Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe Ser

100 105 110

Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Glu Arg Met Gly Val Ser Ala Tyr Lys

115 120 125

Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Ala

130 135 140

Ser Tyr Gly Lys Pro Val Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Asp Ile Pro

145 150 155 160

Ser Ile Arg Lys Ser Val Glu Ile Phe Arg Lys Tyr Lys Thr Pro Leu

165 170 175

Cys Leu Leu His Thr Thr Asn Leu Tyr Pro Thr Pro Asp His Leu Ile

180 185 190

Arg Ile Gly Ala Met Glu Glu Met Gln Arg Glu Phe Ser Asp Val Val

195 200 205

Val Gly Leu Ser Asp His Ser Ile Asp Asn Leu Ala Cys Leu Gly Ala

210 215 220

Val Ala Ala Gly Ala Ser Val Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Asn Lys

225 230 235 240

Ala Arg Ser Gly Pro Asp Ile Cys Cys Ser Met Asp Gly Ala Glu Cys

245 250 255

Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ser Lys Arg Met Ala Gln Met Arg Gly Gly

260 265 270

Ser Lys Gly Ala Val Lys Glu Glu Gln Val Thr Ile Asp Phe Ala Tyr

275 280 285

Ala Ser Val Val Thr Ile Lys Glu Ile Lys Ala Gly Glu Ala Phe Thr

290 295 300

Lys Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Thr Gly Asp Phe Leu Ala

305 310 315 320

Asp Asp Tyr Glu Met Leu Leu Gly Lys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp

325 330 335

Phe Asp Val Gln Leu Lys Lys Glu Phe Ile Lys

340 345

<210> 24

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atgacaaatc cggtctttga aatttctggc agaaaagttg gacttgatta tgccccgtta 60

gtgatcgcag aaattggcat caaccatgaa ggatcactga aaacagcctt tgaaatggtg 120

gatgcagcga ttgaaggcgg agcagaaatc atcaaacatc aaacacatgt cattgaagat 180

gaaatgtcaa gcgaagcaaa gaaagttatc ccgggcaatg ctgatgtgag catctacgaa 240

atcatggata gatgctctct gaacgaagaa gatgaaatca aactgaaaaa atacatcgaa 300

tcaaaaggcg ctatctttat ctcaacaccg tttagccgcg ctgccgcact gagacttgaa 360

cgcatgggag ttagcgccta taaaattggc tctggagaat gcaataacta tccgctgctt 420

gatcttattg cgtcttatgg caaaccggtc atcttatcaa caggaatgaa tgatattccg 480

tctatcagaa aatcagttga aatctttcgc aaatacaaaa caccgctttg tttactgcat 540

acaacaaacc tgtatccgac accggatcat cttattagaa tcggcgcaat ggaagaaatg 600

caacgcgaat ttagcgatgt tgtggtcgga ctgagcgatc attctatcga taacctggct 660

tgtctgggag ctgtggctgc tggagcttct gtcctggaaa gacattttac agataacaaa 720

gctcgctcag gcccggatat ttgctgtagc atggatggag cggaatgtgc tgaacttatc 780

tctcaatcaa aaagaatggc ccagatgcgc ggcggatcaa aaggcgcagt caaagaagaa 840

caggttacaa ttgattttgc ctatgcaagc gttgtgacaa ttaaagaaat caaagccgga 900

gaagcattta caaaagataa tctgtgggtt aaacgcccgg gcacaggaga ttttcttgcg 960

gatgattatg aaatgctttt aggcaagaaa gcaagccaaa acattgattt tgatgtgcag 1020

ctgaagaaag aatttatcaa ataa 1044

Claims (10)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以多个启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6～15。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQ ID NO.6～8任一所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，或以SEQ ID NO.11～15任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，或以SEQ ID NO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，或以SEQ ID NO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，或以SEQ ID NO.6～8、12～14任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶的表达。

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQ ID NO.6所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，并以SEQ ID NO.15所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并以SEQ ID NO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQ ID NO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并以SEQ ID NO.6所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌BSGN6-comK为出发菌株。

5.一种提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量的方法，其特征在于，向枯草芽孢杆菌中引入脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以不同强度的启动子分别调控以UDP-N-乙酰葡萄糖、葡萄糖胺-6-磷酸、6-磷酸-N-乙酰甘露糖苷为前体合成N-乙酰神经氨酸的途径；所述启动子含有SEQ ID NO.6～15任一所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，参与N-乙酰神经氨酸合成途径的酶包括：UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。

7.一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌在30～37℃培养16～72h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得种子液，再以1～10％的接种量转接至发酵培养基中发酵。

9.权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备含N-乙酰神经氨酸或其衍生产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦或奥司他韦。

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